Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn bacillus thuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (diptera) (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THÙY DƢƠNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH (DIPTERA) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Hà Nội – 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: Thầy hƣớng dẫn 1: PGS.TS Ngô Đình Bính Thầy hƣớng dẫn 2: TS Lê Đức Khánh Phản biện 1: …………………………… Phản biện 2:…………………………… Phản biện 3:…………………………… Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nƣớc họp tại: …………………………………………………………………… …………………………………………………………………… Vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bacillus thuringiensis vi khuẩn có khả sinh sản protein tinh thể độc có khả diệt côn trùng thuộc khác mà không gây độc hại cho ngƣời môi trƣờng sinh thái sinh vật có ích Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đƣợc nghiên cứu ứng dụng để diệt trừ côn trùng có hại trồng nhƣ bảo vệ sức khỏe cộng đồng Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đƣợc sử dụng cách rộng rãi nhu cầu sử dụng sản phẩm nông nghiệp ngày cao Côn trùng hai cánh lớn lớp côn trùng với số lƣợng thành phần đa dạng Côn trùng thuộc hai cánh đa dạng mặt sinh thái học chủ yếu tác nhân gây hại nông nghiệp (ruồi đục quả) hay cho ngƣời nhƣ ruồi, muỗi Chúng tác nhân trung gian chủ yếu truyền bệnh ngƣời với ngƣời hay động vật ngƣời Các bệnh muỗi truyền gây tử vong cao nhƣ Anopheles gambiae trung gian truyền bệnh sốt rét cho ngƣời Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết Culex tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bản ruồi tác nhân truyền khoảng 100 bệnh nhƣng chủ yếu bệnh nguy hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui Rickettsiae, lỵ, tả, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) tụ cầu vàng (Staphyloccocus) Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt trùng hai cánh khác mà ngƣời áp dụng Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến dùng loại thuốc diệt ruồi, muỗi Tuy nhiên, loại thuốc thƣờng có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng số côn trùng hai cánh chủng Bacillus thuringiensis phân lập Việt Nam cần thiết nhằm tìm chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng số côn trùng hai cánh Xuất phát từ thực tiễn tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus thuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng hai cánh (Diptera)” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis địa có khả nãng sinh protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc Hai cánh (Diptera) cao Biểu hiện, tinh đƣợc protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng hai cánh vi khuẩn phục vụ nghiên cứu chuyên sâu Và sản xuất đƣợc chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ bã thải nhà máy bia 2.2 Mục tiêu cụ thể - Sàng lọc thu nhận đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ mẫu đất, số tỉnh Việt nam có khả sinh gen cry2A mã hóa protein tinh thể độc diệt trùng hai cánh xác định đƣợc trình tự nucleotide gen cry2A - Biểu tinh đƣợc protein tái tổ hợp (rCry2A) E.coli BL 21 (DE3) - Tìm đƣợc phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn B thuringiensis nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng sinh tổng hợp protein tinh thể vi khuẩn B thuringiensis sử dụng bã malt bia làm môi trƣờng ni cấy quy mơ phòng thí nghiệm Đồng thời đánh giá đƣợc sơ hiệu diệt côn trùng hai cánh chế phẩm BT từ vi khuẩn B thuringiensis Nội dung nghiên cứu - Phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis (Bt) có hoạt tính diệt trùng hai cánh - Nghiên cứu tách dòng đọc trình tự đƣợc gen cry2 chủng Bt phân lập từ đất, có hoạt tính diệt trùng hai cánh chủng vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn - Nghiên biểu gen mã hóa protein Cry2 diệt côn trùng hai cánh chủng vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn - Nghiên cứu phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờngnuôi cấy vi khuẩn B thuringiensis Hồn thiện mơi trƣờng lên men vi khuẩn B thuringiensis từ bã