Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm tuyển chọn được chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện, tinh sạch được protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi khuẩn E.coli phục vụ nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất được chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ bã thải nhà máy bia.
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM *** Phạm Thùy Dương NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH (DIPTERA) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, tháng năm 2019 DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM *** Phạm Thùy Dương NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSISPHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH (DIPTERA) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 9.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Ngơ Đình Bính TS Lê Đức Khánh Hà Nội, tháng năm 2019 DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ LỜI CẢM ƠN TrTrƣớc tiên, cho phép đƣợc bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Ngơ Đình Bính giáo viên hƣớng dẫn khoa học, ngƣời tạo điều kiện cấp kinh phí cho tơi thực luận án, đồng thời bên truyền dạy kiến thức kinh nghiệm động viên tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin trân trọng cám ơn TS Lê Đức Khánh, ngƣời hƣớng dẫn khoa học, giúp hiểu sâu sắc lĩnh vực khoa học thực luận án cấp kinh phí cho thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi thực phần lớn thí nghiệm phạm vi luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Tăng Thị Chính tập thể cán phòng Vi sinh môi trƣờng-Viện Công nghệ Môi trƣờng tạo điều kiện cho đƣợc sử dụng số thiết bị tận tình giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình thực luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học dân lập Phƣơng Đông, Khoa Công nghệ Sinh học Môi trƣờng động viên tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo, cô giáo, nhà khoa học, đồng nghiệp, bạn bè ngồi trƣờng Đại học Phƣơng Đơng,Viện Cơng nghệ sinh học quan tâm, động viên dẫn cho tơi để tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai bên gia đình nội ngoại ln chỗ dựa vững cho tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn chồng cho thêm sức mạnh, động lực để vƣợt qua khó khăn i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi thực số kết cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc công bố tạp chí chuyên ngành với đồng ý cho phép tác giả Phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày thángnăm 2018 Tác giả ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học 5.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis 1.1.2 Vị trí, đặc điểm hình thái sinh thái học Bacillus thuringiensis 1.1.3 Đặc điểm phân loại 1.1.4 Hệ gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10 1.1.5 Đặc điểm protein độc tố diệt côn trùng 11 1.1.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng sinh tổng hợp độc tố vi khuẩn B thuringiensis 21 1.1.7 Nhu cầu dinh dƣỡng Bacillus thuringiensis 23 1.1.8 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam 26 1.2 Gen cry2 28 1.3 Hệ biểu Escherichia coli 29 1.4 Côn trùng thử nghiệm 31 iii 1.4.1 Ruồi nhà 31 1.4.2 Muỗi 34 1.5 Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis 35 1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT 35 1.5.2 Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B thuringiensis 38 1.5.3 Ảnh hƣởng thuốc trừ sâu sinh học BT đến môi trƣờng ngƣời40 1.5.4 Tồn dƣ thuốc trừ sâu BT 42 1.6 Bã malt bia 44 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Vật liệu 46 2.1.1.Vật liệu, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 46 2.1.2 Chủng vi sinh vật 46 2.1.3 Cặp mồi khuếch đại gen cry2A hệ vector 46 2.1.4 Hóa chất 47 2.1.5 Thiết bị 47 2.1.6 Môi trƣờng nuôi cấy 48 2.1.7 Dung dịch 48 2.2 Địa điểm thời gian thực thí nghiệm 49 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 49 2.3.1 Phƣơng pháp vi sinh 49 2.3.