Mục tiêu của luận án là tuyển chọn được chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ Hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện, tinh sạch được protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi khuẩn phục vụ nghiên cứu chuyên sâu. Và sản xuất được chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ bã thải nhà máy bia.
Trang 1VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Trang 2Công trình đƣợc hoàn thành tại:
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Thƣ viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn có khả năng sinh sản ra các protein tinh
thể độc có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con người và môi trường sinh thái và sinh vật có ích Trong nhiều năm
qua, thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã được nghiên
cứu và ứng dụng để diệt trừ côn trùng có hại đối với cây trồng cũng như bảo vệ
sức khỏe cộng đồng Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis
càng được sử dụng một cách rộng rãi bởi nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch ngày càng cao
Côn trùng bộ hai cánh là một trong những bộ lớn trong lớp côn trùng với
số lượng và thành phần đa dạng Côn trùng thuộc bộ hai cánh rất đa dạng về mặt sinh thái học và chủ yếu là các tác nhân gây hại trong nông nghiệp (ruồi đục quả) hay cho con người như ruồi, muỗi Chúng là tác nhân trung gian chủ yếu truyền bệnh giữa người với người hay giữa động vật và người Các bệnh do
muỗi truyền có thể gây tử vong cao như Anopheles gambiae là trung gian truyền bệnh sốt rét cho người Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết Culex
tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bản còn ruồi là tác nhân truyền
khoảng 100 bệnh nhưng chủ yếu là các bệnh nguy hiểm như: bại liệt, bệnh đau
mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae, lỵ, tả, thương hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus)
Ngày nay, có nhiều phương pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau
mà con người áp dụng Biện pháp diệt được sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt ruồi, muỗi Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thường có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trường
và ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh
Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của
các chủng Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm
ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh
Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus thuringiensis phục vụ tạo chế
phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)”
Trang 42 Mục tiêu nghiên cứu
2.1 Mục tiêu chung
Tuyển chọn được chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả nãng sinh
protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ Hai cánh (Diptera) cao Biểu hiện, tinh sạch được protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi
khuẩn phục vụ nghiên cứu chuyên sâu Và sản xuất được chế phẩm sinh học
Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ
bã thải nhà máy bia
2.2 Mục tiêu cụ thể
- Sàng lọc và thu nhận được chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, lá tại một số tỉnh của Việt nam có khả năng sinh gen cry2A mã hóa
protein tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh và xác định được trình tự
nucleotide của gen cry2A này
- Biểu hiện và tinh sạch được protein tái tổ hợp (rCry2A) trong E.coli BL
21 (DE3)
- Tìm ra được phương pháp xử lý bã malt bia làm môi trường nuôi cấy vi
khuẩn B thuringiensis và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B thuringiensis khi sử dụng bã malt
bia làm môi trường nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm Đồng thời đánh giá
được sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm BT từ vi khuẩn B
thuringiensis