malt bia - Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng sinh tổng hợp protein tinh thể vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn sử dụng bã malt bia làm mơi trƣờngni cấy quy mơ phòng thí nghiệm - Lên men sản xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng hai cánh từ vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn đánh giá sƣ hiệu diệt côn trùng hai cánh chế phẩm phòng thí nghiệm ngồi thực địa Những đóng góp luận án - Phân lập tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn B Thuringiensis mang gen cry2A có hoạt tính diệt trùng hai cánh cao - Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách có hệ thống gen cry2A từ chủng vi khuẩn B thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 Việt Nam có khả diệt trùng hai cánh phục vụ cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học - Bổ sung sở liệu nguồn gen cry2A chủng B thuringiensis Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sau - Sử dụng bã malt bia chất thải ngành sản xuất đồ uống làm nguồn nguyên liệu cung cấp chất dinh dƣỡng (các bon, nitơ, chất khoáng…) cho sinh trƣởng vi khuẩn B thuringiensis đƣợc sử dụng nhƣ nguyên liệu thay cho hợp chất hữu tổng hợp đắt tiền để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu cách hệ thống đầy đủ gen cry2A sở khoa học đáng tin cậy cho nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensisnói chung gen cry2A nói riêng Trên sở đánh giá đƣợc tác động gen cry2A mã hóa protein tinh thể có khả diệt đƣợc số trùng hai cánh nhƣ ruồi nhà bƣớc để mở khả tạo đƣợc chế phẩm sinh học diệt côn trùng 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết luận án góp phần khai thác có hiệu nguồn gen vi sinh vật nói chung gen cry2A vi khuẩn Bacillus thuringiensis nói riêng để góp phần tạo chế phẩm sinh học diệt số côn trùng hai cánh Mặt khác sử dụng bã malt bia - loại chất thải ngành sản xuất công nghiệp đƣợc xử lý thành nguồn nguyên liệu cho trình sản xuất khác chế phẩm BT cần thiết Đây hƣớng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị bã malt bia, tạo sản phẩm thân thiện môi trƣờng phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án dày 149 trang (không kể phần Tài liệu tham khảo Phụ lục) đánh máy vi tính khổ A4 với 23 bảng, 43 hình Luận án gồm phần: Mở đầu (04 trang); Tổng quan tài liệu (40 trang); Vật liệu, nội dung phƣơng pháp nghiên cứu (19 trang); Kết nghiên cứu thảo luận (60 trang); Kết luận kiến nghị (02 trang) Đã tham khảo 146 tài liệu tham khảo bao gồm 20 tài liệu tiếng Việt 126 tài liệu tiếng Anh CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Luận án tham khảo tóm lƣợc tài liệu tiếng Anh tiếng Việt, với nội dung liên quan gồm: Vi khuẩn Bacillus thuringiensis; Gen cry2; Hệ biểu E coli; Côn trùng thử nghiệm; Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis; Tổng quan bã Malt bia; Trong đó, Bacillus thuringiensis (B thuringiensis) vi khuẩn đất, gram dƣơng Trong trình sinh trƣởng phát triển B thuringiensis có khả sinh loại độc tố diệt trùng Cry (crystal δ-endotoxin), Cyt (cytolysin) Vip (vegetative insecticidal protein) Các gen cry2 mã hóa protein tinh thể khoảng 65 – 71 kDa, đƣợc sản sinh số phân loài B thuringiensisnhƣ: kurstaki (HD-1, HD-263, NRD-12 14 dòng khác), thurigiensis, tolwwarthi, israelensis, kenyae… (Dwu cộng sự, 1991; Ohba Aizawa, 1986; Yamamoto, 1983) Cho đến nay, 80 gen cry2 đƣợc phát (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/B thuringiensis/toxins2.html) Ruồi muỗi loài động vật chân khớp ký sinh, thuộc lớp Côn trùng (Insecta), Hai cánh (Diptera) Chúng tác nhân trung gian truyền nhiều bệnh nguy hiểm ngƣời với ngƣời hay động vật ngƣời Thêm nữa, điều kiện thời tiết, khí hậu Việt Nam thuận lợi cho phát triển chúng Có nhiều phƣơng pháp diệt côn trùng hai cánh khác mà ngƣời áp dụng Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến dùng loại thuốc diệt ruồi, muỗi Tuy nhiên, loại thuốc thƣờng có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây nhiễm mơi trƣờng ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh Những điểm đƣợc trình bày Chƣơng Qua đó, thấy việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng số côn trùng hai cánh chủng B thuringiensis phân lập Việt Nam cần thiết nhằm tìm chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng số côn trùng hai cánh CHƢƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các mẫu đất, dùng để phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis đƣợc lấy từ vùng Điện Biên, Hà Nội, Nghệ An, Nha Trang (Khánh Hòa), Lâm Đồng, TP Hồ Chí Minh, Kiên Giang Bã malt bia đƣợc lấy từ nhà máy bia Sài Gòn- Hà Nội thuộc khu công nghiệp vừa nhỏ quận Bắc Từ Liêm Ấu trùng ruồi nhà tuổi 2; ruồi đục đƣợc nhận từ môn Côn trùngViện Bảo vệ thực vật Ấu trùng muỗi Anopheles minimus, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Viện sốt rét ký sinh trùng Trung ƣơng cung cấp Chủng vi khuẩn E coli DH5α dùng cho tách dòng gen chủng vi khuẩn E.coli BL21 dùng để biểu gen hãng Invitrogen Chủng B.thuringiensis 4D4 có nguồn gốc từ Bộ sƣu tập Bacillus thuringiensis đại học Colombus, bang Ohio, Hoa Kỳ Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A Tên mồi Trình tự Cry2AaF TAAGGATCCGATGAATAATGTATTGAATAGTGGAAGA Cry2AaR ATTCTCGAGATAAAGTGGTGGAAGATTAGTTGG Vị trí Kích nhận thƣớc biết (bp) BamHI 1902 XhoI Hệ vector Vector pET22b (+) hãng Novagen, vector pGEM-T đƣợc đóng gói kèm kit pGEM®-T Easy Vector Systems hãng Promega, TA Cloning® Kit with pCR™2.1 vector (Thermosciencetific) 2.2 Địa điểm thời gian thực tập Các thí nghiệm đƣợc thực phòng thí nghiệm Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Cơng nghệ Sinh học, phòng Vi sinh môi trƣờng- Viện Công nghệ Môi trƣờng, Bộ môn Côn trùng – Viện Bảo vệ thực vật, Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học Môi trƣờng-Trƣờng Đại học Phƣơng Đơng Thời gian thực thí nghiệm từ tháng 6/2012-T12/2016 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp vi sinh Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis Vi khuẩn B thuringiensis đƣợc phân lập mẫu đất, mẫu thu thập đƣợc theo phƣơng pháp Thiery Frachon (1997) Phân loại vi khuẩn B thuringiensis phương pháp huyết miễn dịch 2.3.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học Định lượng mật độ bào tử, tinh thể Chủng B thuringiensis phân lập đƣợc đƣợc đem cấy thảm đ a peptri chứa môi trƣờng MPA Số lƣợng bào tử đƣợc tính theo cơng thức (Ohba cộng sự, 1986) Xác định LC50 côn trùng thử nghiệm Thử nghiệm khả diệt ấu trùng Hai cánh đối tƣợng ấu trùng ruồi nhà Musca domestica, ấu trùng ruồi đục tuổi hai, ấu trùng muỗi theo phƣơng pháp Thiery Frachon hai nồng độ 107 109 bào tử/ml với ruồi nhà, ruồi đục 108 106 bào tử/ml với muỗi Mỗi nồng độ đƣợc thử nghiệm với cốc nhựa (mỗi cốc 10 ấu trùng) Tỉ lệ ấu trùng chết đƣợc tính theo cơng thức Abbott (Abbott, 1925) 2.3.3 Phƣơng pháp sinh học phân tử Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn DNA plasmid vi khuẩn đƣợc tách chiết tinh Y kit Gen TM JET Plasmid Miniprep (Fermentas) Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A Sinh tổng hợp DNA đƣợc tiến hành kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) (Sambrook, 2001) Phương pháp tách dòng gen cry2 Cắt DNA enzyme cắt giới hạn Ghép nối DNA T4 DNA ligase Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli DH5α Phương pháp điện di gel agarose DNA đƣợc phát định lƣợng tƣơng đối kỹ thuật điện di gel agarose theo phƣơng pháp Sambrook & Russel, 2001 Tinh DNA từ gel agarose Sản phẩm DNA đƣợc tinh từ gel agarose kít GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình hƣớng dẫn nhà sản xuất Phương pháp xác định trình tự nucleotit đoạn gen tách dòng Trình tự DNA đƣợc xác định theo phƣơng pháp Sanger cộng Mẫu DNA đƣợc gửi đọc trình tự hãng Microgen, Hàn Quốc sử dụng cặp mồi M13 Xử lý kết đọc trình tự phần mềm Bioedit, so sánh trình tự gen tách dòng với trình tự công bố Ngân hàng Gen Quốc tế địa online: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Thiết kế vector biểu Sử dụng vector pET22 b(+) làm vector biểu Gen cry2A đƣợc đƣa vào vector pET 22b(+) vị trí BamHI XhoI Trình tự amino acid protein tái tổ hợp gồm tồn trình tự amino acid gen cry2A tự nhiên thêm 6amino acid Histidine