Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bacillus có khả năng chịu nhiệt từ sản phẩm tỏi lên men

IC hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thu Hằng, B m n Cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện C ng nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường ại học Lâm nghiệp ịnh hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn tạo iều kiện vật tư, hóa chất, thiết ị cho nghiên cứu t i hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy giáo, Cô giáo Viện C ng nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường ại học Lâm nghiệp kiến thức qu tận tình truyền ạt áu tạo iều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập làm khóa luận Do kiến thức chuyên m n hạn hẹp nên kh ng tránh khỏi thiếu sót, t i mong nhận ược kiến óng góp qu áu thầy c giáo, ạn sinh viên khóa luận t i ược hoàn thiện T i xin chân thành cám ơn! Nội, tháng năm 2019 Sinh viên thực guyễn Thị gọc i ỤC ỤC L I C M N i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH NH iv DANH MỤC B NG v CHƯ NG I TỔNG QUAN VẤN Ề NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan sản phẩm tỏi lên men 1.1.1 Quy trình tạo sản phẩm lên men lên men 1.1.2 Thành phần hóa học tỏi lên men 1.2 ặc i m sinh học Bacillus 1.2.1 Phân loại vi khuẩn Bacillus 1.2.2 ặc i m hình thái: 1.2.3 ặc i m phân ố 1.2.4 Dinh dưỡng tăng trưởng 1.2.5.Tính chất vi khuẩn Bacillus 1.3 M t số loài Bacillus phổ iến tự nhiên 11 1.4 Vai trò vi khuẩn Bacillus trình lên men tỏi 12 1.5.Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus lên men tỏi 13 CHƯ NG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.2 N i dung nghiên cứu 15 2.3 Vật liệu, hóa chất, m i trường nghiên cứu 15 2.3.1 Vật liệu 15 2.3.2 Hóa chất 15 2.3.3 Các loại m i trường sử dụng nghiên cứu 16 2.4 Thiết ị 17 2.5 Phương pháp nghiên cứu 17 2.5.1 Phân lập làm vi sinh vật [14] 17 ii 2.5.2.Xác ịnh khả sinh n i tử [7] 18 2.5.3 Phương pháp nhu m Gram [15] 19 2.5.4 Xác ịnh khả sinh catalase [14] 20 2.5.5 Xác ịnh hàm lượng axit sinh m i trường nu i cấy vi khuẩn [11] 20 2.5.6 Xác ịnh khả sinh enzyme ngoại [10] 21 2.5.7 Xác ịnh hoạt tính kháng vi sinh vật ki m ịnh [15] 22 2.5.8 Xác ịnh ảnh hưởng iều kiện nu i cấy ến sinh trưởng phát tri n chủng vi khuẩn 23 CHƯ NG KẾT QU VÀ TH O LUẬN 26 3.1 Phân lập sàng lọc sơ chủng Bacillus 26 3.2 Xác ịnh hàm lượng axit sinh m i trường nu i cấy vi khuẩn 28 3.3 Xác ịnh khả sinh enzyme ngoại (amylase, protease, cellulase) 29 3.4 Xác ịnh hoạt tính kháng vi sinh vật ki m ịnh 31 3.5 nh hưởng iều kiện nu i cấy ến sinh trưởng phát tri n chủng vi khuẩn 32 3.5.1 Khảo sát khả chịu nhiệt 32 3.5.2 Xác ịnh ảnh hưởng thời gian nu i cấy 33 3.5.3 Xác ịnh ảnh hưởng nồng NaCl 35 3.5.4 Xác ịnh ảnh hưởng pH m i trường 36 CHƯ NG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1.Kết luận 38 4.