3 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus
thuringiensis (Bt) có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh
- Nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự được gen cry2 của các chủng Bt phân lập từ đất, lá có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của chủng vi khuẩn B
thuringiensis tuyển chọn
- Nghiên biểu hiện gen mã hóa protein Cry2 diệt côn trùng bộ hai cánh
của chủng vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn
- Nghiên cứu các phương pháp xử lý bã malt bia làm môi trườngnuôi cấy
vi khuẩn B thuringiensis Hoàn thiện môi trường lên men vi khuẩn B
thuringiensis từ bã malt bia
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp
protein tinh thể của vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn khi sử dụng bã malt bia
làm môi trườngnuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm
- Lên men sản xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng bộ hai cánh từ vi
khuẩn B thuringiensis tuyển chọn và đánh giá sư bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ
hai cánh của chế phẩm trong phòng thí nghiệm và ngoài thực địa
Trang 54 Những đóng góp mới của luận án
- Phân lập và tuyển chọn được 7 chủng vi khuẩn B Thuringiensis mang gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh cao
- Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ
thống về gen cry2A từ chủng vi khuẩn B thuringiensis serovar kurstaki MSS
8.4 của Việt Nam có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh phục vụ cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học
- Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen cry2A của các chủng B
thuringiensis Việt Nam phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng về sau
- Sử dụng bã malt bia là một chất thải của ngành sản xuất đồ uống làm nguồn nguyên liệu cung cấp các chất dinh dưỡng (các bon, nitơ, chất khoáng…)
cho sự sinh trưởng của vi khuẩn B thuringiensis và được sử dụng như một
nguyên liệu thay thế cho các hợp chất hữu cơ tổng hợp đắt tiền để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT
mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt được một số côn trùng bộ hai cánh như ruồi nhà là một bước đi mới để mở ra khả năng tạo ra được các chế phẩm sinh học diệt các côn trùng này
5.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án góp phần khai thác có hiệu quả nguồn gen của vi sinh
vật nói chung và gen cry2A của vi khuẩn Bacillus thuringiensis nói riêng để góp
phần tạo ra các chế phẩm sinh học diệt một số côn trùng bộ hai cánh Mặt khác sử dụng bã malt bia - một loại chất thải của ngành sản xuất công nghiệp được xử
lý thành nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất khác chế phẩm BT là rất cần thiết Đây là một hướng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị của bã malt bia, tạo ra sản phẩm thân thiện môi trường phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững
6 CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN
Luận án dày 149 trang (không kể phần Tài liệu tham khảo và Phụ lục) đánh máy vi tính khổ A4 với 23 bảng, 43 hình Luận án gồm 5 phần: Mở đầu (04 trang); Tổng quan tài liệu (40 trang); Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (60 trang); Kết luận và kiến nghị (02 trang) Đã tham khảo 146 tài liệu tham khảo bao gồm 20 tài liệu tiếng Việt và 126 tài liệu tiếng Anh
Trang 6CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
Luận án đã tham khảo và tóm lược các tài liệu tiếng Anh và tiếng Việt,
với 6 nội dung liên quan gồm: Vi khuẩn Bacillus thuringiensis; Gen cry2; Hệ biểu hiện E coli; Côn trùng thử nghiệm; Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus
thuringiensis; Tổng quan về bã Malt bia;
Trong đó, Bacillus thuringiensis (B thuringiensis) là vi khuẩn đất, gram dương Trong quá trình sinh trưởng và phát triển B thuringiensis có khả năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (crystal δ-endotoxin), Cyt (cytolysin) và Vip (vegetative insecticidal protein) Các gen cry2 mã hóa protein tinh thể khoảng 65 – 71 kDa, được sản sinh bởi một số phân loài của B
thuringiensisnhư: kurstaki (HD-1, HD-263, NRD-12 và 14 dòng khác), thurigiensis, tolwwarthi, israelensis, kenyae… (Dwu và cộng sự, 1991; Ohba và
Aizawa, 1986; Yamamoto, 1983) Cho đến nay, hơn 80 gen cry2 đã được phát
hiện (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/B
thuringiensis/toxins2.html)
Ruồi và muỗi là loài động vật chân khớp ký sinh, thuộc lớp Côn trùng (Insecta), bộ Hai cánh (Diptera) Chúng là tác nhân trung gian truyền nhiều bệnh nguy hiểm giữa người với người hay giữa động vật và người Thêm nữa, điều kiện thời tiết, khí hậu ở Việt Nam rất thuận lợi cho sự phát triển của chúng
Có nhiều phương pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau mà con người áp dụng Biện pháp diệt được sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt ruồi, muỗi Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thường có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh
Những điểm chính này đã được trình bày trong Chương 1 Qua đó, có thể thấy việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của
các chủng B thuringiensis phân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra
những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu đất, lá dùng để phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis được
lấy từ các vùng Điện Biên, Hà Nội, Nghệ An, Nha Trang (Khánh Hòa), Lâm Đồng, TP Hồ Chí Minh, Kiên Giang
Bã malt bia được lấy từ nhà máy bia Sài Gòn- Hà Nội thuộc khu công nghiệp vừa và nhỏ quận Bắc Từ Liêm
Trang 7Ấu trùng ruồi nhà tuổi 2; ruồi đục quả được nhận từ bộ môn Côn
trùng-Viện Bảo vệ thực vật Ấu trùng muỗi Anopheles minimus, Aedes aegypti, Culex
quinquefasciatus do Viện sốt rét ký sinh trùng Trung ương cung cấp
Chủng vi khuẩn E coli DH5α dùng cho tách dòng gen và chủng vi khuẩn
E.coli BL21 dùng để biểu hiện gen của hãng Invitrogen
Chủng B.thuringiensis 4D4 có nguồn gốc từ Bộ sưu tập Bacillus
thuringiensis của đại học Colombus, bang Ohio, Hoa Kỳ
Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A
Vị trí nhận biết
Kích thước (bp)
Cry2AaF TAAGGATCCGATGAATAATGTATTGAATAGTGGAAGA BamHI 1902 Cry2AaR ATTCTCGAGATAAAGTGGTGGAAGATTAGTTGG XhoI
Hệ vector
Vector pET22b (+) của hãng Novagen, vector pGEM-T được đóng gói kèm trong bộ kit pGEM®-T Easy Vector Systems của hãng Promega, TA Cloning® Kit with pCR™2.1 vector (Thermosciencetific)
2.2 Địa điểm và thời gian thực tập
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, phòng Vi sinh môi trường- Viện Công nghệ Môi trường, Bộ môn Côn trùng – Viện Bảo vệ thực vật, Phòng thí nghiệm của Khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường-Trường Đại học Phương Đông
Thời gian thực hiện thí nghiệm từ tháng 6/2012-T12/2016
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp vi sinh
Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Vi khuẩn B thuringiensis được phân lập các mẫu đất, mẫu lá thu thập
được theo phương pháp của Thiery và Frachon (1997)
Phân loại vi khuẩn B thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch
2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Định lượng mật độ bào tử, tinh thể
Chủng B thuringiensis phân lập được được đem cấy thảm trên đ a peptri
chứa môi trường MPA Số lượng bào tử được tính theo công thức (Ohba và cộng sự, 1986)
Xác định LC50 đối với côn trùng thử nghiệm
Thử nghiệm khả năng diệt ấu trùng bộ Hai cánh trên đối tượng ấu trùng
ruồi nhà Musca domestica, ấu trùng ruồi đục quả tuổi hai, ấu trùng muỗi theo
phương pháp của Thiery và Frachon ở hai nồng độ là 107
và 109 bào tử/ml với
Trang 8ruồi nhà, ruồi đục quả và 108
và 106 bào tử/ml với muỗi Mỗi nồng độ được thử nghiệm với 3 cốc nhựa (mỗi cốc 10 ấu trùng)