đầu C 36 amino acid đầu N Phương pháp biểu gen Cấy hoạt hố khuẩn lạc mơi trƣờng LB có bổ sung ampicilin với nồng độ cuối 50 g/ ml, nuôi lắc 370C qua đêm Sau cấy chuyển 1% vào 20 ml mơi trƣờng MPB có bổ sung kháng sinh ampicilin nồng độ 50 g/ ml nuôi lắc 370C để OD đạt 0,5-0,8 Cảm ứng IPTG (100 mM) đạt 1mM, nuôi 370C 4h Điện di gel polyacrylamide 12,6% để kiểm tra sản phẩm biểu Phương pháp điện di gel polyacrylamide 12,6 % theo phƣơng pháp Hoefer cộng (1994) Phương pháp Western blot Mẫu protein sau kiểm tra SDS-PAGE gel acryamide 12% đƣợc chuyển lên màng PVDF Mẫu protein đƣợc ủ với kháng thể đặc hiệu kháng thể phát Sau phát dung dịch chứa chất cho peroxidase (Sigma) Phương pháp tinh protein tái tổ hợp Protein tái tổ hợp đƣợc tinh cột sắc ký Ni2+ agarose theo quy trình hƣớng dẫn hãng Invitrogen 2.3.4 Tối ƣu hóa mơi trƣờng lên men theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt Chuẩn bị dịch giống Khuẩn lạc đƣợc nuôi môi trƣờng MTCS vơ trùng Ni lắc 30oC, 200 vòng/phút, thời gian nhân giống 8-10 Dịch nuôi cấy (chứa tế bào giai đoạn sinh trƣởng) đƣợc sử dụng để làm giống cho thí nghiệm (Adjiable cộng sự, 2009; Yezza cộng sự, 2006) Phương pháp lên men vi sinh vật Lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis bình tam giác Lên men bình tam giác 500 ml nhiệt độ 30±0,1oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thời gian ni 48h (Yezza cộng sự, 2006) Lên men thiết bị lên men 10 lít Đƣa 10 lít mơi trƣờng vào bình lên men, khử trùng 121oC, at, vòng 30 phút, làm nguội nhiệt độ phòng, lắp bình lên men vào thiết bị lên men Cài đặt thông số lên men: nhiệt độ 30±0, 1oC, pH7±0,1, tốc độ khuấy 300 vòng/phút, DO>25 mg/l, tốc độ thổi khí 2-4 lít/phút (Lƣơng Đức Phẩm, 2008; Avigone cộng sự, 1992) Thủy phân bã bia Bã bia sau lấy phòng thí nghiệm đƣợc xay nhỏ xử lý làm nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật phƣơng pháp nhiệt phân kết hợp thay đổi pH (Nguyễn Thị Vân Trang cộng sự, 2012; Valo cộng sự, 2004) Bố trí thí nghiệm Dịch thủy phân bã bia sau xử lý đƣợc đƣa phân tích thành phần hóa học theo phƣơng pháp tiêu chuẩn Trong TOC đƣợc xác định phƣơng pháp SMEWW 5310B-2005; TN, TP đƣợc xác định phƣơng pháp EPA-352.1 EPA-365.2, thành phần kim loại đƣợc xác định theo phƣơng pháp SMEWW 3125-2005 (Adjiable cộng sự, 2009) Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất rắn lên trình sinh trưởng sinh tổng hợp protein tinh thể chủng MSS8.4 Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia Đánh giá tác động độc lập yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng sinh protein tinh thể Tối ưu hóa thành phần môi trường phương pháp đáp ứng bề mặt Tối ưu hóa thành phần mơi trường phương pháp đáp ứng bề mặt Tối ƣu thành phần môi trƣờng theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt đƣợc mô tả đƣợc thực theo phƣơng pháp Rajesh cộng (2012) Sau xác định đƣợc khoảng tác động yếu tố đến sinh trƣởng sinh tổng hợp protein MSS8.4, nhập liệu vào phần mềm Design expert 10.1 Xử lý số liệu CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng hai cánh từ chủng Bacillus thuringiensis 3.1.1 Phân lập chủng Bacillus Để phân lập tuyển chọn đƣợc chủng B thuringiensis có hoạt tính diệt trùng cánh (Diptera), 317 mẫu đất, đƣợc thu thập tỉnh thành từ vùng địa lý Việt Nam Các địa điểm trƣớc chƣa sử dụng chế phẩm sinh học Trong 317 mẫu đất, thí nghiệm có 198 mẫu mang vi khuẩn Bacillus 119 mẫu không phân lập đƣợc B thuringiensis Nhƣ tần suất xuất Bacillus 62,4% Những khu vực có tỉ lệ Bacillus cao mẫu: Kiên Giang (75,0%), Điện Biên (72,8%) Hà Nội (72,8%); thấp Nghệ An (33,3%) Trong số 1.020 khuẩn lạc với đặc điểm thuộc chi Bacillus, có 440 khuẩn lạc thuộc nhóm B thuringiensis dựa khả hình thành tinh thể (chiếm 43%) Tỉ lệ phụ thuộc vào số mẫu lấy đƣợc tỉnh, cao mẫu đƣợc thu thập Hà Nội (54%) thành phố Hồ Chí Minh (53%), thấp mẫu thu thập Lâm Đồng (25%), tỉnh Điện Biên Kiên Giang cho tỉ lệ tƣơng đƣơng (42% 44%) Các mẫu đất đƣợc thu thập vùng địa lý Việt Nam có tần suất Bt cao so với công bố trƣớc (Martin Travers, 1989; Binh cộng sự, 2005) Tần suất Bt nghiên cứu 