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KH O iii DA H ỤC HÌ H NH Hình 1.1a Sơ lên men tỏi trắng ằng nhiệt tạo sản phẩm tỏi lên men Hình 1.1 Sơ lên men tỏi có tác ng vi sinh vật (Kim cs, 2009) Hình 1.2 Hình thái tế Bacillus su tilis Hình 3.1 Sinh khối vi khuẩn hình dạng tế chủng L1 27 Hình 3.2 Khả sinh catalase chủng vi khuẩn 27 Hình 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại chủng vi sinh vật thời i m 24h 30 Hình 3.4 Khả kháng vi sinh vật ki m ịnh hai chủng L1 L2 31 Hình 3.5 Khả chịu nhiệt chủng L2 33 Hình 3.7 nh hưởng nồng Hình 3.8 nh hưởng NaCL ến hai chủng L1 L2 35 PH ến chủng vi khuẩn L1 L2 37 iv DA H ỤC B G Bảng 2.1 M i trường MRS (m i trường phân lập, nu i cấy vi khuẩn) 16 Bảng 2.2 M i trường Luria Bertani (LB) 16 Bảng 2.3 M i trường thử hoạt tính enzyme ngoại vi sinh vật 16 Bảng 2.4 Danh sách thiết ị sử dụng trình thực ề tài 17 Bảng 3.1 ặc i m hình thái khuẩn lạc m t số ặc i m sinh học chủng vi sinh vật 26 Bảng 3.2 chuẩn ịnh lượng khả sinh axit chủng vi khuẩn ằng phương pháp Therner 29 Bảng 3.3 ường kính vịng phân giải chất hai chủng vi khuẩn L1 L2 30 Bảng 3.4 Khả kháng vi sinh vật ki m ịnh hai chủng vi khuẩn 31 Bảng 3.5 nh hưởng nhiệt Bảng 3.6 ến chủng 32 nh hưởng thời gian nu i cấy ến tạo thành sinh khối chủng 34 Hình 3.6 nh hưởng thời gian nu i cấy ến tạo thành sinh khối chủng vi khuẩn 34 Bảng 3.7 nh hưởng nồng Bảng 3.8 NaCL ến hai chủng L1 L2 35 nh hưởng pH an ầu m i trường nu i cấy ến tạo thành sinh khối chủng 36 v DA H ỤC VIẾT TẮT CFU Colony Forming Unit CMC Cacborxyl Methy Cellulose CS C ng Sự G Gram LB Luria Bertani NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth MRS De Man Rogosa Sharp VK Vi Khuẩn VSV Vi Sinh Vật vi ĐẶT VẤ ĐỀ Ngày nay, kinh tế ngày phát tri n với tiến học khoa làm cho cu c sống người có nhiều thay ổi lớn Càng ngày ời sống tinh thần vật chất cao, ó nhu cầu chất lượng sản phẩm tăng cao òi hỏi nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm áp ứng nhu cầu người tiêu dùng Với mục ích ảo vệ sức khỏe cho người sử dụng, ảo vệ m i trường sống kh ng ị nhiễm ởi hoá chất c hại Do vậy, nhà khoa học khuyến cáo nên hạn chế cấm sử dụng m t số loại thuốc, ặc iệt thuốc kháng sinh thay thuốc kháng sinh ằng sản phẩm chức có lợi cho sức khỏe Từ ó, sản phẩm lên men có lợi cho sức khỏe ược người tiêu dùng quan tâm Các sản phẩm lên men kh ng làm phong phú văn hóa ẩm thực mà cịn góp phần cung cấp cho người chất dinh dưỡng dạng hợp chất ơn giản dễ tiêu thụ ặc iệt, sản phẩm lên men mang lại cho người m t th khỏe mạnh nhờ thành phần có tác dụng tăng cường sức khỏe, chống lại ệnh tật tác dụng y học khác Tỏi en (BG - lack garlic) gần ây ược iết ến từ thị trường Hàn Quốc m t sản phẩm y tế M t số nghiên cứu chiết xuất tỏi en có tác dụng chống oxy hóa, chống dị ứng, chống ệnh ti u ường, chống viêm, kháng cholesterol, kháng lipidemic có tác dụng chống ung thư có sản phẩm chất lượng tỏi lên men tốt tiết kiệm chi phí thời gian Các doanh nghiệp sản xuất chế iến tỏi en nhà nghiên cứu khoa học nghiên cứu nhiều cách lên men tỏi en Trong ó, lên men tỏi ằng vi sinh vật