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 50 2.3.3 Phƣơng pháp sinh học phân tử 53 2.3.4 Tối ƣu hóa mơi trƣờng lên men theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt 60 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 64 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66 3.1 Phân lập lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng hai cánh từ chủng Bacillus thuringiensis 66 3.1.1 Phân lập chủng Bacillus 66 3.1.2 Nghiên cứu protein tinh thể 69 3.1.3 Phân loại dƣới loài chủng Bacillus thuringiensis phân lập………… 3.1.4 Đánh giá khả diệt côn trùng hai cánh chủng phân lập 73 iv 3.2 Khẳng định có mặt cry2A liên quan tới tính trạng diệt trùng hai cánh chủng phân lập 74 3.2.1 Phát gen cry2A từ chủng Bacillus thuringiensis phân loại huyết phƣơng pháp PCR 74 3.2.2 Tách dòng đọc trình tự gen cry2A 76 3.2.3 Biểu gen 84 3.2.4 Nghiên cứu tối ƣu điều kiện biểu gen 88 3.2.5 Tinh chế protein tái tổ hợp cột sắc kí lực Probond Nikel Resin 91 3.2.6 Hoạt tính diệt trùng hai cánh rCry2A chủng MSS8.4 92 3.3 Lựa chọn môi trƣờng tối ƣu lên men làm tăng khả hình thành protein tinh thể chủng vi khuẩn MSS8.4từ bã bia 94 3.3.1 Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4 94 3.3.2 Đánh giá tác động độc lập yếu tố dinh dƣỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng sinh tinh thể độc vi khuẩn MSS8.4 100 3.3.3 Tối ƣu hóa mơi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã bia 107 3.4 Nghiên cứu tạo chế phẩm 114 3.4.1 Ảnh hƣởng điều kiện lên men đến sinh trƣởng,hình thành bào tử sinh tinh thể độc chủng MSS8.4 114 3.4.2 Kết thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 126 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ 128 LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết đầy đủ Chữ viết tắt Bp Base pair BSA Bovine serum albumin-albumin huyết bò Bt Bacillus thuringiensis BT Chế phẩm Bacillus thuringiensis Btk Bacillus thuringiensis serova kurstaki CFU Colony Forming Unit dH2O Deionized water DNA Deoxyribonucleotide acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates 10 ĐC Đối chứng 11 E coli Escherichiacoli 12 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 13 EtBr Ethidium Bromide 14 kDa Kilo Dalton 15 Kb Kilo base 16 LB Luria-Bertani- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 17 SDS Sodium dodecyl sulphate SDS- Điện di gel polyacrylamide có chứa sodium PAGE doecyl sunfat 19 Sol Solution- Dung dịch 20 IPTG Isopropyl- β-D-thiogalactoside- Chất cảm ứng 21 TE Tris EDTA 22 X-gal 5- bromo- Cloro- indolyl β- d galactoside 23 MTCS Môi trƣờng sở 24 OD Optical density-Mật độ quang học 25 TCC Tổng tế bào đếm đƣợc (gồm tế bào bào tử sống) 18 vi 26 SC Số bào tử đếm đƣợc 27 TS Tổng chất rắn 28 DTPBB Dịch thủy phân bã bia vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân tích trình tự độc tố cry đại diện với cấu trúc đƣợc nghiên cứu tinh thể tia X 14 Bảng 1.2 Thành phần số môi trƣờng lên men sản xuất chế phẩm BT 23 Bảng 1.3 Thành phần bã malt (%) 44 Bảng 1.4 Thành phần trung bình tro 45 Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy 48 Bảng 2.2 Thành phần nồng độ loại dung dịch 48 Bảng 2.1 Các thí nghiệm đƣợc thiết kế phần mềm design expert 10.1 63 Bảng 3.1 Kết phân loại dƣới loài chủng B thuringiensis phƣơng pháp huyết 72 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính diệt ấu trùng cánh chủng B thuringiensis 73 Bảng 3.3 Thử hoạt tính sinh học rcry2a protein tinh thể từ B thuringiensis với ấu trùng M domestica 88 Bảng 3.4 Hoạt tính diệt trùng protein tinh thể từ chủng MSS8.4 protein tái tổ hợp RCry2A 93 Bảng 3.5.