62,4% điều hồn tồn phù hợp với cơng bố trƣớc Martin Travers (1989), mẫu đất New Zealand (Chilcott Wigley, 1993), mẫu đất Hàn Quốc ( Lee cộng sự, 1995) mẫu đất nhật Bản (Ohba Aizawa, 1986) Sự xuất Bt hầu nhƣ khắp nơi môi trƣờng sống, bao gồm: đất nông nghiệp, đất rừng, đất thị, đất ngập mặn, chí sa mạc (Dulmage Aizawa,1982; Martin Travers, 1989; Zhang cộng sự, 2000; Uribe cộng sự, 2003) Trong nghiên cứu này, xuất Bt tập trung chủ yếu Hà Nội thuộc đất thành thị có mật độ dân số cao Kết cao nhiều so với nghiên cứu Quesada-Moraga (Quesada-Moraga cộng sự, 2004), phù hợp với kết Ayyasamy (2012) Theo Ayyasamy, tỉ lệ Bt đất thành thị 80%, nhiên tần suất xuất cao đất nơng nghiệp (Ayyasamy thuộc nhóm cry2A, phân nhóm cry2Aa Nhóm độc tố cry2Aa cry4 đƣợc chứng minh có khả gây độc lên trùng thuộc cánh (Bravo, 1997) Trình tự DNA của gen cry2Aa đƣợc đa chuỗi so sánh với trình tự gen thuộc phân nhóm cry2Aa Ngân hàng Gen Quốc tế Kết cho thấy trình tự đoạn gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 có chiều dài 1902 bp có độ tƣơng đồng 99% với trình tự tƣơng ứng cơng bố trƣớc ngân hàng genvới điểm sai khác: 305 (G-A), 500 (G-A), 783 (T-G), 1054 (T-G), 1303 (G-A), 1575 (C-T), chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng 100% với chủng cơng bố.Trình tự nucleotide gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 đƣợc đƣa lên Genbank với mã số KM588296.1 So sánh trình tự amino axit (aa) suy diễn gen cơng cụ so sánh BLAST NCBI cho thấy,trình tự axit amin chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng hồn tồn với chủng cơng bố, chủng MSS8.4 có độ tƣơng đồng 99% với trình tự axit amin Cry2A từ Bt với vị trí sai khác (102 (S-N), 167 (R-Q), 261 (F-L), 352 (W-G), 435 (D-N)), đột biến nu vị trí 1575 (C-T) khơng làm thay axit amin Điều chứng tỏ gen cry đƣợc nhân dòng từ chủng vi khuẩn MSS8.4 LNT7.12 gen mã hóa cho độc tố Cry2A, phân nhóm Cry2Aa Cấu trúc độc tố Cry2A từ chủng MSS8.4 đƣợc so sánh với trình tự Cry2Aa từ chủng B thuringiensis biết trƣớc cho thấy, có độ tƣơng đồng cao (99%) so với Cry2Aa từ chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki (Pdb_id 1: 1I5P_A) đƣợc Morse cộng xác định nhiễu xạ tia X (Morse, 2001) Cry2Aa từ MSS8.4 đƣợc chia làm vùng cấu trúc: Endotoxin đầu N gồm 210 a.a (Val-53 đến Lys-263); Endotoxin vùng gồm 205 a.a (Leu-267 đến Asn-472); cuối vùng Endotoxin đầu C gồm 224 a.a (Từ Phe-494 đến Asn-628) Kết lần khẳng định gen tách dòng gen mã hóa cho protein độc tố Cry2A, phân nhóm Cry2Aa 3.2.3 Biểu gen 3.2.3.1 Tạo chủng tái tổ hợp mang gen cry2A vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Để khẳng định xem khả diệt trùng có phải đƣợc quy định gen cry2A hay không, gen cry2A từ chủng MSS8.4 tiếp tục đƣợc sử dụng để biểu protein độc tố Cry2A kiểm tra khả diệt côn trùng protein tái tổ hợp khuẩn lạc ngẫu nhiên đƣợc kiểm tra kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu Kết cho thấy dòng xuất băng DNA có kích thƣớc khoảng 1,9 kb Kết kiểm tra phản ứng cắt mở vòng với enzym BamHI XhoI thể tạo thành công chủng E coli tái tổ hợp mang gen cry2A 12 3.2.3.2 Nghiên cứu biểu gen cry2A E coli BL21 Biểu sơ gen cry2A Kết điện di protein tổng số gel SDS-PAGE cho thấy, dòng tế bào E coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu pET-22b(+)-cry2A đƣợc cảm ứng cho phép tạo vạch protein đậm có kích thƣớc khoảng 70 kDa, hồn tồn trùng khớp với tính tốn lý thuyết kích thƣớc protein Cry2A dạng dung hợp Nhƣ kết luận trình biểu gen cry2A thành cơng Kiểm tra Cry2A tái tổ hợp b ng Western blot Kết hình 3.17 cho thấy, protein dung hợp đƣợc thể qua băng với kích thƣớc nhƣ tính tốn (khoảng 70 kDa) Điều khẳng định, protein Cry2A đƣợc biểu thành công hệ vector pET22b(+) Hình 3.17 Phân tích biểu protein Cry2A b ng kỹ thuật Western blot.M: Thang chuẩn protein (Biobasic); 1: Đối chứng dƣơng (Sigma); 2-4: Mẫu sau cảm ứng thu 1h, 2h, 5h; 5: Mẫu không mang gen Để tạo sản phẩm Cry2A có hoạt tính diệt trùng Hai cánh, sản phẩm protein cần đƣợc tiếp tục xử lý kiểm tra diệt côn trùng côn trùng thử nghiệm Bảng 3.3 Thử hoạt tính sinh học rCry2A protein tinh thể từ B thuringiensis với ấu trùng M domestica Giới hạn LC50 tin cậy Côn trùng Protein LC50 (g) Thấp Cao M 4D4 442,5 11,3 56,5 domestica MSS8.4 283,5 17,6 100 rCry2A 264,7 28,3 66,1 MSS8.4+rCry2A 268,6 27,8 59,3 Kết thử nghiệm hoạt tính ghi nhận sau 72 cho thấy, protein tái tổ hợp có hoạt tính cao với trùng thử nghiệm (LC50 = 264,7 g) Đồng thời hoạt tính protein Cry2A tự nhiên chủng MSS8.4 (LC 50 = 283,5 µg) cao chủng chuẩn 4D4 (LC50 = 442,5 g) Sự sai khác khả diệt trùng chủng MSS8.4 ngồi khả hình thành độc tố Cry2A có xuất độc tố Cry1A 3.2.4 Nghiên cứu tối ƣu điều kiện biểu gen 13 3.2.4.1 Nghiên cứu tối ưu nhiệt độ biểu gen cry2A Tế bào E coli BL21 đƣợc cấy lắc điều kiện nhiệt độ khác là: 28, 30, 37, 40 oC Sau nuôi cấy, thu tế bào, điện di kiểm tra gel 12,6 % polyacrylamide Kết cho thấy, nhiệt độ 37oC, tế bào biểu cho băng protein đậm Do lựa nhiệt độ 37oC cho biểu rCry2A 3.2.4.2 Nghiên cứu tối ưu nồng độ chất cảm ứng biểu gen cry2A Lựa chọn nghiên cứu nồng độ chất cảm ứng IPTG lần lƣợt 0,1; 0,2; 0,5; 1; 1,5 mM Kết biểu cho thấy tổng hợp protein Cry2A tối ƣu đƣợc cảm ứng 1mM 3.2.4.3 Nghiên cứu tối ưu thời gian biểu gen cry2A Cố định nhiệt độ cảm ứng 37oC, nồng độ IPTG cảm ứng mM khảo sát biểu protein tái tổ hợp theo thời gian (1, 2, 3, 4, giờ) Mẫu đƣợc xử lý điện di kiểm tra gel polyacrylamide 12,6% Kết quả, lƣợng protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian, cao thời điểm Do đó, lựa chọn thời điểm để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lƣợng sản phẩm chi phí lên men 3.2.5 Tinh chế protein tái tổ hợp b ng cột sắc kí lực Probond Nikel Resin Chủng tái tổ hợp đƣợc biểu 37 oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG mM, thu sau Sau sinh khối tế bào đƣợc thu lại ly tâm, xử lý tinh Kết điện di SDS-PAGE cho thấy protein Cry2A tái tổ hợp đƣợc thu lại dạng tinh sạch, có kích thƣớc 70 kDa tƣơng đƣơng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết 3.2.6 Hoạt tính diệt trùng hai cánh rCry2A chủng MSS8.4 Bảng 3.4 Hoạt tính diệt trùng protein tinh thể từ chủng MSS8.4 protein tái tổ hợp rCry2A Côn trùng thử Protein LC50 (g)* Giới hạn LC50tin cậy nghiệm Thấp Cao M domestica 4D4 442.5 11.3 56.5 MSS8.4 283.5 17.6 100 rCry2A 264.7 28.3 66.1 A minimus 4D4 9.42 53.33 70 MSS8.4 7.34 56.67 83.33 rCry2A 7.03 70 93.33 A aedes 4D4 19.05 6.67 63.33 MSS8.4 14.52 56.67 73.33 rCry2A 13.33 63.33 80 Cx quinquefasciatus 4D4 19.05 36.67 46.67 14 Côn trùng nghiệm thử Protein LC50 (g)* Giới hạn LC50tin cậy Thấp Cao MSS8.4 17.6 70 90 rCry2A 14.52 56.67 86.67 Hoạt tính diệt trùng protein tinh thể đƣợc xác định dựa khả diệt ấu trùng ấu trùng thử nghiệm hai cánh gồm: M domestica, A minimus, A aedes, Cx quinquefasciatus Thử nghiệm nồng độ thay đổi từ 0,5 – 500 g/g, kết đƣợc xác định phân tích chƣơng trình Probit analysis Kết thử nghiệm hoạt tính ghi nhận Bảng 3.4 Nhƣ vậy, protein tái tổ hợp Cry2A đƣợc biểu thành công E coli protein tái tổ hợp có hoạt tính diệt ấu trùng Hai cánh cao protein tự nhiên, nhƣ chủng chuẩn Kết cao nhiều so với nghiên cứu Misra cộng sự, phân đoạn protein Cry2Aa4 sau tinh sắc ký lực có LC50 khoảng 100-500 mg (Misra cộng sự, 2002); Yilmaz cộng (2017), tác giả rằng, Cry2Aa18 đƣợc biểu có nguồn gốc từ cry2A chủng B thuringiensis SY49-1 có khả diệt ấu trùng C pipiens (LC50= 630 g/ml) So với kết nghiên cứu Reyaz Arulsel (2016), protein tái tổ hợp sau tinh Cry2AI1 có hoạt tính Spodoptera litura Helicoverpa armigera (LC50= 2,448 µg/ml) Helicoverpa armigera (LC50= 3,374μg/ml) hoạt tính protein rCry2A thấp nhiều 3.3 Lựa chọn môi trƣờng tối ƣu lên men làm tăng khả hình thành protein tinh thể chủng vi khuẩn MSS8.4từ bã bia 3.3.1 Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4 3.3.1.1 Ảnh hưởng phương pháp tiền xử lý bã bia làm nguyên liệu lên men vi khuẩn MSS8.4 Khi sử dụng làm nguyên liệu lên men vi khuẩn MSS8.4, bã bia đƣợc nghiền nhỏ đƣa nồng độ chất rắn 2% Thí nghiệm đƣợc thực bình tam giác 30oC, thời gian 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút, kết phân tích đƣợc trình bày bảng 3.5 Kết phân tíchcho thấy, sử dụng dịch thủy phân phƣơng pháp