ang ược ặc iệt quan tâm Vì tỏi lên men ằng vi sinh vật có th cải thiện hiệu chất lượng trình lên men, cải thiện vị giác, tăng cường hàm lượng protein vi khuẩn lên men, ồng thời ẩy nhanh phản ứng sinh hóa tỏi hữu cơ, rút ngắn thời gian cho màu en, giảm chi phí sản xuất, cải thiện trình sản xuất hiệu quả, tăng hiệu hoạt thành hoạt ng Sản phẩm tỏi en ược tạo ng lên men vi sinh vật nhiệt cao thời gian dài Do vậy, chắn sản phẩm tỏi en tồn mật vi sinh vật cao chủng vi sinh vật có khả chịu nhiệt, phát tri n sinh trưởng iều kiện pH thấp Với mục tiêu phân lập vi sinh vật hữu ích có khả chịu nhiệt, chịu axit m t số ặc i m sinh học qu , chúng t i thực khóa luận: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả chịu nhiệt từ sản phẩm tỏi lên men” CHƯ G I TỔ G QUA VẤ ĐỀ GHIÊ CỨU 1.1 Tổng quan sản phẩm tỏi lên men Tỏi lên men sản phẩm trình lên men tỏi tươi, hay gọi tỏi trắng Phụ thu c vào thiết ị sử dụng lên men , trình lên men tỏi en khoảng thời gian từ ngày ến 60 ngày, có ến vài tháng, nhiệt khoảg 70°C có th lên ến 80-90°C ẩm 70-90% [11] Tỏi en ược sử dụng r ng r i với vai trò thực phẩm chức giúp tăng cường sức khỏe, có khả kéo dài tuổi xuân [13] Từ năm 2000 ến nay, có hàng trăm nghiên cứu tác dụng tỏi, phát thêm nhiều c ng dụng tỏi có nhiều chất chống oxy hóa chất chống dị ứng [22], giúp kéo dài tuổi thọ [18], phịng chống ung thư Ngồi ra, tỏi en cịn ược chứng minh có nhiều tác dụng có lợi ối với sức khỏe người, như: phục hồi tổn thưởng gan uống rượu [22], giảm éo phì tăng mỡ máu [22], ức chế phát tri n vi sinh vật gây ệnh [4] Tuy nhiên, nhược i m tỏi mùi khó chịu hợp chất sun-fua gây phục nhược i m này, nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc men tự nhiên tỏi tươi tạo tỏi en, kết khắc nghiên cứu lên lên tỏi en thành c ng, vừa khắc phục ược mùi khó chịu tỏi, vừa làm tăng tác dụng chống oxy hóa tỏi en lên nhiều lần so với tỏi tươi, khiến cho tỏi en có tác dụng vị thuốc ặc trị chống oxy hóa, chống l o hóa, phịng chống ệnh ung thư, ệnh nan y [10] Quan trọng tỏi en có chứa chất chống oxy hóa cao nhiều loại hóa chất có lợi cho sức khỏe người 1.1.1 Quy trình tạo sản phẩm lên men lên men Có hai phương pháp tạo sản phẩm tỏi en khác nhau, ví dụ hai sơ ây m t quy trình sản xuất tỏi en lên men ằng nhiệt (kh ng có ổ sung ịnh hướng vi sinh vật) (Hình 1.1a) m t qui trình sản xuất tỏi en diễn lên men ởi vi sinh vật ược ổ sung ịnh hướng vào sản phẩm (Hình 1.1b) Hình 1.1a Sơ đồ lên men tỏi trắng nhiệt tạo sản phẩm tỏi lên men Kim cs (2009) tìm m t phương pháp iều chế tỏi en ằng cách lên men với vi khuẩn hỗn hợp Phương pháp có ưu i m thời gian lên men ngắn, hiệu sản xuất cao chi phí thấp Màu en xuất tỏi en ược làm sâu sắc, màu sắc óng tỏi en ồng ều tỏi en sáng óng có cảm giác miệng tốt, thành phần dinh dưỡng rõ ràng ược cải thiện, tổng hàm lượng axit amin 9% hàm lượng tổng ường 58% ó, tỏi en có tri n vọng thị trường khả cạnh tranh tốt A B C D Hình 3.1 Sinh khối vi khuẩn hình dạng tế bào