Ảnh Hƣởng Của Phƣơng Pháp Xử Lý Đến Khả Năng Sinh Trƣởngvà Sinh Tổng Hợp Protein Tinh Thể Của MSS8.4 94 Bảng 3.6.Thành Phần Hóa Học Của Dịch Thủy Phân Bã Bia 96 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng tỷ lệ bã bia đến sinh trƣởng, sinh protein tinh thể chủng vi khuẩn MSS8.4 98 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng hữu bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng sinh tổng hợp protein tinh thể 100 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng nguồn khoáng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng sinh tổng hợp protein tinh thể 101 viii LNT7.12 AJ488143.1 1300 1310 1270 1320 1280 1290 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 TATTTTATCCGTAATATTTCTGGGGTTCCTTTAGTTATTAGAAACGAAGATCTAAC AAGA LNT7.12 AJ488143.1 1360 1370 1330 1380 1340 1350 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 CCGTTACACTATAACCAAATAAGAAATATAGAAAGTCCTTCGGGAACACCTGGTGG AGCA LNT7.12 AJ488143.1 1420 1430 1390 1440 1400 1410 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 CGGGCCTATTTGGTATCTGTGCATAACAGAAAAAATAATATCTATGCCGCTAATGA AAAT LNT7.12 AJ488143.1 1480 1490 1450 1500 1460 1470 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 GGTACTATGATCCATTTGGCGCCAGAAGATTATACAGGATTTACTATATCGCCAAT ACAT LNT7.12 AJ488143.1 1540 1550 1510 1560 1520 1530 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 GCCACTCAAGTGAATAATCAAACTCGAACATTTATTTCTGAAAAATTTGGAAATCA AGGT LNT7.12 AJ488143.1 1600 1610 1570 1620 1580 1590 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 GATTCCTTAAGATTTGAACAAAGCAACACGACAGCTCGTTATACGCTTAGAGGGAA TGGA 10 LNT7.12 AJ488143.1 1660 1670 1630 1680 1640 1650 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 AATAGTTACAATCTTTATTTAAGAGTATCTTCAATAGGAAATTCAACTATTCGAGT TACT LNT7.12 AJ488143.1 1720 1730 1690 1740 1700 1710 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 ATAAACGGTAGAGTTTATACTGTTTCAAATGTTAATACCACTACAAATAACGATGG AGTT LNT7.12 AJ488143.1 1780 1790 1750 1800 1760 1770 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 AATGATAATGGAGCTCGTTTTTCAGATATTAATATCGGTAATATAGTAGCAAGTGA TAAT 11 LNT7.12 AJ488143.1 1840 1850 1810 1860 1820 1830 | | | | | | | | | | | | MSS8.4 ACTAATGTAACGCTAGATATAAATGTGACATTAAACTCCGGTACTCCATTTGACCT CATG LNT7.12 .T AJ488143.1 .T 1870 1880 1890 1900 | | | | | | | | MSS8.4 AATATTATGTTTGTGCCAACTAATCTTCCACCACTTTATTAA LNT7.12 AJ488143.1 12 Phụ lục II Các phƣơng án theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng Bảng Các phƣơng án kết theo mơ hình Số TT Bột đậu tƣơng MnSO4 MgSO4 Nồng độ protein tinh thể 4,681 0,099 0,331 0,05 0,45 525,30 3 0,45 484,54 0,1 0,1 457,16 5 0,1 432,48 0,8 430,04 0,1 0,1 465,54 0,1 0,8 482,02 0,1 432,56 10 0,1 0,8 465,05 11 3,276 0,603 481,52 12 4,212 0,091 0,559 506,91 13 4,246 0,083 0,149 495,86 14 3,478 0,088 0,262 511,82 15 3,776 0,036 0,384 511,66 16 3,47 0,076 0,221 513,16 17 3,708 0,053 0,547 520,57 490,47 13 18 4,951 0,024 0,407 477,65 19 3,725 0,03 0,662 504,84 20 1,722 0,092 0,775 503,19 21 1,179 0,059 0,303 498,73 22 1,083 0,051 0,497 504,32 23 1,696 0,032 0,437 507,19 24 1,127 0,023 0,415 488,11 25 1,099 0,003 0,32 461,63 26 4,225 0,052 0,603 509,77 27 4,937 0,045 0,676 484,22 28 1,334 0,053 0,162 488,33 29 3,225 0,092 0,453 518,97 30 1,469 0,039 0,321 501,19 31 2,478 0,072 0,338 521,52 32 3,804 0,027 0,521 506,03 33 3,652 0,066 0,466 523,31 34 1,98 0,022 0,423 503,34 35 4,767 0,043 0,288 492,29 36 1,881 0,027 0,624 506,84 37 4,237 0,021 0,572 491,81 38 2,295 0,051 0,337 519,08 14 39 3,509 0,094 0,171 500,95 40 2,15 0,009 0,58 493,47 41 3,299 0,011 0,468 496,59 42 2,191 0,002 0,537 485,78 43 1,158 0,018 0,791 479,58 44 2,146 0,083 0,711 516,26 45 3,956 0,045 0,388 513,80 46 4,342 0,065 0,789 496,56 47 1,487 0,009 0,237 470,93 48 1,054 0,085 0,448 498,33 49 4,06 0,007 0,574 480,40 50 3,333 0,004 0,663 483,70 51 1,518 0,085 0,406 507,63 52 3,009 0,008 0,534 494,71 53 2,13 0,036 0,333 510,98 54 2,931 0,092 0,421 518,99 55 2,982 0,339 481,14 56 3,093 0,041 0,419 520,90 57 3,61 0,004 0,17 471,03 58 4,362 0,018 0,771 473,70 59 2,17 0,09 0,404 515,32 15 60 1,08 0,049 0,403 500,59 61 2,164 0,024 0,113 483,37 62 4,179 0,086 0,42 510,64 63 4,166 0,032 0,461 503,87 64 4,723 0,009 0,154 456,42 65 1,686 0,077 0,29 507,04 66 4,437 0,067 0,344 507,89 67 1,747 0,055 0,424 516,91 68 2,382 0,059 0,656 523,86 69 2,032 0,05 0,76 514,16 70 4,229 0,011 0,203 473,50 71 4,873 0,071 0,14 484,48 72 3,006 0,088 0,565 521,70 73 3,943 0,07 0,123 500,76 74 4,369 0,004 0,482 471,83 75 4,956 0,01 0,543 461,82 76 2,826 0,093 0,464 519,22 77 3,652 0,032 0,411 511,28 78 1,019 0,09 0,611 496,70 79 4,794 0,025 0,497 482,98 80 1,091 0,057 0,16 482,26 16 81 4,581 0,028 0,75 478,67 82 4,832 0,097 0,32 487,54 83 3,766 0,037 0,288 508,33 84 1,764 0,015 0,234 482,19 85 3,438 0,059 0,53 524,95 86 1,558 0,052 0,789 506,83 87 3,005 0,05 0,742 517,43 88 3,146 0,061 0,158 510,00 89 3,415 0,097 0,472 514,97 90 3,093 0,056 0,581 525,96 91 4,101 0,045 0,792 497,17 92 1,001 0,014 0,488 479,11 93 4,424 0,097 0,18 488,28 94 3,097 0,086 0,138 503,10 95 4,009 0,049 0,338 512,85 96 2,118 0,088 0,437 516,89 97 1,229 0,063 0,466 508,53 98 2,696 0,027 0,289 506,38 99 4,223 0,019 0,688 484,55 100 4,524 0,099 0,575 494,77 17 Bảng Các phƣơng án nằm vùng tối ƣu Nồng độ protein tinh thể Số TT Bột đậu tƣơng MnSO4 MgSO4 0,05 0,45 525,30 17 3,708 0,053 0,547 520,57 29 3,225 0,092 0,453 518,97 31 2,478 0,072 0,338 521,52 33 3,652 0,066 0,466 523,31 38 2,295 0,051 0,337 519,08 44 2,146 0,083 0,711 516,26 54 2,931 0,092 0,421 518,99 59 2,17 0,09 0,404 515,32 67 1,747 0,055 0,424 516,91 68 2,382 0,059 0,656 523,86 72 3,006 0,088 0,565 521,70 76 2,826 0,093 0,464 519,22 85 3,438 0,059 0,53 524,95 87 3,005 0,05 0,742 517,43 90 3,093 0,056 0,581 525,96 96 2,118 0,088 0,437 516,89 18 Phụ lục III Bản đồ vec tơ biểu pET22b(+) 19 PhụlụcIV.Phiếukếtquảphântíchmẫu 20 ... mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng số côn trùng hai cánh Xuất phát từ thực tiễn tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế. .. xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng hai cánh từ vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn đánh giá sơ hiệu diệt côn trùng hai cánh chế phẩm phòng thí nghiệm ngồi thực địa Những đóng góp luận án -...BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VI N KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VI T NAM *** Phạm Thùy Dương NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSISPHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI