Nghiên cứu khả năng sinh enzym cenllulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM CENLLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THANH THỦY TS VÕ THỊ HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh -2 0 MỞ ĐẦU Sự hữu rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ kết 25 năm phục hồi phát triển nổ lực to lớn quyền nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh Vào ngày 21 tháng năm 2000, Ủy ban MAB/ UNESCO công nhận RNM Cần Giờ khu dự trữ sinh Việt Nam [55] Trước đây, RNM Cần Giờ vùng đất hoang hóa với phần lớn diện tích đất bùn khơ nứt nẻ phần thảm thực vậtxơxác mà độ che phủ 40% Sau khôi phục lại rừng việc trồng lồicâycó giá trị kinh tế quan trọng Đước, Dưng, Dà quánh, Gõ biển, Xu ổi…,đồng thời với việc khoanh nuôi, tu bổ rừng tự nhiên, đến nay, hệ sinh thái RNM tươi tốt hình thành, tạo MT sống cho lồi động thực vật, gia tăngmứcđộ đa dạng sinhhọc RNM Cần Giờ nơi lưu trữ nguồn gen sinh vật quí bền vững, có khả chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt Lànơicó hệ VSV vô phong phú đa dạngnhưnấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…., nấm sợi chiếm số lượng lớn Nấm sợi đóng vai trị quan trọng vịng tuần hồn vật chất lượng hệ sinh thái RNM, nhờ có khả sinh loại enzym ngoại bào cellulase, protease, kitinase, amylase, enzym phân giải dầu… Đặc biệt, enzym cellulase nấm sợi sống RNM sinh lớn, thảm thực vật dày đặc RNM Cần Giờ nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi cho chủng nấm sợi có khả sinh enzymnày Enzym cellulase hệ enzym bao gồm loại enzym: C1, Cx,βglucosidase, có khả hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose Enzym cellulase ứng dụng nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, q trình li trích chất từ thực vật, việc phân hủy phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% số tỷ USD thuđượctừ lượng enzym công nghiệp bán giới gồm enzym cellulase, hemicellulase pectinase Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷUSD Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại lượng lớn nguồn enzym cellulase để giải vấn đề sản xuất xử lý ô nhiễm MT RNM Cần Giờ kho dự trữ chủng VSV có hoạt tính enzym cao chưa khai thác Trong đó, cơng trình khoa học nghiên cứu khả sinh enzym cellulase chủng nấm sợi RNM Cần Giờ bỏ ngõ Từ sở khoa học thực tiễn gợi ý cho chọn đề tài:“Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủngnấmsợiphân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”,nhằm tận dụng nguồn phế thải nông nghiệp để sản xuất phân bón cho trồng, góp phần xây dựng nông nghiệp bền vững, giảm thiểu ô nhiễmMT Việt Nam nước nhiệt đới có nơng nghiệp phong phú, đa dạng đà phát triển Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp dồi dào, với công nghiệp hóa, đại hóa đấtnước,ơ nhiễm MT trở thành nguy thật Thành phần phế thải rắn sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp cellulose, sản phẩm trình phân hủy chất hữu phế thải mùn làm phân bón tốt cho trồng Do đó, xử lý chất thải VSV hướng tích cực có nhiều ưu điểm so với phương pháp lí, hóa, học, quan tâm khaithác  Mục tiêu đềtài - Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase từ RNM CầnGiờ - Đề xuất hướng ứng dụng chủng nấm sợi phân lậpđược  Nhiệm vụ đềtài Phân lập chủng nấm sợi từ RNM CầnGiờ Tuyển chọn số chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase cao Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa phân loại chủng nấm sợi tuyểnchọn Nghiên cứu yếu tố MT ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển sinh tổng hợp enzym cellulase chủng đượcchọn Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào việc phân hủy chất phế thải, góp phần hạn chế nhiễmMT  Địa điểm nghiên cứu đềtài Đề tài thực PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh Chƣơng1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu nấm sợi rừng ngập mặn CầnGiờ 1.1.1 Đặc điểm tự nhiên RNM CầnGiờ RNM chiếm phần đáng kể kiểu rừng ngập nước, thường tồn vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trên giới khoảng 15 triệu RNM phân bố vùng bờ biển có bùn, cửa sơng lớn, vịnh cạn đầm mặn giáp vớibiển RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, “lá phổi xanh” thành