chủng L1 A: Sinh khối chủng L1 B: Hình dạng tế chủng L1 C: Hình thái khuẩn lạc chủng L2 D: Hình dạng tế chủng L2 Hình 3.2 Khả sinh catalase chủng vi khuẩn 27 Kết ược trình ày Bảng 3.2 cho thấy chủng vi khuẩn ều vi khuẩn gram dương, ều có khả sinh tử, dương tính với catalase trực khuẩn Căn vào ặc i m hình thái, sinh l , sinh hóa chủng nghiên cứu cho thấy hai chủng vi khuẩn có mặt với nồng vi sinh vật cao từ mẫu tỏi en ược lên men mẫu thực phẩm trình lên men ược trì nhiệt cao thời gian dài), có khả sinh n i tử, có khả chịu nhiệt (80°C 30 phút), vi khuẩn gram dương, có khả sinh catalese ối chiếu với ặc i m khóa phân loại Bergey (2004), có th kết luận chủng phân lập ược có khả ều thu c chi Bacillus Theo Qiu Z c ng (2018) dựa vào ặc i m hình dạng tế ào, ặc i m sinh lí, sinh hóa, ặc i m phân ố sản phẩm chứng minh sản phẩm tỏi en lên men có tồn nhóm vi khuẩn Baccillus với mật cao 3.2 Xác định hàm lượng axit sinh môi trường nuôi cấy vi khuẩn Trong trình lên men tỏi, dẫn xuất Terahydro-β-Car oline ược hình thành ằng cách ngưng tụ tryptophan aldehyde, tương tự việc sản xuất axit pyruvic ằng ường Allin-allicin trình phản ứng Maillard [30] Sau trình lên men, sản phẩm tỏi có vị chua dịu vị chua sản sinh hàm lượng axit có th lên men ường tạo tỏi chuy n hóa vi sinh vật Do sản phẩm tỏi en lên men có hàm lượng axit cao nên vi sinh vật tồn tỏi có tiềm sản sinh axit xác ịnh hàm lượng axit sinh trình trao ổi chất vi khuẩn xảy m i trường nu i cấy, khóa luận xác ịnh hàm lượng axit sinh m i trường nu i cấy ược trình ày Bảng 3.3 28 Bảng 3.2 Định lượng khả sinh axit chủng vi khuẩn phương pháp chuẩn độ Therner Kí hiệu chủng vi khuẩn VNaOH chuẩn độ (ml) Độ axit môi trường nuôi cấy (%) L1 4,5 0,41 L2 3,7 0,33 Kết Bảng 3.2 cho thấy, chuẩn m i trường nu i vi khuẩn sau thời gian nu i cấy 48 giờ, hàm lượng axit sinh m i trường nu i cấy chủng vi khuẩn cao Chủng L1 có hàm lượng axit sinh cao chủng L2 0,08% 3.3 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) Hoạt tính phân giải tinh có khả màu với tinh t th dựa màu với Lugol Lugol t tạo màu xanh en Khi tinh t ị thủy phân thành chất có trọng lượng phân tử é màu ó kh ng cịn Vùng suốt tạo nơi enzyme phân hủy chất Hoạt tính th màu Congo ỏ với CMC, thuốc thử Congo ỏ có khả màu với liên kết Hydrogen Polysacarit, CMC ị phân hủy thành chất có trọng lượng phân tử thấp màu kh ng Vùng suốt tạo nơi enzyme phân hủy chất Tiến hành khảo sát khả sinh enzyme ngoại hai chủng vi khuẩn L1 L2 M t phần kết ược trình ày Bảng 3.3 Hình 3.3 29 Bảng 3.3 Đường kính vịng phân giải chất hai chủng vi khuẩn L2 STT Kí hiệu chủng L1 L2 Đường kính vòng phân giải (D – d) mm Thời gian Casein CMC Tinh bột 24h 7,2 ± 0,2 11,0 ± 0,2 11,0 ± 0,1 48h 7,3 ± 0,2 13,0 ± 0,3 12,3 ± 0,2 72h 6,7 ± 0,2 13,0± 0,3 12,0 ± 0,3 24h 45,2 ± 0,3 12,4 ± 0,2 12,0 ± 0,2 48h 45,8± 0,4 12,0 ± 0,3 12,0 ± 0,4 72h 45,0 ± 0,3 11,5 ± 0,3 11,7 ± 0,3 Hình 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng vi sinh vật thời điểm 24h A: Hoạt tính Protease chủng vi khuẩn B: Hoạt tính Cenllulase chủng vi khuẩn C: Hoạt tính Amylase chủng vi khuẩn Kết Bảng 3.3 Hình 3.3 cho thấy hai chủng Bacillus khảo sát ều có khả sinh loại enzyme ngoại Có th ật lồi Bacillus ây m t ặc tính chúng thích nghi tồn với iều kiện m i trường sống phức tạp Chủng L2 có khả sinh loại enzyme ngoại ào, chủng vi 30 khuẩn L2 có hoạt tính protease mạnh ( ường kính vịng kháng khuẩn thời i m 48 45,8mm), chủng L1 có hoạt tính protease thấp (6,7 – 7,2 mm) Hoạt tính cenllulase hoạt tính amylase hai chủng vi khuẩn L1 L2 kh ng có chênh lệch nhiều 3.4 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hạn chế phát tri n vi khuẩn gây ệnh, ngồi việc cạnh tranh vị trí ám dính khả ối kháng với vi khuẩn gây ệnh m t ặc tính quan trọng chủng vi sinh vật ược chọn làm pro iotic Do ó, từ chủng Bacillus phân lập ược, tiến hành n chọn chủng có hoạt tính ối kháng mạnh với chủng vi khuẩn ki m ịnh gồm E coli (gây tiêu chảy, viêm ru t, tạo c tố ường ru t), Salmonella typhimurium (sốt thương hàn, gây tiêu chảy), As pergillus niger Shigell sp ( gây ệnh ường ru t, tiêu chảy người) Tiến hành theo phương pháp 2.5.7, thu ược kết th Bảng 3.4 Bảng 3.4 Khả kháng vi sinh vật kiểm định hai chủng vi khuẩn STT Kí hiệu chủng L1 L2 Đường kính vịng kháng khuẩn (D – d) mm Aspergillus E coli Salmonella Shigella niger 23,0 ± 0,33 12,0 ± 0,3 11,1 ± 0,2 35,3 ± 0.2 15,1 ± 0,21 12,3 ± 0,3 Hình 3.4 Khả kháng vi sinh vật kiểm định hai chủng L1 L2 31 Kết ược trình ày Hình 3.4 Bảng 3.4 cho thấy, hai chủng L1 L2 có khả ối kháng với chủng E coli sp, Smaonella sp, Shigell Kh ng có khả ối kháng với Aspergillus niger Cả hai chủng có khả ối kháng với E.coli mạnh ( ường kính vịng kháng khuẩn hai chủng L1 L2 23mm 35,3mm) E.coli vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm ru t, tạo c tố ường ru t người Chính vậy, tỏi lên men có tác dụng tốt cho hệ tiêu hóa người Cả hai chủng vi khuẩn nghiên cứu có khả ối kháng tốt với Smaonella sp, Shigell 3.5 nh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn 3.5.1 Khảo sát khả chịu nhiệt Nhiệt m t yếu tố m i trường có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng phát tri n chủng trình nu i cấy thực tiễn Ở iều kiện nu i cấy phịng thí nghiệm, chủng nu i cấy thường có m t giá trị nhiệt xác ịnh thích hợp cho trình sinh trưởng phát tri n Do vậy, tiến hành khảo sát khả chịu nhiệt chúng nhiệt khác Kết thu ược Bảng 3.5 Bảng 3.5 nh hưởng nhiệt độ đến chủng Khả chịu nhiệt Ký hiệu chủng vi khuẩn 25°C 35°C 40°C 70°C L1 ++ +++ ++++ ++ L2 ++ +++ ++++ ++ STT + : Sinh trưởng yếu ++ : Sinh trưởng trung bình +++ : Sinh trưởng mạnh ++++ : Sinh trưởng cực mạnh 32 Hình 3.5 Khả chịu nhiệt chủng L2 Từ kết Bảng 3.5 Hình 3.5 tăng nhiệt từ 25 - 35°C khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tăng mạnh Trong khoảng nhiệt 40°C chủng vi khuẩn sinh trưởng mạnh Khi tăng nhiệt chủng vi khuẩn sinh trưởng yếu dần Ở nhiệt từ 35 - từ 40 – 70°C , 70°C