Tỉ lệ ấu trùng chết được tính theo công thức Abbott (Abbott, 1925)
2.3.3 Phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
DNA plasmid của vi khuẩn được tách chiết và tinh sạch Y bằng kit Gen
JETTM Plasmid Miniprep (Fermentas)
Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A
Sinh tổng hợp DNA được tiến hành bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) (Sambrook, 2001)
Phương pháp tách dòng gen cry2
Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn Ghép nối DNA bằng T4 DNA ligase
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli DH5α
Phương pháp điện di trên gel agarose
DNA được phát hiện và định lượng tương đối bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose theo phương pháp của Sambrook & Russel, 2001
Tinh sạch DNA từ gel agarose
Sản phẩm DNA được tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kít GenJETTM
Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất
Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng
Trình tự DNA được xác định theo phương pháp của Sanger và cộng sự Mẫu DNA được gửi đọc trình tự tại hãng Microgen, Hàn Quốc sử dụng cặp mồi M13 Xử lý kết quả đọc trình tự bằng phần mềm Bioedit, so sánh trình tự gen
đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế tại địa chỉ online: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Thiết kế vector biểu hiện
Sử dụng vector pET22 b(+) làm vector biểu hiện Gen cry2A được đưa vào vector pET 22b(+) tại vị trí BamHI và XhoI Trình tự amino acid của protein tái tổ hợp gồm toàn bộ trình tự amino acid của gen cry2A tự nhiên thêm
6amino acid Histidine ở đầu C và 36 amino acid đầu N
Phương pháp biểu hiện gen
Cấy hoạt hoá 1 khuẩn lạc trong môi trường LB có bổ sung ampicilin với nồng độ cuối là 50 g/ ml, nuôi lắc ở 370C qua đêm Sau đó cấy chuyển 1% vào
20 ml môi trường MPB có bổ sung kháng sinh ampicilin nồng độ là 50 g/ ml
và nuôi lắc ở 370C để OD đạt 0,5-0,8 Cảm ứng IPTG (100 mM) đạt 1mM, nuôi
Trang 9Phương pháp Western blot
Mẫu protein sau khi kiểm tra bằng SDS-PAGE trên gel acryamide 12% sẽ được chuyển lên màng PVDF Mẫu protein sẽ được ủ với kháng thể đặc hiệu và kháng thể phát hiện Sau đó phát hiện bằng dung dịch chứa cơ chất cho peroxidase (Sigma)
Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp
Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột sắc ký Ni2+
agarose theo quy trình hướng dẫn của hãng Invitrogen
2.3.4 Tối ưu hóa môi trường lên men theo phương pháp đáp ứng bề mặt
Chuẩn bị dịch giống
Khuẩn lạc được nuôi trên môi trường MTCS vô trùng Nuôi lắc ở 30oC,
200 vòng/phút, thời gian nhân giống 8-10 giờ Dịch nuôi cấy (chứa các tế bào đang ở giai đoạn sinh trưởng) được sử dụng để làm giống cho các thí nghiệm tiếp theo (Adjiable và cộng sự, 2009; Yezza và cộng sự, 2006)
Phương pháp lên men vi sinh vật
Lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong bình tam giác
Lên men trong bình tam giác 500 ml ở nhiệt độ 30±0,1oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thời gian nuôi 48h (Yezza và cộng sự, 2006)
Lên men trong thiết bị lên men 10 lít
Đưa 10 lít môi trường vào bình lên men, khử trùng ở 121oC, 1 at, trong vòng 30 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng, lắp bình lên men vào thiết bị lên men Cài đặt các thông số lên men: nhiệt độ 30±0, 1oC, pH7±0,1, tốc độ khuấy
300 vòng/phút, DO>25 mg/l, tốc độ thổi khí 2-4 lít/phút (Lương Đức Phẩm, 2008; Avigone và cộng sự, 1992)
Thủy phân bã bia
Bã bia sau khi lấy về phòng thí nghiệm được xay nhỏ và xử lý làm nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp nhiệt phân kết hợp thay đổi
pH (Nguyễn Thị Vân Trang và cộng sự, 2012; Valo và cộng sự, 2004)
Bố trí thí nghiệm
Dịch thủy phân bã bia sau xử lý được đưa đi phân tích thành phần hóa học theo các phương pháp tiêu chuẩn Trong đó TOC được xác định bằng phương pháp SMEWW 5310B-2005; TN, TP được xác định bằng phương pháp EPA-352.1 và EPA-365.2, thành phần kim loại được xác định theo phương pháp SMEWW 3125-2005 (Adjiable và cộng sự, 2009)