phố Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sơng, điều hịa khí hậu,mởrộng diện tích đất bồi tạo MT phát triển ngành thủy sản Bên cạnh đó, RNM Cần Giờ cịn nơi cung cấp thức ăn, nơi cư trú, sinh sản loài thủy sinh vật động vật có xương sống cạn Hiện nay, Cần Giờ cịn địa điểm du lịch hấp dẫn với 3.000 - 5.000 du khách đến tham quan tuần[83] RNM Cần Giờ có diện tích khoảng 29,380 chiếm 41,18 % đất huyện Cần Giờ [87] Khí hậu nóng ẩm chịu chi phối quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm Nhiệt độ trung bình 25,80C, biên độ nhiệt dao động ngày từ 5-70C Chế độ bán nhật triều không Độ mặn dao động 18‰– 30‰[1] Một nghiên cứu cho biết RNM Cần Giờ có 157 loài thực vật; 63 loài phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc ngành: Tảo khuê, Tảo giáp, Tảo lam; 100 lồi động vật đáy khơng xương sống tơm, cua, sị ốc Ngồi ra, cịn có 120 lồi cá, có lồi có giá trị kinh tế cao cá Ngát, cá Dứa, cá Chẽm; 31 lồi bị sát cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu nhũ khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng 145 loài chim [83] Đây nguồn thức ăn tốt cho hệ nấm sợi sống RNM Nấm sợi có khả tiết hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có cây, thân RNM thànhglucoseđể sử dụng Ngoài ra, nấm sợi cịn sinh loại enzym khác protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tôm, cua, ốc, xác chết loài động vật khác thành chất dinh dưỡng chúng hấp thu[1] Hình 1.1 Bản đồ RNM Cần Giờ[83] Vậy,hệ nấm sợi mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn, nhân tố khơng thể thiếu chu trình chuyển hóa vật chất RNM Cần Giờ Chúng sử dụng chất hữu từ thảm thực vật hệ động vật phong phú làm thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm ô nhiễm MT RNM Cần Giờ 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từRNM  Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzymcellulase Khả sinh enzym cellulase chủ yếu tổng hợp từ nấmsợi Trichoderma Aspergillus Ở Mỹ, năm 1983 PTN Quân đội Mỹ Natik trường đại học Rutgers, sử dụng chủngTrichoderma virideQM6 hoang dại để sản xuất cellulase Sau đó, gây biến chủng chọn lọc biến chủng QM9414 có khả sinh cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74] Năm 1998, YU nuôi cấyT reeseiRut 30 MT chứa 5%b ộ t cellulose 1% cám mì, thu hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68] Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả sinh tổng hợp enzym polygalacturonase, cellulase, xylanase protease từA niger3T5B8 nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác phương pháp lên men bán rắn ứng dụng enzym việc tách chiết dầu thực vật[61] Năm 2002, theo báo cáo gần CORAL, dịch nuôi cấyA nigertrong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di gel SDSPAGE (chứa 0,2% CMC) phát có hai vạch có hoạt tính CMCase trọng lượng phân tử 83.000 50.000 Dalton [67] Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu sinh tổng hợp số đặc tính cellulase (typ CMCase) ởA nigerVS-1 MT lên men bán rắn [40] Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu nấm sợiT reeseisinh tổng hợp enzym cellulase MT lỏng với nguồn cacbon CMC [40] Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22] Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulase củaA nigerRnnl 363 Châu Hoàng Vũ nghiên cứu thu nhận tinh enzym cellulase từ nấm mốcT reeseibằng phương pháp lên men bán rắn [24],[57] Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả sinh tổng hợp enzym cellulase từT reeseivàA nigertrên MT lên men bán rắn [40] Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng pectinase cellulase số chủng nấm mốc [27]  CáccơngtrìnhnghiêncứunấmsợisinhenzymcellulasetừRNM Cho đến nay, giới có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu phân lập phân loại nấm sợi hệ sinh thái RNM Nhưng kết nghiên cứu sơ sài, chưa đáp ứng nhu cầu hiểu biết đa dạng nấm sợi vai trò chúng hệ sinh thái RNM [64] Trước đây, người ta cho điều kiện MT RNM khắc nghiệt, không thích hợp cho sinh trưởng phát triển nấm sợi Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy điều kiện sống đặc biệt vậy, đường trao đổi chất nấm sợi khác đường trao đổi chất VSV đất liền Vì vậy, có sản phẩm trao đổi chất có tính chất đặc biệt hơn, khác lạ có