hai chủng L1 L2 có khả sinh trưởng Nguyễn Thanh Hải cs (2013) c ng ố khả chịu nhiệt vi khuẩn Bacillus phần lớn có nhiệt vi khuẩn chịu nhiệt với nhiệt sinh trưởng tối ưu từ 30 - 45°C, m t số sinh trưởng tối ưu lên tới 65°C Cho thấy khả chịu nhiệt hai chủng vi khuẩn L1 L2 cao ây i m ật vi khuẩn phân lập từ sản phẩm tỏi lên men 3.5.2 Xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy xác ịnh thời i m nu i cấy thích hợp cho sinh trưởng sinh enzyme chủng L1 L2, nhằm thu nhận sinh khối tế hiệu sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo, tiến hành nu i cấy chủng nghiên cứu LB-lỏng nhiệt 37°C, lắc 150 vòng/phút Thu nhận mẫu thời i m 18, 24, 36, 48 56 Ki m tra mật tế hoạt tính enzyme chủng Kết ược th qua Bảng 3.6 Hình 3.6 33 Bảng 3.6 nh hưởng thời gian nuôi cấy đến tạo thành sinh khối chủng STT Trị số OD600nm chủng Thời gian nuôi cấy (h) L1 L2 18 0,534 0,590 24 0,678 0,786 36 0,981 0,901 48 1,202 1,265 56 1,204 1,270 Hình 3.6 nh hưởng thời gian nuôi cấy đến tạo thành sinh khối chủng vi khuẩn Sau tiến hành nu i cấy hai chủng nghiên cứu m i trường LB agar (pH= 7) Qua số liệu ảng 3.6, nhận thấy sinh trưởng chủng L1 L2 ạt cực ại thời i m 48 (OD600 L1 1,202, OD600 L2 1,265) Trong khoảng thời gian từ 24 – 36 từ 36 – 48 mật vi sinh vật tăng chậm Sau ó, thời i m từ 48 – 56 tiếp theo, mật vi sinh vật tăng kh ng k Nên chúng t i ịnh chọn thời gian nu i cấy tối ưu cho chủng L1 L2 48 34 3.5.3 Xác định ảnh hưởng nồng độ NaCl Hầu hết chủng Bacillus ều ưa mặn, nên mục ích thí nghiệm nhằm xác ịnh khả chịu mặn vi khuẩn có thích hợp với iều kiện lên men hay kh ng Việc nghiên cứu khả chịu mặn chủng vi khuẩn Do vậy, tiến hành khảo sát khả chịu muối chúng nồng kết thu ược Bảng 3.7 Bảng 3.7 nh hưởng nồng độ aC đến hai chủng ồng độ muối (%) 0,2 STT Trị số OD600nm chủng L1 L2 1,723 1,702 1,675 1,623 1,536 1,567 1,234 1,323 0,928 0,878 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ NaCL đến hai chủng L1 L2 Qua kết ảng 3.7 hình 3.7 cho thấy hai chủng L1 L2 ều có khả chịu ược tất nồng NaCL 0,2% nồng vi khuẩn Ở nồng trưởng tốt Mật 1,675 Khi nồng muối NaCL ược khảo sát Và nồng thích hợp ối với sinh trưởng hai chủng NaCL 1% hai chủng L1 L2 ều có khả sinh vi sinh vật OD600 chủng L1 giảm từ 1,723 xuống muối tăng từ 1% lên ến 3, 5% mật giảm xuống iều ó nồng vi sinh vật muối thích hợp hai chủng L1 35 L2 từ 0,2% ến 1% Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), nghiên cứu xác ịnh nồng muối thích hợp cho chủng vi khuẩn Bacillus khoảng 0,2% ến 1% Do vậy, có th dùng nồng muối NaCl cho thí nghiệm 0,2% - 1% 3.5.4 Xác định ảnh hưởng pH môi trường Trị số pH an ầu m i trường có vai trị quan trọng, góp phần tạo iều kiện thuận lợi cho vi khuẩn ồng hóa tổng hợp chất cần thiết Nên pH có ảnh hưởng rõ rệt ến tạo thành sinh khối tế Do ó, pH m t yếu tố quan trọng cần ược nghiên cứu xác ịnh ảnh hưởng pH an ầu ến tạo thành sinh khối tế chủng nghiên cứu, chúng t i nu i cấy chủng LB với iều kiện khảo sát