Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactobacillus ứng dụng trong tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt đƣợc khóa luận tốt nghiệp trƣờng đại học Lâm Nghiệp Xuân Mai – Chƣơng Mỹ - Hà Nội xin chân thành cảm ơn: Quý thầy (cô) trƣờng đại học Lâm Nghiệp , ban giám hiệu nhà trƣờng tận tình giảng dậy tạo điều kiện thuận lợi cho vật chất lẫn tinh thần suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Gia đình ngƣời thân, bạn bè giúp đỡ mặt để tơi hồn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Bùi Văn Thắng Th.S Nguyễn Thị Hồng Nhung viện Công Nghệ Sinh Học trƣờng đại học Lâm Nghiệp, dành nhiều thời gian q báu, tận tình hƣớng dẫn tơi suốt thời gian thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Mặc dù có nhiều cố gắng, thời gian có hạn trình độ chun mơn hạn chế, thân bƣớc đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, nên đề tài khơng tránh khỏi thiếu sót Kính mong q thầy, giáo bạn bè đồng nghiệp quan tâm góp ý để đề tài đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên thực Đinh Thị Hồng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu probiotic 1.1.2.Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic 1.1.3 Đặc điểm chung vi sinh vật probiotic 1.1.4 Cơ chế tác động chung probiotic 1.1.5 Vai trò probiotic vật nuôi 10 1.1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt Nam 11 1.2 Tổng quan Lactobacilus 14 Chƣơng MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu nghiên cứu 18 2.4 Môi trƣờng nghiên cứu 19 2.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.5.1 Phân lập chủng vi sinh vật hữu ích 19 2.5.2 Phƣơng pháp định lƣợng axit lactic theo Therner 20 2.5.3 Xác định mật độ TB phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 20 2.5.4 Tuyển chọn chủng có đặc tính probiotic 21 2.5.5 Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi sinh vật 24 ii 2.5.6 Khảo sát ảnh hƣởng nhân tố đến sinh trƣởng chủng vi khuẩn lactic 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 28 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn 28 3.2.Tuyển chọn vi khuẩn có khả làm chế phẩm vi sinh 30 3.2.1 Khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn 30 3.2.2 Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định 31 3.2.3 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 33 3.2.4 Khảo sát khả chịu pH dày 35 3.2.5 Khả chịu muối mật 36 3.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 37 3.4 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trƣởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 39 3.4.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy 40 3.4.3.Ảnh hƣởng nguồn Cacbon 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT C CFU Cacbon Colony forming unit (mật độ tế bào) CMC Carboxymethyl cellulose cs cộng ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc G- Gram âm G+ Gram dƣơng Ký hiệu Chú thích LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) MRS Man, Rogosa and Sharpe OD RNA Optical Density (Mật độ quang) Ribose nucleic acid Stt Số thứ tự TB Tế bào WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt số thơng tin vài sản phẩm probiotic có mặt thị trƣờng 14 Bảng 1.2 Phân loại Lactobacillus 