Nghiên cứu phân lập phân loại bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực vườn bách thảo hà nội

1 VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN VĂN BẮC Nghiên cứu Phân lập, phân loại, bảo quản số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza v xenlulaza gặp môi trờng đất khu vực vờn bách thảo - Hμ Néi LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn : TS Lại Văn Hòa Hà Nội - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn TS Lại Văn Hịa Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực có nguồn gốc rõ ràng Tác giả luận văn Nguyễn Văn Bắc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MụC LụC ặt vấn đề Chơng 1: Tổng quan tài liệu 1.1 VÞ trÝ cđa nÊm sinh giíi 1.2 Tính đa dạng vi nấm 1.3 Vi nÊm ®Êt 1.4 Vai trò vi nấm công nghiệp 1.5 Đặc tính đặc trng cña vi nÊm 1.6 Hệ thống phân loại vi nấm 1.6.1 Hệ thống phân loại cđa Robert Shaffer (1969) 1.6.2 HƯ thèng cña Ainsworth & Bisby (1995) 1.7 Những vấn đề chung chế sinh hoá phá huỷ sinh học vi nấm gây nên 1.7.1 Đặc điểm phá huỷ sinh học vi nÊm 1.7.2 C¸c chÊt trao đổi chuyển hoá xâm thực sợi nấm - loại enzym axít hữu 1.8 Các phơng pháp bảo qu¶n vi nÊm 1.8.1 Nhóm phơng pháp tiếp tục trì phát triển 1.8.2 Nhóm phơng pháp làm khô 1.8.3 Nhóm phơng pháp làm đình trao đổi chất 1.9 Lựa chọn phơng pháp bảo quản 1.10 Những nghiên cứu phân loại bảo quản vi nấm Việt Nam Chơng 2: Đối tợng, vật liệu phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cứu 2.2 VËt liƯu nghiªn cøu 2.2.1 Dông cô, thiết bị 2.2.2 M«i tr−êng nu«i cÊy 2.2.3 Hoá chất chất sinh học 2.3 Phơng pháp kỹ thuật nghiên cứu 2.3.1 Phơng pháp lấy mẫu 2.3.2 Phơng pháp phân lập 2.3.3 Phơng pháp phân loại vi nấm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 9 10 12 12 13 16 19 20 22 25 26 28 28 28 28 29 29 30 30 30 30 2.3.4 Phơng pháp nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi nấm 2.3.5 Phơng pháp bảo quản chủng nấm sợi 2.3.6 Phơng pháp phục håi Ch−¬ng 3: Kết nghiên cứu 3.1 Kết phân lập phân loại chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo 3.1.1 Thành phần chủng loại vi nÊm đất vờn Bách Thảo 3.1.2 Đặc điểm phân loại hình thái chi vi nấm phân lập đợc 3.2 Lựa chọn chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân hủy chất gelatin xenluloza phân lập từ môi trờng khu vực vờn Bách Thảo đa vào bảo quản 3.3 Kết phục hồi chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân lập từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo Hà Nội sau bảo quản glyxerin 10%, -200C silicagel 3.4 Khả sinh enzym phân huỷ chất sinh học chủng nấm sợi phân lập đợc từ môi trờng đất vờn Bách Thảo sau bảo quản 18 th¸ng Chơng 4: Bàn Luận 4.1 Phân lập, phân loại chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo 4.2 Lùa chän c¸c chủng vi nấm có hoạt tính enzym phân huỷ chất sinh học (xenluloza, gelatin) để đa vào bảo quản 4.3 Bảo quản chủng vi nấm có hoạt tính enzym đà đợc chọn hai phơng pháp: lạnh sâu (glyxerin 10% -200C) silicagel 4.4 Khả sinh enzym phân huỷ chắt sinh học chủng nấm sợi phục hồi sau bảo quản Chơng 5: Kết luận kiến nghị TàI LIệU THAM KHảO Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 33 34 35 36 36 36 40 57 59 66 73 73 75 