trước, giá trị pH m i trường ược iều chỉnh từ ến Kết ược ánh giá qua số OD600 i u thị mật trung bình ược th Bảng 3.8 Hình 3.8 Bảng 3.8 nh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến tạo thành sinh khối chủng Trị số OD600nm chủng STT (CFU/ml) PH L1 L2 0,65 0,83 0,84 0,82 0,96 1.12 1,34 1,42 1,36 1,38 1,26 1,21 36 Hình 3.8 Ảnh hưởng độ PH đến chủng vi khuẩn L1 L2 Kết trình ày Bảng 3.8 hình 3.8 cho thấy, hai chủng L1 chủng L2 có khả sinh trưởng mạnh tất iều kiện pH nghiên cứu, từ pH acid ến pH kiềm Trong ó, chủng ều sinh trưởng tốt pH = (mật vi sinh vật OD600nm chủng L1 1,34, chủng L2 1,42 Khi giảm từ – mật pH xuống thấp mật vi sinh vật giảm Khi giảm pH dần vi sinh vật chủng L1 giảm từ 1,34 xuống 0,65 Như vậy, pH an ầu tối ưu cho tăng sinh khối tế chủng nghiên cứu 37 CHƯ G 4: KẾT UẬ VÀ KIẾ GHỊ 4.1.Kết luận - phân lập ược chủng vi có khả Bacillus chịu nhiệt từ sản phẩm tỏi en lên men Hai chủng có ặc i m là: + Có khả sinh n i tử, có khả chịu nhiệt( 80°C 30 phút), + Là vi khuẩn gram dương + Có khả sinh catalese - Cả chủng vi khuẩn L1 L2 ều có khả ối kháng mạnh với VK gây ệnh ường tiêu hóa (E coli, Sal Typhimurium Salmonella) - xác ịnh ược khả sinh loại enzyme ngoại - xác ịnh ược nồng muối thích hợp cho sinh trưởng phát tri n chủng vi khuẩn 0,2% - 1% xác ịnh ược khả chịu ược nhiệt - chủng vi khuẩn lên ến 70°C xác ịnh ược iều kiện nu i cấy thích hợp cho sinh khối TB cao nhất: - xác ịnh ược tỉ lệ cấy giống 5%, pH an ầu 5, nhiệt nu i cấy từ 35 - 40°C, thời gian thu sinh khối tế 48 4.2 Kiến nghị Do thời gian hạn chế nên ược tiếp tục chúng t i tiến hành c ng việc sau:  Xác ịnh xác tên loài chủng L1 L2 ằng kĩ thuật sinh học phân tử  Xác ịnh hoạt enzyme chủng L1 L2  Tiến hành lặp lại thí nghiệm 38 tăng tính xác TÀI IỆU THA Kiều Hữu KH O nh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học Công nghiệp, NXB Khoa học v Kỹ thuật, Nội: 105-108 Vũ Bình Dương, Phạm Xuân Phong (2013), Nghiên cứu thành phần hóa học tỏi en L Sơn Tạp chí Y dược lâm sàng: 108 Vũ Bình Dương, Vũ Xuân Nghĩa, Phạm Xuân Phong (2013), Nghiên cứu khả ảo vệ quan tạo máu dịch chiết tỏi en L Sơn chu t ị chiếu xạ Tạp chí Dược học Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long (2012), oxy hóa dịch chiết tỏi en L Sơn ánh giá tác dụng chống ng vật thực nghiệm Tạp chí dược học, số 447 Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho (2013), Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn invitro dịch chiết tỏi (Allium Sativum L) ối với E.Coli gây ệnh E.Coli kháng Ampicillin, Kanamycin Tạp chí Khoa học v Phát triển, tập 11 Nguyễn Lân Dũng and cs (1972), M t số phương pháp nghiên cứu VSV học, NXB Khoa học v Kĩ Thuật, Nguyễn Thành Giáo dục, Nội ạt Nguyễn, Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, NXB Nội tập 23 Nguyễn Thị Hoàng Hải (2009), Nghiên cứu thu nhận enzyme α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP Chí Minh Phạm Hồng H (2006) “ Cây có vị thuốc Việt Nam”, Nh xuất trẻ: 10 