15 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học 29 chủng vi sinh vật hữu ích 29 Bảng 3.2 Khả sinh axit lactic chủng 30 Bảng 3.3 Khả kháng vi khuẩn kiểm định chủng lactic 31 Bảng 3.4 Khả sinh enzym ngoại bào chủng 33 Bảng 3.5 Tỷ lệ sống sót chủng vi khuẩn LT7 C2 độ pH khác 35 Bảng 3.6 Tỷ lệ sống sót chủng vi khuẩn LT7 C2 nồng độ muối mật khác 36 Bảng 3.7 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn 37 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh trƣởng (OD600) .39 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng pH ban đầu đến khả sinh trƣởng (OD600) 40 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh trƣởng hai chủng vi khuẩn (OD600) 41 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh tế bào Lactobacillus 16 Hình 3.1 Khả kháng Ecoli chủng lactic 32 Hình 3.2.Khả kháng Salmonella chủng lactic 32 Hình 3.3.Khả kháng Shigella chủng lactic 32 Hình 3.4.khả sinh enzym ngoại bào chủng vi khuẩn lactic 34 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc tiêu nhuộm gram chủng LT7 38 Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc tiêu nhuộm gram chủng C2 38 Hình 3.7 Đồ thị ảnh hƣởng nhiệt độ đến tạo thành sinh khối chủng Lactobacillus 39 Hình 3.8 Đồ thị ảnh hƣởng pH ban đầu đến tạo thành sinh khối chủng Lactobacillus 40 Hình 3.9 Đồ thị ảnh hƣởng nguồn cacbon đến tạo thành sinh khối chủng Lactobacillus 42 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xƣa đến nay, chăn nuôi gia súc, gia cầm ngành kinh tế mũi nhọn nƣớc ta Do đó, vấn đề dịch bệnh, suất chất lƣợng sản phẩm thịt đƣợc đặt lên hàng đầu Trong bệnh thƣờng gặp động vật bệnh đƣờng ruột bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng Trong đó, tiêu chảy hội chứng hay gặp gây thiệt hại nặng nề cho nhà chăn ni Có nhiều biện pháp đƣợc áp dụng để phòng trị tiêu chảy, việc dùng kháng sinh lựa chọn hàng đầu ngƣời chăn nuôi Dù biện pháp có hiệu cao, nhƣng gần có nhiều lo ngại hàm lƣợng kháng sinh tồn dƣ sản phẩm sau thu hoạch ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời tiêu thụ Việc lạm dụng kháng sinh mức gây nguy kháng kháng sinh chủng gây bệnh, ảnh hƣởng khó khăn cho việc điều trị kiểm sốt dịch bệnh Chính lí mà phƣơng pháp phịng trị bệnh liệu pháp sinh học ngày đƣợc ƣa chuộng nhƣ vacxin, chất tăng cƣờng hệ miễn dịch, chế phẩm vi sinh,…Trong đó, chế phẩm vi sinh đƣợc xem phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm vƣợt trội, hiệu lâu dài an toàn sinh học Nó khơng giúp phịng chống bệnh tật thơng qua việc đối kháng trực tiếp với vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột đặc biệt E coli gián tiếp thơng qua kích thích hệ miễn dịch vật ni, trì vi sinh vật có lợi mà cịn giúp vật nuôi sinh trƣởng phát triển tốt Hiện nay, có nhiều thƣơng hiệu chế phẩm sinh học lƣu hành thị trƣờng Việt Nam Các chế phẩm chủ yếu có nguồn gốc nhập ngoại sản xuất nƣớc Các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp.,… Trong số đó, vi khuẩn Lactobacillus đƣợc xem đối tƣợng giàu tiềm để tạo chế phẩm vi sinh Do Lactobacillus khả tồn đƣờng tiêu hóa mà cịn sinh chất kháng khuẩn kìm hãm vi sinh vật gây bệnh Ngồi ra, nhóm vi khuẩn cịn chuyển hóa chất khó tiêu thành chất dễ tiêu làm cải thiện dinh dƣỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn giúp vật ni tăng trọng nhanh Đặc biệt, chế phẩm vi sinh từ Lactobacillus dễ bảo quản không gây hại cho ngƣời động vật Chính tơi tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi” CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu probiotic Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu năm cuối kỷ 19, nhà vi sinh vật học phát khác biệt hệ vi sinh vật ống tiêu hóa ngƣời bệnh ngƣời khỏe mạnh Hệ vi sinh vật có ích hệ thống ống tiêu hóa đƣợc gọi probiotic Năm 1870, nghiên cứu ngƣời nơng dân Bungary có sức khỏe tốt, nhà sinh lý học ngƣời Nga Eli Metchnikoff đƣa thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen “vì sống” để vi sinh vật đƣợc chứng minh có ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe ngƣời động vật [24] Năm 1925, Beach ngƣời có nghiên cứu thực nghiệm thức ăn có chứa “Lactobacillus acidophilus” [20] Năm 1968, King nghiên cứu thành công việc kích thích tăng trƣởng heo thức ăn có bổ sung L acidophilus [29] Khái niệm sau đƣợc làm rõ Fuller (1989) Probiotic “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống có ảnh hƣởng có lợi đến vật chủ việc cải thiện cân hệ vi sinh vật ruột nó” [26] Năm 2001, Schrezenmeir DeVrese định nghĩa: “Probiotic lƣợng vi sinh vật sống xác định với số lƣợng thích hợp đƣợc chuẩn bị sản phẩm, có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật đƣờng ruột ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe vật chủ [37] Theo định nghĩa FAO/WHO năm 2002: “Probiotic vi sinh vật sống đƣợc kiểm sốt chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” Đây định nghĩa đƣợc chấp nhận nhiều [25] Ngày nay, chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng hiệu chăn nuôi, đặc biệt nuôi trồng thủy sản, trồng trọt, bảo vệ sức khỏe ngƣời bảo vệ môi trƣờng 1.1.2.Vi sinh vật sử dụng làm probiotic Gồm nhiều nhóm khác nhƣ vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc Tuy nhiên, đặc tính ƣu việt vi khuẩn lactic phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời nhƣ vật nuôi nên thành phần hầu hết chế phẩm probiotic chủ yếu chủng lactic Một số nhóm vi sinh vật probiotic thƣờng gặp  Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen (1999), số loại chế phẩm probiotic đƣợc biết đến nhiều với chủng LAB, chủ yếu loài thuộc chi Lactobacillus Streptococcus nhƣ L acidophilus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L kefir, L delbruckii, L sporogenes, Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis,… [30] Những chủng chịu đựng nhiệt độ nhƣ tác động trình sản xuất thuốc, không tƣơng tác với thành phần bổ sung thêm chế phẩm nhƣ vitamin, acid amin, acid béo, đƣờng đặc biệt fructoligosaccharide, tá dƣợc đƣợc dùng phổ biến hầu hết chế phẩm probiotic Các chế phẩm probiotic sử dụng chủng LAB (nhƣ L acidophilus hay L sprorogenes,…) kết hợp nhiều chủng LAB (L acidophilus, L sprorogenes, L kefir, Streptococcus faecalis,…) Sử dụng chế phẩm probiotic Các chế phẩm probiotic sử dụng chủng LAB (nhƣ L acidophilus hay L sprorogenes,…) kết hợp nhiều chủng LAB (L acidophilus, L sprorogenes, L kefir, Streptococcus faecalis,…) Sử dụng chế phẩm probiotic – lactic liệu pháp tốt cho