axit cho mật độ TCC, SC protein tinh thể cao nhất, mật độ tế bào đếm đƣợc đạt 4,9x108 CFU/ml; đó, thí nghiệm sử dụng bã bia vơ trùng (TN3), TCC đạt 107 CFU/ml Nhƣ vậy, tiền xử lý bã bia phƣơng pháp axít nhiệt kiềm nhiệt làm tăng hàm lƣợng chất dinh dƣỡng môi trƣờng giúp vi khuẩn MSS8.4 sinh trƣởng tốt hơn.Kết nghiên cứu phù hợp với nhận định Brar cộng sự, thủy phân hợp chất hữu nhiệt độ cao làm tăng giá trị dinh dƣỡng môi trƣờng Do đó, mật độ tế bào, bào tử vi khuẩn MSS8.4trên môi trƣờng bã bia thủy phân 15 phƣơng pháp axit nhiệt cao so với môi trƣờng khác (Brar cộng sự, 2005) Khả sinh tinh thể độc vi khuẩn MSS8.4 có khác biệt rõ rệt thí nghiệm khác thí nghiệm sử dụng bã bia vơ trùng, sau 48 lên men vi khuẩn MSS8.4, nồng độ delta-endotoxin đạt 319 mg/l Trong đó, thí nghiệm sử dụng bã bia tiền xử lý phƣơng pháp axít nhiệt nồng độ delta-endotoxin đạt 428 mg/l, cao gấp 1,3 lần so với thí nghiệm sử dụng bã bia vơ trùng Do đó, phƣơng pháp axit nhiệt đƣợc lựa chọn phƣơng pháp tiền xử lý bã bia làm môi trƣờng ni cấy vi khuẩn MSS8.4 3.3.1.2 Phân tích thành phần dịch thủy phân bã bia phương pháp axit nhiệt Để đánh giá hàm lƣợng chất có dịch thủy phân bã bia, dịch thủy phân bã bia phƣơng pháp axit nhiệt đƣợc gửi phân tích Phòng Phân tích chất lƣợng mơi trƣờng - Viện Cơng nghệ mơi trƣờng Kết phân tích cho thấy, dịch thủy phân bã bia phƣơng pháp axit nhiệt hàm lƣợng C, N (hai nguồn chất quan trọng sinh trƣởng vi khuẩn) cao hẳn so với dịch bã bia thủy phân phƣơng pháp kiềm nhiệt vơ trùng.Kết hồn toàn phù hợp với nhận định trên, cho tác nhân axit điều kiện nhiệt độ cao giúp tăng khả phân hủy hợp chất cao phân tử, làm tăng hàm lƣợng hợp chất hữu dễ hấp thu dịch thủy phân Các ngun tố khống nhân tố khơng thể thiếu q trình sinh trƣởng, phát triển vi khuẩn nói chung chủng thuộc gen Bt nói riêng Trong đó, ion kim loại nhƣ Mg, Mn, Fe, Zn, Ca, v.v có tác dụng điều tiết quan trọng đến sinh trƣởng, hình thành bào tử nhƣ sinh tổng hợp protein tinh thể diệt côn trùng Do vậy, môi trƣờng tổng hợp lên men vi khuẩn thƣờng đƣợc bổ sung thêm số muối khoáng với nồng độ nhƣ sau: 0,3% MgSO4.7H2O; 0,02%o MnSO4.7H2O; 0,02%o FeSO4.7H2O; 0,2%o ZnSO4.7H2O 1,0%o CaCO3(Ngơ Đình Bính, 2000) Xét theo nhu cầu khống vi khuẩn Bt khơng có nguyên tố ba thí nghiệp đáp ứng đủ nhu cầu khoáng Do vậy, phải bổ sung thêm khoáng vào dịch thủy phân bã bia để cải thiện chất lƣợng môi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4 Tuy nhiên, theo nghiên cứu Ozkan cộng sự: nồng độ 10 -6M, Mn yếu tố chủ chốt tác động đến sinh tổng hợp độc tính vi khuẩn Bt mà khơng ảnh hƣởng tới trình khác tế bào Trong dịch thủy phân bã bia phƣơng pháp axit nhiệt, Mn có nồng độ 0,136 mg/l (2,7x10 -6M/l) nồng độ nằm khoảng nông độ phù hợp cho lên men vi khuẩn Bt thu độc tố delta endotoxin(Ozkan cộng sự, 2003) Theo nghiờn cu ca Iỗgen v cỏc cng s, s sinh trƣởng, hình thành bào tử sinh tổng hợp protein tinh thể vi khuẩn Btk không phụ thuộc vào 16 yếu tố dinh dƣỡng cacbon, nito mà chịu tác động lớn từ nhân tố khoáng Cụ thể, bổ sung Mg nồng độ từ 8x10 -5M đến 4x10-3M mật độ tế bào v nng protein tinh th tng mnh (Iỗgen v cộng sự, 2002) Theo kết phân tích, nồng độ Mg dịch thủy phân bã bia phƣơng pháp axit nhiệt 12 mg/l (2,9x10-3M), nồng độ Mg nằm khoảng thích hợp cho phát triển sinh độc tố vi khuẩn Bt theo nh nghiờn cu ca Iỗgen 3.3.1.3.Xỏc nh nng bó bia phù hợp làm môi trường lên men vi khuẩn MSS8.4 Các thí nghiệm lên men vi khuẩn MSS8.4 sử dụng bã bia đƣợc thực nồng độ nhƣ sau: 1%TS; 1,5%TS; 2%TS; 2,5%TS; 3%TS; 3,5%TS Các kết nghiên cứu cho thấy: t lệ % chất khô bã bia nằm khoảng từ – 3là phù hợp cho phát triển vi khuẩn Bt nồng độ thấp (1%TS) mật độ vi khuẩn mẫu sau 48 lên men đạt 2,9x10 7CFU/ml, nồng độ 2,0 – 3,0%TS mật độ tế bào sau 48 lên men đạt 108CFU/ml Trong thí nghiệm tăng nồng độ bã bia lên 3,5%, mật độ tế bào thu đƣợc sau 48 lên men không cao đạt 107CFU/ml Protein tinh thể đƣợc sinh đồng thời với trình hình thành bào tử sản phẩm mong muốn trình lên men vi khuẩn MSS8.4 Do vậy, tiêu định đến chất lƣợng sản phẩm Kết thí nghiệm bảng 3.6 cho thấy nồng độ bã bia 