76 77 79 81 C¸c chữ viết tắt ATCC American Type Culture Colletion CCRC Culture Collection Research Center IMI International Mycological Institute LS Lạnh sâu SLC Silicagel TBQ Trước bảo quản SBQG Sau bảo quản glyxerin SBQS Sau bảo quản Silicagel DMSO Dimethyl sulfoxide Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Đặt vấn đề Nm (Fungi) mt giới sinh vật phổ biến tự nhiên Chóng cã thể sinh trởng phát triển khắp nơi, loại chất với tốc độ phát triển nhanh, mạnh Đa phn cỏc nm u khụng th nhỡn thấy mắt thường, chúng sống phần lớn đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh kí sinh thể động thực vật nấm khác Một số lồi nấm nhận thấy dạng thể quả, nấm lớn nấm mốc Người ta ước tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài, khoảng 70.000 loài nấm nhà phân loại học phát miêu tả, nhiên tính đa dạng giới Nấm cịn điều bí ẩn [29] Các lồi nấm hoại sinh đóng vai trị quan trọng chu trình tuần hồn vật chất lượng tự nhiên Nấm phân giải chất hữu phức tạp thành chất đơn giản, đặc biệt chất khó phân giải xenluloza, ligin thành chất vơ Do đó, yếu tố quan trọng làm tăng độ phì nhiêu đất Nấm có ý nghĩa quan trọng đời sống người, chúng có vai trị thực tiễn kinh tế, khoa học chu trình vật chất, lượng tự nhiên [30] Nhiều lồi nấm sử dụng cơng nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn sản phẩm trình lên men Tuy nhiên, bên cạnh lợi ích to lớn đó, nhiều loại nấm lại gây bệnh cho người, động thực vật [32] Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu khu hệ vi nấm mơi trường khơng khí tự nhiên, sản phẩm công-nông nghiệp khác nhau, dược phẩm, đất, với số lượng chưa nhiều Ở nước ta, khí hậu nhiệt đới ẩm thích hợp cho phát triển nhiều loại vi nấm, chúng phong phú số lượng thành phần chủng loại Để góp phần khảo sát đa dạng thành phần chủng loại, đặc tính sinh học tìm kiếm chủng vi nấm chưa phát Việt Nam nói chung mơi trường đất nói riêng, lun ny tin hnh Nghiên cứu phân lập, phân loại, bảo quản số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza xenlulaza gặp môi trờng ®Êt khu vùc V−ên Bách thảo-Hà Nội’’ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mục tiêu đưa là: Phân lập, phân loại số chủng nấm sợi có hoạt tính gelainaza xenlulaza gặp mơi trường đất khu vc Vn Bỏch tho-H Ni Bảo quản chủng vi nấm đà phân lập đợc số phơng pháp bảo quản Góp phần xây dựng su tập chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ cho nghiên cứu vào su tập giống Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng nấm sợi từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo Phân loại xác định đến chi, loài chủng nấm sợi đà phân lập đợc Xác định hoạt tính enzym phân huỷ số chất sinh học nh gelatin, xenluloza chủng nấm sợi đà phân lập phân loại Bảo quản loài nấm sợi có hoạt tính enzym cao phơng pháp silicagel bảo quản glyxerin 10% nhiệt độ -200C Phục hồi chủng vi nấm đà bảo quản sau 18 tháng, kiểm tra độ khiết, độ sống sót, độ ổn định hình thái khả sinh enzym phân huỷ chất sinh học chúng Xây dựng su tập chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ cho nghiên cứu góp phần vào su tập giống Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam S húa bi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chơng