trƣờng hợp rối loạn đƣờng tiêu hóa, giúp trì hệ vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu nhiều trƣờng hợp bệnh khác nhờ tác dụng thể ngƣời [12, 37]  Bacillus subtilis (B subtilis) vi khuẩn ứng dụng làm probiotic từ sớm Chúng đƣợc sử dụng qua đƣờng uống để phòng chữa rối loạn tiêu chủng LT7 C2 có khả sống mơi trƣờng pH thấp dày, sử dụng cho nghiên cứu 3.2.5 Khả chịu muối mật Trong hệ tiêu hóa, sau trải qua điều kiện khắc nghiệt pH thấp dày, vi khuẩn lại phải tiếp xúc với acid mật muối mật đƣờng ruột Acid mật đƣợc coi chất kháng khuẩn đƣờng tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi xâm nhập vi sinh vật gây bệnh Do vậy, vi sinh vật probiotic qua ruột non chịu tác động acid mật Khả chịu đựng acid mật tiêu chuẩn chọn lọc vi sinh vật probiotic Vì thế, chúng tơi tiến hành khảo sát khả chịu muối mật chủng với nồng độ muối mật 0,5; 1; 2; 3% thời điểm 0; 1; Theo phƣơng pháp 2.5.4.4 Kết đƣợc trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Tỷ lệ sống sót chủng vi khuẩn LT7 C2 nồng độ muối mật khác Ký hiệu Thời gian xử chủng LT7 C2 Tỉ lệ tế bào sống sót (%) nồng độ muối mật khác lý (giờ) 0,5% 1% 2% 3% 100 100 100 100 90,2 83,3 71,4 64,6 94,3 76,5 68,3 58,9 97,6 66,5 54,2 52,6 100 100 100 100 89,6 83,3 75,9 70,2 94,3 77,1 69,4 60,2 95,2 60,8 52,8 49,8 Qua số liệu bảng 3.6 cho thấy, chủng có khả chịu muối mật tốt Tỷ lệ sống sót giảm dần theo thời gian theo nồng độ muối mật Sau nồng độ muối mật 0,5% cho tỷ lệ sống sót cao (cả hai chủng LT7 C2 lần 36 lƣợt 97,6% 95,2%) giảm dần đến nồng độ muối mật 3% 52,6% 49,8% lần lƣợt chủng LT7 C2 So sánh với kết nhóm tác giả Phạm Ngọc Lan (2003) khả chịu muối mật chủng làm probiotic chịu đƣợc mơi trƣờng có 0,5, 1, 3% muối mật , 10 lớn 40% Cho thấy khả chịu muối mật chủng LT7 C2 cao Đây ƣu điểm bật chủng vi khuẩn sử dụng làm probiotic Qua bƣớc tuyển chọn định chọn chủng LT7 C2 cho nghiên cứu 3.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn đặc điểm phân loại vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống Kết thu đƣợc bảng 3.7 hình 3.5, 3.6 Bảng 3.7 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Kí hiệu chủng LT7 C2 Trịn, trắng sữa, bề mặt ƣớt, mép trơn, đƣờng kính 1.5 2.5mm Que dài Trịn, trắng sữa bề mặt lồi, trơn, kích thƣớc lớn 2-3mm Nhuộm gram + + Hoạt tính catalase - - Sinh bào tử - - Khả di động - - Kiểu lên men + + Khả sinh khí - - Đặc điểm hình Que dài thái tế bào Ghi chú: (+): Có hoạt tính catalase dƣơng tính, gram dƣơng, sinh bào tử, có khả di động, lên men đồng hình có sinh khí (-): Có hoạt tính catalase âm tính, gram âm, khơng sinh bào tử, khơng có khả di động, lên men dị hình khơng sinh khí 37 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc tiêu nhuộm gram chủng LT7 Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc tiêu nhuộm gram chủng C2 Hai chủng vi khuẩn lactic có tế bào hình que dài, gram dƣơng, không di động, không sinh bào tử, lên men đồng hình Khuẩn lạc trịn lồi, kích thƣớc dao động từ 1,5÷3,0 mm, màu trắng sữa, mép trơn, có mùi chua thơm đặc điểm dễ nhận thấy phân lập vi khuẩn lactic Theo Okada, 1992 đặc tính catalaza âm tính giúp khẳng định xác kiểu lên men đồng hình nhƣ đặc tính kị khí khơng bắt buộc Theo khóa