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất rắn lên quá trình sinh trưởng
và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4
Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia
Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng
và sinh protein tinh thể
Trang 10Tối ưu hóa thành phần môi trường bằng phương pháp đáp ứng bề mặt Tối ưu hóa thành phần môi trường bằng phương pháp đáp ứng bề mặt
Tối ưu thành phần môi trường theo phương pháp đáp ứng bề mặt được
mô tả được thực hiện theo phương pháp của Rajesh và cộng sự (2012) Sau khi xác định được khoảng tác động của từng yếu tố đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protein của MSS8.4, nhập dữ liệu vào phần mềm Design expert 10.1
Xử lý số liệu
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ
các chủng Bacillus thuringiensis
3.1.1 Phân lập các chủng Bacillus
Để phân lập và tuyển chọn được chủng B thuringiensis có hoạt tính diệt
côn trùng bộ 2 cánh (Diptera), 317 mẫu đất, lá đã được thu thập tại 7 tỉnh thành
từ 7 vùng địa lý của Việt Nam Các địa điểm này trước đó chưa từng sử dụng các chế phẩm sinh học
Trong 317 mẫu đất, lá thí nghiệm có 198 mẫu mang vi khuẩn Bacillus và
119 mẫu không phân lập được B thuringiensis Như vậy tần suất xuất hiện của
Bacillus là 62,4% Những khu vực có tỉ lệ Bacillus cao trong mẫu: Kiên Giang
(75,0%), Điện Biên (72,8%) và Hà Nội (72,8%); thấp nhất là Nghệ An (33,3%)
Trong số 1.020 khuẩn lạc với các đặc điểm thuộc chi Bacillus, có 440 khuẩn lạc thuộc nhóm B thuringiensis dựa trên khả năng hình thành tinh thể
(chiếm 43%) Tỉ lệ này phụ thuộc vào số mẫu lấy được ở các tỉnh, cao nhất ở các mẫu được thu thập ở Hà Nội (54%) và thành phố Hồ Chí Minh (53%), thấp nhất ở mẫu thu thập ở Lâm Đồng (25%), các tỉnh Điện Biên và Kiên Giang cho
tỉ lệ tương đương nhau (42% và 44%)
Các mẫu đất được thu thập tại 7 vùng địa lý của Việt Nam có tần suất Bt
cao hơn so với những công bố trước đây (Martin và Travers, 1989; Binh và cộng
sự, 2005) Tần suất Bt trong nghiên cứu này là 62,4% điều này hoàn toàn phù
hợp với các công bố trước đây của Martin và Travers (1989), trong mẫu đất của New Zealand (Chilcott và Wigley, 1993), trong mẫu đất của Hàn Quốc ( Lee và cộng sự, 1995) và trong mẫu đất của nhật Bản (Ohba và Aizawa, 1986)
Sự xuất hiện của Bt hầu như khắp nơi trong môi trường sống, bao gồm: đất
nông nghiệp, đất rừng, đất đô thị, đất ngập mặn, thậm chí cả sa mạc (Dulmage và Aizawa,1982; Martin và Travers, 1989; Zhang và cộng sự, 2000; Uribe và cộng
sự, 2003) Trong nghiên cứu này, sự xuất hiện của Bt tập trung chủ yếu ở Hà Nội
thuộc đất thành thị và có mật độ dân số cao Kết quả này cao hơn nhiều so với nghiên cứu của Quesada-Moraga (Quesada-Moraga và cộng sự, 2004), phù hợp
với kết quả của Ayyasamy (2012) Theo Ayyasamy, tỉ lệ Bt ở đất thành thị là
80%, tuy nhiên tần suất xuất hiện cao nhất ở đất nông nghiệp (Ayyasamy và
Trang 11cộng sự, 2012)
Như vậy, so với số liệu công bố của các tác giả trên thì tần suất xuất hiện
Bt và chỉ số Bt mà đề tài phân lập được là khá cao Chứng tỏ số lượng vi khuẩn
Bt ở Việt Nam rất phong phú, có thể cung cấp nhiều nguồn gen quý
3.1.2 Nghiên cứu protein tinh thể
440 chủng B thuringiensis đã phân lập thuộc 7 vùng địa lý của Việt Nam,
được tiến hành nuôi cấy trên môi trường MPA Sau 3 ngày quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm bằng thuốc nhuộm fushin để xác định hình dạng tinh thể của các chủng vi khuẩn
Kết quả thu được cho thấy tất cả các chủng phân lập có khả năng sinh tinh thể ở tất cả các hình dạng Có những chủng có khả năng sinh từ 1-3 loại tinh thể Cụ thể, 186/440 chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm 42,2%; 193/440 chủng sinh tinh thể hình cầu chiếm 43,8%; 46/440 chủng sinh tinh thể hình lập phương chiếm 10,5%; 15/440 chủng sinh tinh thể hình không xác định chiếm 3,5%