2,5% nồng độ protein tinh thể đạt đƣợc cao Nhƣ vậy, xét mặt tổng thể nồng độ 2,5%TS phù hợp cho lên men MSS8.4 thu độc tố diệt ấu trùng ruồi Nồng độ 2,5%TS đƣợc sử dụng cho tất nghiên cứu sau 3.3.2 Đánh giá tác động độc lập yếu tố dinh dƣỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng sinh tinh thể độc vi khuẩn MSS8.4 3.3.2.1 Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung vào môi trường bã bia Thí nghiệm đƣợc thực bình tam giác, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút Xác định mật độ tế bào, bào tử nồng độ protein tinh thể sau 48 lên men Kết đánh giá ảnh hƣởng hợp chất hữu bổ sung vào dịch thủy phân bã bia cho thấy cám gạo bột đậu tƣơng hai yếu tố có tác động tích cực đến sinh trƣởng nhƣ tạo thành tinh thể độc chủng vi khuẩn MSS8.4 Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Hồi Trâm cộng bột đậu tƣơng nguồn dinh dƣỡng tốt cho sinh trƣởng vi khuẩn Bt sinh độc tố diệt sâu (Nguyễn Hoài Trâm, 2004) Kết phù hợp với kết cơng bố Nguyễn Thị Hòa cộng bổ sung cám gạo bột đậu tƣơng vào dịch thủy phân bùn thải sinh học làm môi trƣờng lên men vi khuẩn Btk thu độc tố diệt trừ sâu (Hoa cộng sự, 2014) Trong hai nguồn dinh 17 dƣỡng cám gạo bột đậu tƣơng bột đậu tƣơng có khả tan tốt hơn, vậy, bột đậu tƣơng đƣợc chọn làm nguồn dinh dƣỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia Khi xem xét hàm lƣợng protein tinh thể dịch lên men MSS8.4 sau 48 ni cấy cho thấy: có khác biệt rõ rệt bổ sung thêm muối MgSO4.7H2O MnSO4 vào dịch thủy phân bã bia hai thí nghiệm có bổ sung 0,5 g/l MgSO4.7H2O 0,05 g/l MnSO4 hàm lƣợng protein tinh thể thu đƣợc sau 48 lên men tăng khoảng 10% so với thí nghiệm đối chứng dịch thủy phân bã bia, hàm lƣợng deta endotoxin lần lƣợt đạt 469 mg/lít 461 mg/lít Kết nghiên cứu hồn tồn phù hợp với kết nghiên cứu Braun năm 2000, Icgen cộng nghiên cứu vai trò Mg2+ sinh trƣởng sinh tổng hợp protein tinh thể Các tác giả thiếu hụt Mg2+ môi trƣờng lên men làm giảm khả sinh trƣởng, hình thành bào tử dịch lên men, nhƣng ảnh hƣởng lớn phát đƣợc giảm khả tổng hợp độc tố protein tinh thể Mg 2+ trung tâm điều khiển hoạt động enzym, có mặt Mg tác động đến trình hình thành bào tử sinh tổng hợp protein tinh thể (Braun S, 2000; Icgenvà cộng sự, 2002) Kết nghiên cứu bảng 3.9 cho thấy Mn2+ hai yếu tố ảnh hƣởng mạnh đến khả sinh tổng hợp protein tinh thể Kết phù hợp với nhận định Ozkan công cho Mn yếu tố chủ trốt tác động đến trình sinh tổng hợp protein tinh thể vi khuẩn Bt mà khơng ảnh hƣởng tới q trình khác tế bào (Ozkan cộng sự, 2003) Theo nghiên cứu Subbiah cộng nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt muỗi từ vi khuẩn B thuringiensis subsp israelensis việc bổ sung Mn2+ vào môi trƣờng dinh dƣỡng làm từ lông vũ làm tăng đáng kể hàm lƣợng protein tinh thể dịch canh trƣờng lên men Bti (Subbiah cộng sự, 2012) Dựa vào kết nghiên cứu trên, bột đậu tƣơng, MgSO 4.7H2O MnSO4 nhân tố đƣợc lựu chọn làm nhân tố dinh dƣỡng để hồn thiện mơi trƣờng lên men vi khuẩn MSS8.4 môi trƣờng sở từ dịch thủy phân bã bia 3.3.2.2 Đánh giá tác động độc lập yếu tố chọn đến sinh trưởng sinh tổng hợp detlta endotoxin MSS8.4 Sau đánh giá tác động độc lập yếu tố lựa chọn đến sinh trƣởng, hình thành bào tử sinh tổng hợp protein tinh thể cho thấy, nồng độ mangan từ – 0,1 g/l, magie từ – 1,0 g/l; bột đậu tƣơng từ - g/l có ảnh hƣởng mạnh đến sinh trƣởng, sinh tổng hợp tinh thể protein tinh thể MSS8.4 bổ sung vào dịch thủy phân bã bia 3.3.3 Tối ƣu hóa mơi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã bia 18 3.3.3.1 Xây dựng mô hình tối ưu theo phương pháp đáp ứng bề mặt Thành phần chất bổ sung đƣợc xác định theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt với miền khảo sát yếu tố ảnh hƣởng nhƣ sau: nồng độ Mn (A) 0,0 – 0,1 g/l; nồng độ Mg (B) – 0,8 g/l; nồng độ bột đậu tƣơng (C) – g/l Bằng phần mềm phần mềm Design expert 10.1 thu đƣợc ma trận gồm 20 thí nghiệm cho yếu tố ảnh hƣởng Các thí nghiệm đƣợc thực lặp lại lần lấy kết trung bình lần lặp lại đƣa vào xử lý thống kê phần mềm phần mềm Design expert 10.1 Kết phân tích hồi quy mơ hình cho thấy: giá trị p mơ hình