phân loại Bergey (2004), dựa vào kết hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa thu đƣợc Chúng tơi kết luận chủng thu đƣợc thuộc chi Lactobacillus [36] 38 3.4 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trƣởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy yếu tố mơi trƣờng có ảnh hƣởng mạnh đến sinh trƣởng khả sinh tổng hợp chất vi sinh vật Để tìm đƣợc nhiệt độ tối ƣu cho chủng vi khuẩn Lactobacillus phát triển tốt nhất, nuôi chủng LT7 C2 điều kiện lắc 180 vịng/phút, mơi trƣờng MRS dịch thể nhiệt độ khác từ 25-400C Sau 48 nuôi cấy thu dịch lên men đo OD600 Kết đƣợc trình bày bảng 3.8 hình 3.7 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh trƣởng (OD600) Nhiệt độ nuôi cấy (oC) Ký hiệu chủng 25 30 35 40 LT7 0,853 1,884 2,247 1,771 C2 0,759 1,713 2,223 1,703 2.5 OD600 1.5 LT7 C2 0.5 25 30 35 40 Nhiệt độ 0C Hình 3.7 Đồ thị ảnh hƣởng nhiệt độ đến tạo thành sinh khối chủng Lactobacillus 39 Kết đƣợc trình bày bảng 3.8 hình 3.7 cho thấy nhiệt độ ni cấy tăng mật độ chủng LT7 C2 tăng theo Khi nhiệt độ tăng từ 25 - 300C mật độ bắt đầu tăng dần nhiệt độ tăng đến 350C chủng sinh trƣởng tốt, đặc biệt mật độ tế bào cao 350C Sau đó, nhiệt độ tăng lên 400C chủng sinh trƣởng yếu dần nhƣng sống sót Nhƣ chủng có khả sinh trƣởng khoảng nhiệt độ từ 25 - 400C nhƣng sinh trƣởng mạnh nhiệt độ 350c Kết phù hợp với nghiên cứa Trần Thị Thu Thủy (2003) 3.4.2 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy Trị số pH ban đầu mơi trƣờng có ảnh hƣởng rõ rệt đến tạo thành sinh khối tế bào Do pH nhân tố quan trọng cần đƣợc nghiên cứu Để xác định ảnh hƣởng pH ban đầu đến tạo thành sinh khối tiến hành nuôi chủng LT7 C2 điều kiện lắc 180 vịng/phút mơi trƣờng MRS dịch thể có pH khác (pH = 5, pH = 6, pH = 7, pH = 8) nhiệt độ 370C 48 Kết nghiên cứu đƣợc trình bày bảng 3.9 hình 3.8 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng pH ban đầu đến khả sinh trƣởng (OD600) Ký hiệu chủng pH nuôi cấy 1,801 2,244 1,894 2,119 1,589 1,702 LT7 C2 2,072 1,917 2.5 OD600 1.5 LT7 C2 0.5 pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 pH ban đầu Hình 3.8 Đồ thị ảnh hƣởng pH ban đầu đến tạo thành sinh khối chủng Lactobacillus 40 Kết trình bày bảng 3.9 hình 3.8 cho thấy chủng LT7 C2 có khả sinh trƣởng dải pH rộng, pH tăng từ 5-7 mật độ tế bào tăng theo cao pH = (OD600 = 2,244 chủng LT7, OD600 = 2,119 chủng C2) Sau pH tăng lên mật độ tế bào giảm Nhƣ pH ban đầu thích hợp cho chủng phát triển tốt pH = Kết phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Đức Nhƣ Quỳnh (2008), Trần Thị Mỹ Trang (2006) 3.4.3.Ảnh hưởng nguồn Cacbon Mỗi sinh vật trình sinh trƣởng phát triển cần đƣợc cung cấp nguồn C để sinh tổng hợp vật liệu tế bào tạo lƣợng cần cho hoạt động sống Việc lựa chọn nguồn C thích hợp quan trọng nhằm tìm nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm mà đảm bảo cho vi sinh vật phát triển để thu sinh khối tế bào cao Tiến hành đem nuôi chủng vi khuẩn LT7 C2 370C, 48 môi trƣờng MRS dịch thể có khác nguồn cacbon Gồm mơi trƣờng + Môi trƣờng MRS I: chứa glucose: 2% (20g/l) + Môi trƣờng MRS II: chứa lactose: 2% (20g/l) + Môi trƣờng MRS III: chứa saccharose: 2% (20g/l) Kết nghiên cứu đƣợc trình bày bảng 3.10 hình 3.9 