Sàng lọc và định danh một số chủng nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật được phân lập từ các mẫu thu thập ở vịnh bái tử long

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÁC MẪU THU THẬP Ở VỊNH BÁI TỬ LONG Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Thị Hồng Minh Giáo viên hướng dẫn : NCS Vũ Thị Quyên Sinh viên thực : Nguyễn Thị Xuân Linh Lớp : 11-01 Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho em xin gửi lời cảm ơn tri ân sâu sắc tới toàn ban giám hiệu Viện Đại Học Mở Hà Nội đặc biệt thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học dạy dỗ em suốt bốn năm học tập, rèn luyện trường tạo điều kiện cho em làm báo cáo tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến cô hướng dẫn TS Lê Thị Hồng Minh – Phó phòng Công Nghệ Sinh Học – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam NCS Vũ Thị Quyên – cán phòng, người tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ em thời gian làm đề tài Đồng thời em xin chân thành cảm ơn cô, anh chị, bạn Phòng Công Nghệ Sinh Học – Viện Hóa Sinh Biển giúp đỡ em nhiều thời gian thực tập Qua đây, em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người than động viên em suốt thời gian học tập Sinh viên Nguyễn Thị Xuân Linh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Agar Agarose ADN Axit deoxyribonucleotit ARN Axit ribonucleotit BLAST Basic Local Alignment Search Tool CMC Carboxymethyl cellulose dNTP Deoxynucleotide triphosphates EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid HTKS Hoạt tính kháng sinh LB Lauria Betani 10 PCR Polymerase Chain Reaction 11 SDS Sodium dodecyl sulfate 12 SEM Scanning Electron Microscope 13 TAE Tris-acetate-EDTA 14 Tm Nhiệt độ biến tính DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần thành tế bào nấm………………………………… Bảng 2.2: Phát hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm biển……………… Bảng 2.3: Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ biển………………… Bảng 2.4: Các hợp chất kháng nấm có nguồn gốc từ nấm biển……………………… Bảng 4.1 : Danh sách mẫu trầm tích hải miên thu thập vịnh Bái Tử Long……………………………………………………………………………… Bảng 4.2: Ký hiệu 20 chủng nấm làm sạch………… Bảng 4.3: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ba chủng nấm có hoạt tính cao…………………………………………………………………… Bảng 4.4: Trình tự thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR… DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Hình dạng vi nấm………………………………………………… Hình 2.2: Rễ giả nấm Rhizopus………………………………………………… Hình 2.3: Thể đệm (stroma)……………………………………………………… Hình 2.4: Hạch nấm (sclepotium)………………………………………………… Hình 2.5: Các kiểu bào tử đảm…………………………………………………… Hình 4.1 : Một số hình ảnh nơi lấy mẫu mẫu thu Hình 4.2: Một số hình ảnh phân lập nấm Hình 4.3: Hình ảnh nấm làm môi trường nấm Hình 4.4: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hình 4.5: Kết thử khả phân giải tinh bột Hình 4.6: Kết thử khả phân giải protein Hình 4.7: Kết thử khả phân giải cellulose Hình 4.8: Penicillium citrinum:(A) Khuẩn lạc(MEA); (B) Cơ quan sinh bào tử trần bào tử trần (x 400) Hình 4.9: Penicillium steckii:(A) Khuẩn lạc(MEA); (B) Cơ quan sinh bào tử trần bào tử trần (x 400) Hình 4.10: Aspergillus sydowi:(A) Khuẩn lạc(MEA); (B-C) Cơ quan sinh bào tử trần bào tử trần (x 400); (D) Hüll cell(x 400) Hình 4.11: Aspergillus flavus:(A) Khuẩn lạc(MEA); (B) Cơ quan sinh bào tử trần bào tử trần (x 400) Hình 4.12: Kết điện di đồ AND tổng số ba chủng nấm Hình 4.13: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 5,8S chủng TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tên đề tài Sàng lọc định danh số chủng nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh phân lập từ mẫu thu thập vịnh Bái Tử Long Đối tượng Các chủng nấm phân lập từ trầm tích, hải miên biển thuộc khu vực biển Bái Tử Long dùng để tuyển chọn, sàng lọc, định danh nghiên cứu hoạt tính sinh học Mục tiêu Sàng lọc 2-3 chủng nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật cao từ môi trường biển, định danh chủng nghiên cứu Kết - Phân lâp làm chủng nấm từ mẫu trầm tích biển - Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định nấm, vi sinh vật kiểm định bao gồm : Các vi sinh vật kiểm định: chủng vi khuẩn Gram – (Escherichia Coli ATCC25922, Pseudomonas aeraginosa ATCC27853, Salmonella enterica ATCC12228), chủng Gram + (Enterococus faecalis ATCC13124, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245), chủng Nấm Canida albicans ATCC1023 - Tuyển chọn chủng vi nấm có hoạt tính kháng vi sinh vật cao - Kiểm tra hoạt tính enzyme: amylase, protease, cellulase chủng vi nấm tuyển chọn - Định danh hình thái trình tự 5,8S ARN riboxom chủng nấm tuyển chọn MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG…………………………………………… DANH MỤC HÌNH……………………………………………… TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………… PHẦN I: MỞ ĐẦU……………………………………………… 