Nguyễn Thanh Huyền (2015), Nghiên cứu iến ổi thành phần hóa l tỏi (Allium Sativum L.) Tạp chí Khoa học v Phát triển,tập 32 11 ỗ Tất Lợi (2003) Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXBY học, Nội 12 Nguyễn ức Vượng (2015), Nghiên cứu lên men tỏi en từ tỏi trắng x Quảng Hòa - Quảng Trạch – Quảng Bình Tạp chí thơng tin khoa học v cơng nghệ Quảng Bình, số 13 Lê Ngọc Tú cs (1982), Enzyme vi sinh vật, NXB Khoa học v Kỹ thuật Nội, số 14 Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu n chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ ất vườn sinh protease kiềm, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trường Đại học Sư phạm TP Chí Minh 15 Trần Thanh Thủy (1999), hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB giáo dục 16 Trần Thị Mỹ Trang (2006), Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic sản xuất chế phẩm pro iotic phòng trị ệnh ường ru t cho heo, Trường Đại học Sư phạm TP 17 Chí Minh Thị Thanh Xuân (2008), Nghiên cứu sử dụng nhóm vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí m i trường nước nu i thủy sản, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Nội Tài liệu nước 18 Asdaq SM, Inamdar MN, Asad M (2009) Effect of conventional antihypertensive drugs on hypolipidemic action of garlic in rats Indian J Exp Biol.: 176-181 19 Banerjee, S.K.; Maulik, S.K (2002), Effect of garlic on cardiovascular disorders: A review Nutr J, 1: 1–14 20 Boyd, OP Weng X Sun T Alberico, Laslo M, et al (2011), Nectarine promotes longevity in Drosophila melanogaster Free Radical Bio Med., 50(11): 669-1678 21 Choi S, Cha HM and Lee YS (2014) Physicochemical and Antioxidant Properties of Black Garlic Molecules, 19: 16811-16823 22 Chao L.F., H Guo and Z Li (2012) Research progress in the nutritional value and health effects of black garlic Sci Technol Food Ind., 33(13): 429-432 23 Ejaz S, Woong LC, Ejaz A (2003) Extract of garlic (Allium sativum) in cancer chemopreventions Exp Oncol., 24: 93-97 24 Kim I, Kim JY, Yu-Jin Hwang1, Kyung-A Hwang1, Ae-Son Om2, JaeHyun Kim1 and Kang-Jin Cho1 (2011) The beneficial effects of aged black garlic extract on obesity and hyperlipidemia in rats fed a high-fat diet Journal of Medicinal Plants Research 5(14): 3159-3168 25 Kim J.H., S.H Nam, C.W Rico and M.Y Kang, (2012) A comparative study on the antioxidative and antiallergic activities of fresh and aged black garlic extracts Int J Food Sci Tech., 47: 1176-1182 26 Kim, M.H.; Kim, M.J.; Lee, J.H.; Han, L.J.; Kim, J.H.; Sok, D.E.; Kim, M.R (2012) Hepatoproective effect of aged black garlic on chronic alcoholinduced liver injury in rats J Med Food.,14, 732–738 27 Qiu Z, Lu X, Li N, Zhang M, Qiao X (2018) Characteristics of garlic endophytes isolated from processed black garlic,12: 15 - 19 28 Wang, X, F Jiao, QW.Wang, Wang, K Yang et al., (2012) Aged black garlic extract induces inhibition of gastric cancer cell growth in vitro and in vivo Mol Med Rep, 5: 66-72