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh trƣởng hai chủng vi khuẩn (OD600) Ký hiệu chủng Nguồn Cacbon MRS I MRS II MRS III LT7 2,256 1,970 1,823 C2 2,184 1,842 1,780 41 2.5 OD600 1.5 LT7 C2 0.5 MRS I MRS II MRS III Nguồn cacbon Hình 3.9 Đồ thị ảnh hƣởng nguồn cacbon đến tạo thành sinh khối chủng Lactobacillus Qua kết khảo sát ta thấy tốc độ sinh trƣởng chủng nghiên cứu khơng có khác biệt lớn thể qua mật độ tế bào OD600 có chênh lệch khơng đáng kể Nhƣ chủng nghiên cứu có khả sử dụng đƣợc nhiều nguồn C khác để sinh trƣởng phát triển, số nguồn C (glucose, saccharose lactose) đƣợc khảo sát, nguồn C glucose cho mật độ cao (OD600=2,256 chủng vi khuẩn LT7 OD600=2,184 chủng vi khuẩn C2) 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ nghiên cứu trên, thu đƣợc kết sau: Từ sản phẩm muối chua, phân lập đƣợc 11 chủng vi khuẩn LT1, LT2, LT3, LT7, L1, L2, L3, C2, M1, M3, CP Tuyển chọn đƣợc chủng LT7 C2 có tiềm sử dụng làm chế phẩm vi sinh nhƣ: - Đã xác định đƣợc khả đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nhƣ: (E coli , Salmolena, Shigella) Có vịng kháng mạnh E.coli (D - d= 25 ± 27); trung bình Salmolena (D - d= 14 ± 16 mm) Shigella (D - d= 10 ± 12 mm) - Đã xác định đƣợc khả sinh loại enzyme ngoại bào: Trong protease có hoạt tính mạnh (D - d= 26 ± 30 mm), celulase có hoạt tính mạnh (18 ± 24mm) cịn hoạt tính amylase mức trung bình (D - d= 10 ± 15 mm) - Đã xác định đƣợc khả chịu pH thấp dày với tỉ lệ sống sót cao sau 180 phút khảo sát, với pH=2 sau chủng LT7 C2 có % sống sót lần lƣợt 40,1 41,8 - Đã xác định đƣợc khả chịu muối mật ruột non Ở nồng độ muối mật cao 3% sau chủng LT7 C2 lần lƣợt 45,6 41,2 3.Khảo sát đƣợc đặc tính sinh lý sinh hóa chủng lactobacillus LT7 C2 Đã khảo sát đƣợc điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng Lactobacillus LT7 C2 là: Nhiệt độ: 350C; pH=7; nguồn C glucose với nồng độ 2% Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp, trình độ chun mơn cịn hạn chế nên tơi thực tất nội dung nghiên cứu cách sâu sắc Do đó, có điều kiện tiếp tục nghiên cứu vấn đề này, xin đề nghị nghiên cứu tiếp số nội dung sau: 43 - Nghiên cứu khả kháng kháng sinh, khả bám dính vào niêm mạc ruột chủng phân lập đƣợc -Định danh đến loài chủng LT7 C2 phƣơng pháp sinh học phân tử - Tạo chế phẩm thử nghiệm chế phẩm chăn nuôi 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ệu Tiếng Việt Nguyễn La Anh cs (2003), Giáo trình VSV Cơng nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, tr.100-108 Lê Thanh Bình, Phân lập sàng lọc số chủng Bacillus có hoạt tính probiotic ni trồng thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM, tr 8-11, 17-19 Hồ Lê Huỳnh Châu, Hồ Trung Thông, Khảo sát khả chịu pH số chủng lactic, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM Phạm Thị Trân Châu (2007), Công nghệ sinh học (tập 3), NXB Giáo dục Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hòa (2005), Vi sinh vật y học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Hội Chăn nuôi Việt Nam (2008), “Probiotic - lợi ích triển vọng”, Tạp chí chăn ni, 08 (1), tr.5-9 Phạm Khắc Hiếu, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tƣờng Vy, Trần Thu Hoa (2007), Khảo sát khả chịu đựng