Nghiên cứu về hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập tại tỉnh
Thành Đô - Trung Quốc có dạng hình tháp lưỡng cực và hình cầu, chiếm tới 91,8% (Yu và cộng sự, 2015) Tuy nhiên, phần lớn cấu trúc tinh thể của các
chủng Bt thu thập tại bang Tamil Nadu - Ấn Độ có dạng hình lập phương
(26,9%) và hình tháp lưỡng cực (21,2%) (Ramalakshmi và Udayasuriyan,
2010) Kết quả quan sát hình dạng tinh thể của các chủng Bt thu thập ở Saudi
Arabia kết luận, cấu trúc tinh thể dạng cầu chiếm tỉ lệ lớn (54%), sau đến là dạng không định hình (27%) và tháp lưỡng cực (16%) (El-kresh và cộng sự, 2014) Sự đa dạng và khác biệt về hình dạng tinh thể của các chủng phân lập được trong nghiên cứu này cũng như trong các nghiên cứu khác có thể do sự
khác nhau về đặc điểm sinh học của các chủng Bt cũng như đặc điểm protein
Cry của các chủng thu thập được
Theo các tài liệu công bố trên thế giới, các chủng mang Gen cry2A rất đa dạng chúng có thể sinh ra từ các dưới loài Bt serovar kurstaki, Bt serovar sotto,
Bt.serovar israelensis, Bt.serovar kenyae có hình dạng tinh thể chủ yếu là hình
cầu và hình lưỡng tháp Vì vậy, các chủng có khả năng sinh ra tinh thể hình cầu
và hình lưỡng tháp được lựa chọn để nghiên cứu phân loại và sàng lọc gen
cry2A bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch
Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis b ng kit huyết thanh miễn
dịch
Thông qua phản ứng ngưng kết với các typ huyết thanh, xác định được 32
chủng Bt (chiếm 71%), trong đó có 5 chủng thuộc dưới loài Bt serovar
kurstaki, 2 chủng Bt serovar israelensis (Bảng 3.1)
Bảng 3.1 Kết quả phân loại dưới loài các chủng Bacillus thuringiensis b ng
phương pháp huyết thanh
Trang 12T
Dưới loài Bacillus thuringiensis Typ
huyết thanh
Số chủng ngưng kết
Tỷ lệ (%)
yunnanensis
20a, 20b 1 3,13
oswaldocruzi
Nghiên cứu của Martinez và cộng sự (2005) cho thấy, gen cry2 xuất hiện
ở tất cả các chủng B thuringiensisserovar kurstaki Ngoài ra, chủng B
thuringiensisserovar israelensis cũng được tìm thấy phổ biến ở các môi trường
sống của muỗi (Martinez và Caballero, 2002) Do đó, các chủng thuộc nhóm này sẽ được đề tài lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo
3.1.3.Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập
Để thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) của các chủng Bt thuộc dưới loài B thuringiensis serovar kurstaki và B thuringiensis serovar
israelensis pha loãng nồng độ bào tử đến mức 109 bào tử/ml và thử nghiệm với
ấu trùng ruồi nhà tuổi hai, ấu trùng muỗi và ấu trùng ruồi đục quả
Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ 2 cánh của các chủng Bt
sau 3 và 5 ngày thử nghiệm
Thử nghiệm với
ấu trùng ruồi đục quả
Tỉ lệ chết sau
3 ngày
Tỉ lệ chết sau
5 ngày
Tỉ lệ chết sau
3 ngày
Tỉ lệ chết sau
5 ngày
Tỉ lệ chết sau
5 ngày
Tỉ lệ chết sau
7 ngày
Trang 13(%) (%) (%) (%) (%) (%)
LD 2.21 66,67 90,33 83,33 100 - -
LNT 7.12 66,67 96,67 83,33 100 16,67 33,33
LNT 16.6 73,33 83,33 86,67 100 13,33 16,67 MSS 1.1 50 100 66,67 83,33 3,33 10
- Kết quả thử ấu trùng cho ta thấy, các chủng B thuringiensis được tuyển
chọn có khả năng diệt ấu trùng khá cao T lệ ấu trùng chết tăng dần theo thời gian thí nghiệm nồng độ 109 bào tử/ml các chủng được lựa chọn có t lệ ấu trùng chết đạt 76,67 - 100 % sau 5 ngày Tuy nhiên, khả năng diệt ấu trùng ruồi đục quả là tương đối thấp, chỉ đạt 0 – 33,33% sau 7 ngày thử nghiệm
-
3.2 Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng
bộ hai cánh ở các chủng phân lập
3.2.1 Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại
huyết thanh b ng phương pháp PCR
Kết quả phát hiện gen cry2A bằng phương pháp PCR cho thấy, 7 chủng thuộc 2 dưới loài B thuringiensis serovar kurstaki và B thuringiensis serovar