Tổng quan ti liệu 1.1 Vị trí nấm sinh giới Trớc đây, nấm đợc xếp vào mét ngµnh (Mycota) cđa d−íi giíi thùc vËt bËc thÊp Hiện nấm không đợc xem ngành cđa d−íi giíi thùc vËt bËc thÊp, mµ nÊm lµ mét giíi riªng biƯt thÕ giíi sinh vËt Theo Takhtajan (1973): Không có sở đáng kể để xếp nấm vào thực vật Vi nấm có hàng loạt đặc điểm riêng biệt sau õy: - Dinh dỡng: Nấm không dinh dỡng theo kiểu quang hợp nh thực vật kiểu nuốt thức ăn nh động vật Nấm dị dỡng cách hấp thụ hay thẩm thấu NÊm hÊp phơ c¸c chÊt dinh d−ìng b»ng c¸ch tiÕt môi trờng cỏc enzym để phân giải chất có cấu trúc phức tạp thành nhng chất có cấu trúc đơn giản sau hấp phụ qua màng - Cấu trúc tế bào: Các nấm thật (Eumycota) có thành phần hoá học vách tế bào kitin (thực vật có vách tế bào xenluloza) - Sinh hoá: Chất dự trữ nấm glycogen giống nh ë ®éng vËt cịn thùc vËt cã chÊt dù trữ tinh bột Ngoài ra, nấm hình thành sản phẩm giống với động vật nh axớt amin - Phơng thức sống: Nấm dị dỡng cách hấp thụ, động vật dị dỡng cách nuốt thức ăn, thực vật dị dỡng cách quang hợp - Cá thể phát sinh: Trong trình phát triển cá thể nấm tiến hoá cao có giai đoạn song hạch ( nm tỳi nm m), giai đoạn song hạch sinh vật khác - Cơ thể dinh dỡng: Sợi phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm, nhng thực vật có thể dinh dỡng dạng có rễ, thân, - Sinh sản: Nấm sinh sản phát tán bào tử S hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Nhờ thành tựu nghiên cứu v cấu trúc nhân, màng tế bào, ty thể, cấu trúc phân tử ARN riboxom; thành phần sinh hoá; phơng thức dinh dỡng gianh giới động vật thực vật bị mờ đi, mà rõ nét gianh giới sinh vật không nhân sinh vật có nhân Hiện nay, có nhiều quan điểm khác việc xếp ngành nấm vào giới sinh vật Theo hệ thống giới Whittaker (1978) ngành nấm đợc xếp vào giới khác nhau: Các ngành nấm nhầy tế bào (Acrasiomycota), nấm nhầy thật (Myxomycota), nấm trứng (Oomycota) nấm cổ (Chytridiomycota) đợc xếp vào giới Protoctista; ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota), nấm túi (Ascomycota), nấm đảm (Basidiomycota), nấm bất toàn (Deuteromycota) địa y (Lichenomycota) đợc xếp vào giới nấm Theo Whittaker giới nấm gồm ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota) ngành nÊm thËt (Eumycota), dã ngµnh nÊm thËt bao gåm phân ngành: nấm túi (Ascomycotina), nấm đảm (Basidiomycotina), nấm bất toàn (Deuteromycotina) địa y ( Lichenes) Ngoài có số hệ thống khác nh hệ thống giới Lucile Mc Cook (năm 2004), hệ thống giới Bryce Kendrick (2001) 1.2 Tính đa dạng vi nấm Vi nấm có khả phát triển hầu hết dạng sinh thái, sử dụng hầu hết sản phẩm tự nhiên sản phẩm ngời làm Chúng sinh vật lý tởng sinh trởng vùng hoang dÃ, chúng có khả thay đổi để thích nghi với điều kiện sống Ví dụ, loài cđa chi Aureobasidium cã thĨ sinh tr−ëng ë n¬i nhiƯt độ thấp (vùng Antarctica) đá nhiệt ®é tõ -100 ®Õn -200, cã thĨ chèng chÞu ë nhiệt độ thấp từ 700C đến -800C Nhng chi có loài sinh trởng vùng nhiệt đới Phần lớn vi nấm hiếu khí sinh trởng mụi trng cú hoạt độ nớc cao Nhng ngời ta đà phát đợc vi nấm kỵ khí cỏ cừu (Yarlett CS, 1986) đà phát đợc nhiều loài sinh trởng đợc S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn chất có hoạt độ nớc thấp (aw