acid, muối mật KS số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống, Tạp chí dƣợc học (378) Trần Thị Ái Liên (2011), Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM, tr 7-9, 39-40 Lã Văn Kính (1998) Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 112-152 10 Phạm Ngọc Lan (2003) Nghiên cứu tuyển chọn chủng lactic có khả chịu acid muối mật Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM 11 Nguyễn Đức Quỳnh Quyên (2008) Nghiên cứu tuyển chọn số chủng Bacillus làm probiotic chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM 12 Phạm Thị Minh Tâm (2008), Khảo sát định danh số sản phẩm probiotic có Lactobacillus acidophilus kit API 50CHL, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, (20) 13 Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzyme vi sinh vật Nxb Khoa học Kỹ thuật 14 Trần Thị Thu Thủy (2003), Khảo sát tác dụng thay KS probiotic phòng ngừa tiêu chảy E coli heo con, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Trƣờng ĐH Nông lâm Tp HCM, tr 21-24, 28-43 15 Văn Thị Thủy (2011), Phân lập chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao ni cá tra, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM, tr 36, 52-54 16 Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Đỗ Anh Tuấn (2004), Giáo trình thực tập Bioinformatic, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh, Lƣu hành nội 17 Trần Thị Mỹ Trang (2006), Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng trị bệnh đường ruột cho heo, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM, tr 58-60 18 Phạm Hùng Vân (2007), Bacilulus clausii vai trò probiotics điều chị tiêu chảy, Hội thảo chuyên đề Hội nhi khoa Tp HCM 19 Đào Thị Thanh Xuân (2008), Nghiên cứu sử dụng nhóm vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí mơi trường nước ni thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Hà Nội, tr 15-27, 32-35, 47-53 ệu Tiếng Anh 20 Beach; Fortuero; Liong Min Tze, “In-vivo and in-vitro cholesterol removal by Lactobacilli and Bifidobacteria”, A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy, School of Molecu 21 Breton J and Munoz A., Effects of probiotics in the incidence and treatment of neonatal diarrhea, 15th International Pig Veterinary Society Congress Nottingham University Press: pp 24-32, 1998 22 Bergey manual of Systematic bacteriology, 2004 23 Saga, B C., (2003), Hemicellulose bioconversion J Ind Microbiol Biotechnol 24 Eli Metchni Koff; Green Edward and Grammell Renia (2003), “Lactic acid production”, World Intellual Property Organization, International Publication Number WO 03/008601, pp 20-23 25 FAO/WHO Working Group (2002), “Guideline for the evaluation of probiotic in food” Food and Agriculture Organizatin of the United Nations 26 Fuller R., ’’Probiotics in man and animals”, J Appl Bacteriol: 66, pp 65–78, 1989 27 Galassi G.; Sandrucci A.; Tamburini A.; Succi G., "Energy utilization of a low N-diet added with an antibiotic or with a probiotic in fattening pigs," in Animal physiology – Nutrition, Proceedings of the 15th symposium on energy metabolism in animals, Wageningen, p 145-148, 2001 28 Jensen, H., Grimmer, S., Axelsson, L (2012) ”In vitro testing of commercial and