enzym, chất kháng sinh …[18] Tuy nhiên, chưa có cơng trình sâu nghiên cứu hoạt tính sinh học chủng nấm sợi từRNM Năm 1955, Gribb cs phân lập hai loài nấm thực vật RNM làPhialophloraphoma litoralis(ngành phụ Deuteromycotina) vàGnomonia longiostris(ngành phụ Ascomycotina) từ thân câyAvicenniamarina var resinifera[63] Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 loài vi nấm RNM thuộc ngành phụ Ascomycotina, Deuteromycotina Basidiomycotina [64] Năm 1987, Hyde cs công bố phát 89 loài nấm từ Rhizophora mucronatalanak RNM Ấn Độ [66] Năm 1994, Newell S.Y phân lập loài nấm nhày (Oomycetes) ưa mặn từ mục RNM, có khả phân hủy mạnh xác động, thực vật [73] Năm 1997, theo Tadayoshi cs, chủng nấm sợi chủ yếu tìm thấy RNM Thái Lan Nhật Bản thuộc chiTrichoderma(có nhiều thân cây),Oomycetes(có nhiều rụng) [77] Ở Việt Nam, năm 2000 có thơng báo MaiThịHằng cs nấm sợi RNM Năm 2002, tác giả tiếp tục nghiên cứu đadạng,nghiên u khả diệtcô n t r ùng vàkhảnăng phâng i ả i c ac bu a hydro nấm sợi từ RNM hai tỉnh Nam Định, Thái Bình Riêng RNM Cần Giờ có số nghiên cứu phân lập Cho đến nay, chưa có nghiên cứu khả sinh enzym cellulase chủng nấm sợi RNM Cần Giờ [19], [20], [21]  Một số chế phẩm enzym cellulase giới ViệtNam Ngày nay, giới Việt Nam, chế phẩm sinh học chứa VSV có khả sinh loại enzym sản xuất sử dụng ngày rộng rãi phổ biến lĩnh vực chăn nuôi, trồng trọt,… Điều giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế tình trạng nhiễmMT Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu thu nhận từTrichodermareesei, Aspergillus niger…và gần chủng vi khuẩn[30] Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk có chế phẩm “Celluclast” dùng thức ăn gia súc [40] Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từT reeseivà từA nigertrong công nghiệp thực phẩm [40] Ở Nhật, hãng Amano hàng năm sản xuất 8000 chế phẩm enzym loại để dùng nông nghiệp Enzym “Panxenlase” chứa cellulase, hemicellulase, protease amylase, hoạt tính dùng chăn ni Chế phẩm “Cellubrix”, “Cellusoft”, “Onozuka” dùng công nghiệp làm mềm vải, thức ăn gia súc [40] Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol [77] Ở Liên Xô, chế phẩm “Cellolignorin” sử dụng chăn ni, hoạt tính 1-50 đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase [77] Ngồi ra, cịn có chế phẩm cellulase khác tạo nhà sản xuất: Cellulaset Novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament CT [RM], Avizyme [FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC [MJ], Cellulase TAP [AM], Cytolase [GR] [74] ỞViệt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới sản xuất chế phẩmBioI,BioII, BioIII… có dạng bột, chứa enzym amylase, protease, cellulase VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho bị, heo, cá Chế phẩm có tác dụng phịng chống chứng rối loạn tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy thức ăn thừa khí thải đáy ao…[78] Trung tâm Cơng nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩmTrichotechchứa vi nấmTrichoderma, chế phẩm có dạng rắn, tơi xốp,nhẹ, màu xám nâu đậm, giúp trồng chống loại nấm bệnh… [82] Công ty TNHH TM sản xuất Mai Xuân (TP Hồ Chí Minh) sản xuất chế phẩmTRICHO-MXchứa vi nấmTrichoderma,có dạng bột Có tác dụng hạn chế nấm hại, cải tạo đất, ủ phân bón cho trồng Cơng ty TNHH TM sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng (Bình Dương) sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấmAspergillussinh enzym cellulase, dùng xử lý nước ao nuôi tôm cá, kích thích tiêu hóa, gia súc… như:MD-Bio-Zemix, Biofat, Bio vitamin, Biolaczym… 1.2 Nấm sợi tổng hợp enzymcellulase Rất VSV có khả sinh tất loại enzym cần thiết để phân giải cellulose dạng tinh thể Chúng phải tiết hệ enzym phức tạp, có khả phân hủy cellulose theo phương thức khác thủy phân, oxy hoá [51],[52] Cellulose bị phân rã tác dụng vi khuẩn háo khí kỵ khí Song khả phân hủy cellulose không nấm, vi khuẩn thường tạo enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp 0,1g/l [51] Cellulase sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn cỏRuminococcus albus(Berger 1963), vi khuẩn hiếu khíCellulomonas sp(Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khíClostridiumsp(Parsiegla, 1998) [39],cácloàixạkhuẩnStreptomyces,