israelensis đều cho sản phẩm PCR có 1 băng với kích thước khoảng 1,9 kb
3.2.2 Tách d ng và đọc trình tự gen cry2A
Gen cry2A từ hai chủng có hoạt tính diệt ruồi cao nhất được khuếch đại
và gắn vào vector tách dòng pCR2.1, biến nạp vào tế bào E Coli DH5α
Sau 14 - 16 giờ cấy trải lên môi trường chọn lọc LB, Ampicilin 50 g/ml,
ở 37oC, tiến hành sàng lọc sơ bộ bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc Từ 4 dòng tế bào mang gen của mỗi chủng sàng lọc bằng cặp mồi đặc hiệu, đều thu được đoạn kích thước đúng như tính toán (khoảng 1,9 kb)
Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid của 3 dòng tế bào cũng cho 1 băng có kích thước 3,9 kb và 1 băng có kích thước 1,9 kb, đúng như kích thước tính toán Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,9 kb đã được tách dòng thành công
DNA plasmid của các dòng được gửi đi đọc trình tự gen bằng máy đọc trình
tự tự động (Macrogen, Hàn Quốc) sử dụng cặp mồi đặc hiệu Trình tự nucleotide sau khi đọc trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit ver 7.0.9 Các trình tự
DNA này sau đó được so sánh và xác định mối quan hệ với các trình tự gen cry2A
khác trên Ngân hàng Gen Quốc tế
Kết quả xây dựng cây phả hệ cho thấy trình tự thu được mã hoá cho gene
Trang 14thuộc nhóm cry2A, phân nhóm cry2Aa Nhóm độc tố cry2Aa và cry4 đã được
chứng minh có khả năng gây độc lên côn trùng thuộc bộ 2 cánh (Bravo, 1997)
Trình tự DNA của của các gen cry2Aa này được căn đa chuỗi so sánh với các trình tự gen thuộc phân nhóm cry2Aa trên Ngân hàng Gen Quốc tế Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 có chiều dài 1902 bp và có
độ tương đồng là 99% với trình tự tương ứng đã công bố trước đây trên ngân hàng genvới 6 điểm sai khác: 305 (G-A), 500 (G-A), 783 (T-G), 1054 (T-G),
1303 (G-A), 1575 (C-T), chủng LNT7.12 có độ tương đồng 100% với chủng
công bố.Trình tự nucleotide của gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 được đưa lên
Genbank với mã số là KM588296.1
So sánh trình tự amino axit (aa) suy diễn của 2 gen trên bằng công cụ so sánh BLAST trên NCBI cho thấy,trình tự axit amin của chủng LNT7.12 có độ tương đồng hoàn toàn với chủng công bố, chủng MSS8.4 có độ tương đồng
99% với các trình tự axit amin của Cry2A từ Bt với 5 vị trí sai khác (102 (S-N),
167 (R-Q), 261 (F-L), 352 (W-G), 435 (D-N)), đột biến nu ở vị trí 1575 (C-T)
không làm thay thế axit amin Điều này chứng tỏ rằng 2 gen cry được nhân
dòng từ 2 chủng vi khuẩn MSS8.4 và LNT7.12 đều là gen mã hóa cho độc tố Cry2A, phân nhóm Cry2Aa
Cấu trúc của độc tố Cry2A từ chủng MSS8.4 được so sánh với những
trình tự của Cry2Aa từ những chủng B thuringiensis đã biết trước đó cho thấy,
có độ tương đồng cao (99%) so với Cry2Aa từ chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki (Pdb_id 1: 1I5P_A) được Morse và cộng sự xác định bằng sự
nhiễu xạ tia X (Morse, 2001) Cry2Aa từ MSS8.4 được chia làm 3 vùng cấu trúc: Endotoxin đầu N gồm 210 a.a (Val-53 đến Lys-263); tiếp theo là Endotoxin vùng giữa gồm 205 a.a (Leu-267 đến Asn-472); cuối cùng là vùng Endotoxin đầu C gồm 224 a.a (Từ Phe-494 đến Asn-628) Kết quả này một lần nữa khẳng định gen tách dòng là gen mã hóa cho protein độc tố Cry2A, phân nhóm Cry2Aa
3.2.3 Biểu hiện gen
3.2.3.1 Tạo chủng tái tổ hợp mang gen cry2A trong vi khuẩn E coli BL21 (DE3)
Để khẳng định xem khả năng diệt côn trùng có phải được quy định bởi
gen cry2A hay không, gen cry2A từ chủng MSS8.4 tiếp tục được sử dụng để
biểu hiện ra protein độc tố Cry2A và kiểm tra khả năng diệt côn trùng của protein tái tổ hợp
5 khuẩn lạc ngẫu nhiên được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu Kết quả cho thấy 4 dòng xuất hiện băng DNA
có kích thước khoảng 1,9 kb
Kết quả kiểm tra bằng phản ứng cắt mở vòng với 2 enzym BamHI và
XhoI cũng thể hiện đã tạo thành công chủng E coli tái tổ hợp mang gen cry2A