potential probiotic lactic and bacteria”, Int J Food Microbiol 29 King (1968) “Characterization and purification of a bacteriocin produced by a potential probiotic culture, Lactobacillus acidophilus 30SC”, J Dairy Sci, pp.2747-2752 30 Lee, Mototo, Saminen "Energy utilization of a low N-diet added with an antibiotic or with a probiotic in fattening pigs," in Animal physiology – Nutrition, Proceedings of the 15th symposium on energy metabolism in animals, Wageningen, p 145-148, 2001 31 Lema, and Reller L.B., (2001), “Bile – Esculin test for presiumptive identication of enterococci and streptococci: effect of bile concentration, inoculation technique, and incubation time” J Clin Microbial, vol 36, pp 1135 – 1136 32 Luc Shiming , Gonzalez M.P and Patstoriza L (1999), “A method for bacteoricin quantification”, Journal of Applied Microbiology, vol 87, pp 907914 33 Navas - Sanchez and Munoz A., ”The immune system of poultry” J Appl Bacteriol 34 Okada (1992), Netherwood T., Gilbert H.J., Parker D.S and O’Donnell A.G., ”Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointetinal tract”, Appl Environ Microbiol: 65, pp 5134-5138, 1999 35 Pot (1994) “Study on the bacteriocin produced by Lactobacillus sản phẩm GM 7311” Department of Microbiology college of nature Science Pukyong National University 36 Reverdin, Denneis F., Marmonier A., Vargues (1996), ”Bacteriologie medicale techniques usuelles”, SIMEP SA Paris, France 37 Navas Sánchez, Yannellys; Quintero Moreno, Armando; Ventura, Max; Casanova, Angel; Páez, Angel y Romero, Santos (1995), “Use of probiotics in the feeding of pigs in the postweaning phase”, Revista Científica, 5(3): pp 193198, 38 Simon, (2001), “Bacteria and gastrointestinal secretion and motility” Scand J Gastroenterol, vol 19, pp 114-121 39 Therner ”The use of bacterial spore formers as probiotics, FEMS Microbiol Rev” 40 Tortuero, Fernandez (1995), “Effective recovery of bacteria DNA and percent-guanine-plus-cytosin-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens”, Appl Environ Microbiol: 64, pp 4084 - 4088., 1998 PHỤ LỤC 1.Phụ lục hình LT2 LT3 M1 Hình L.1.Hình ảnh nhộm gram chủng LT2, LT3, M1 LT7 C2 Hình L2.Khả sinh catalase di động chủng LT7 C2 LT1 LT3 M3 Hình L3 Hình ảnh khuẩn lạc chủng lactic Phụ lục bảng Bảng H1 Mật độ tế bào chủng vi khuẩn LT7 C2 nồng độ muối mật khác Ký hiệu chủng LT7 C2 Thời gian xử lý (giờ) giờ giờ giờ Mật độ tế bào sống sót nồng độ muối mật khác 0,5% 2,45 x 109 2,21 x 109 2,31 x 109 2,39 x 109 2,11 x 109 1,89 x 109 1,99 x 109 2,01 x 109 1% 2,21 x 109 1,84 x 109 1,69 x 109 1,47 x 109 2,09 x 109 1,74 x 109 1,61 x 109 1,27 x 109 2% 2,27 x 109 1,62 x 109 1,55 x 109 1,23 x 109 1,99 x 109 1,51 x 109 1,38 x 109 1,05 x 109 3% 1,92 x 109 1,24 x 109 1,13 x 109 1,01 x 109 2,01 x 109 1,41 x 109 1,21 x 109 1,0 x 109 Bảng H2 Mật độ tế bào chủng vi khuẩn LT7 C2 nồng độ pH khác Ký hiệu chủng LT7 C2 pH Mật độ tế bào sống sót mức pH khác 4 1,29 x 109 1,87 x 109 2,43 x 109 1,45 x 109 1,61 x 109 2,01 x 109 1,21 x 109 1,65 x 109 1,86 x 109 1,33 x 109 1,42 x 109 1,59 x 109 1,11 x 109 1,31 x 109 1,24 x 109 1,17 x 109 1,20 x 109 1,21 x 109 1,02 x 109 1,29 x 109 1,09 x 109 1,06 x 109 1,07 x 109 1,0 x 109