1.1: Đặt vấn đề…………………………………………………………………… 1.2: Mục tiêu đề tài………………………………………………………… 1.3: Ý nghĩa đề tài…………………………………………………………… PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………… 2.1 :Vi nấm (Microfungi)…………………………………………………… 2.1.1 :Vị trí vi nấm vi sinh vật đặc điểm chung………………… 2.1.2 : Đặc điểm phân bố nấm men nấm sợi……………………… 2.1.2.1: Nấm men……………………………………………………………… 2.1.2.2: Nấm sợi………………………………………………………………… 2.2 : Hình thái cấu tạo vi nấm…………………… ………………… 2.2.1 : Hình thái cấu tạo nấm men……………………………………… 2.2.2 : Hình thái cấu tạo nấm sợi……………………………………… 2.2.3 : Các dạng biến hóa hệ sợi nấm……………………………………… 2.3 : Giới thiệu sơ lược nấm biển………………………………………… 2.3.1 : Sơ lược lịch sử nghiên cứu nấm biển………………………………… 2.3.2 : Định nghĩa nấm biển……………………………………………… 2.3.3 : Kích thước nấm biển……………………………………………… 2.3.4 : Các đặc tính độc đáo môi trường biển lợi ích, tiềm nấm biển 2.3.4.1 : Các đặc tính độc đao môi trường biển…………… 2.3.4.2 : Lợi ích tiềm nấm biển………………… 2.4 : Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ nấm biển……… PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 3.1 : Vật liệu hóa chất…………………………………………………… 3.1.1 : Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………… 3.1.2 : Hóa chất thiết bị…………………………………………………… 3.2 : Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 3.2.1 : Thu thập mẫu trầm tích, hải miên biển…………………………… 3.2.2 : Phương pháp phân lập nấm…………………………………………… 3.2.3 : Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phương pháp khuếch tán đĩa thạch…………………………………………………………… 3.2.4 : Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý , sinh hóa chủng nấm có hoạt tính đối kháng với số vi sinh vật kiểm định………………………………… 3.2.4.1: Khả thủy phân tinh bột tan………………………………………… 3.2.4.2: Khả thủy phân casein……………………………………………… 3.2.4.3: Khả thủy phân CMC……………………………………………… 3.2.5 : Phương pháp phân loại vi nấm hình thái………………………… 3.2.6 : Phương pháp thử khả sử dụng đường nấm…………………… 3.2.6.1: Phương pháp tách chiết ADN tổng số………………………………… 3.2.6.2: Phương pháp PCR……………………………………………………… 3.2.6.3: Giải trình tự …………………………………………………………… PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………… 4.1: Kết lấy mẫu trầm tích hải miên Vịnh Bái Tử Long 4.2: Phân lập trầm tích hải miên…………………………………………… 4.3: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ………………………… 4.4: Nghiên cứu số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng nấm………… 4.4.1:Khả thủy phân tinh bột tan…………………………………………… 4.4.4: Khả thủy phân protein(casein)……………………………………… 4.4.5: Khả thủy phân CMC………………………………………………… 4.5 : Kết xác định hình thái nấm phân lập được…………………………… 4.5.1: Chủng FG042……………………………………………………………… 4.5.2: Chủng FG059……………………………………………………………… 4.5.3: Chủng FG060……………………………………………………………… 4.6: Kết định danh sinh học phân tử chủng nghiên cứu …… PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… LỜI CAM ĐOAN………………………………………………… PHẦN I MỞ ĐẦU Nấm tìm thấy nơi môi trường Chúng thực hàng loạt chức sinh thái quan trọng, đặc biệt đối tượng có liên quan tới phân hủy chất hữu cạn biển , kể môi trường khắc nghiệt Các loài nấm có tầm quan trọng với đa dạng sinh học lên tới hàng triệu loài Nấm sống biển xác định bắt buộc sống môi trường biển tùy ý Nấm biển mọc sinh bào tử môi trường biển Một số loài nấm biển ngẫu nhiên tiến hóa thích nghi với môi trường biển cuối trở thành nấm biển bắt buộc Nấm biển sống kí sinh hoại sinh động vật loài tảo hay gỗ chết [5] Hiện nấm biển chưa nghiên cứu nhiều loài nấm sống cạn Có nhiều lý đặt cấn thiết để kiểm tra đa dạng sinh học nấm Một số nấm biển lại nguồn enzyme dùng xử lý sinh học Một số nấm biển công nhận cung cấp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học chống khối u, chống virus, kháng viêm, hợp chất ức chế enzyme Nấm biển thực ý nghiên cứu vài thập kỷ trở lại Nấm biển cho thấy khả tiềm tàng giống nguồn thuốc dù chất chuyển hóa nồng độ thấp Môi trường biển chiếm 70% bề mặt trái đất nên nguồn chứa khổng lồ nguồn đa dạng sinh học Mặc dù hình dáng bên đại dương thảm thủy sản thống nhất, khu vực nằm cực hay đáy biển đồng hốc đại dương tập hợp cụ thể điều kiện vật lý phù hợp cho tồn đa dạng sinh học đáng kinh ngạc Trầm tích biển bùn bề mặt mặt dồi dinh dưỡng, trở thành thuộc địa cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển Môi trường biển bao gồm đặc tính độc đáo đóng vai trò quan trọng hệ sinh thái giúp phát triển nguồn gen Ngoài ra, môi trường biển với đặc điểm áp suất, độ mặn, nhiệt độ, độ sâu góp phần vào phát triển độc đáo cung cấp nguồn vi sinh vật phong phú đặc biệt có nấm biển Cũng từ đó, thu hút ngày nhiều nhà nghiên cứu chuyên sâu với vi sinh vật biển nói chung nấm biển nói riêng tiềm sinh học mà chúng mang lại góp phần vào việc phát triển công nghệ sinh học vào dược phẩm, y tế, công nghệ enzyme Nghiên cứu phát triển tiềm vi sinh vật ngày tăng, vi sinh vật biển đặc biệt nấm biển hứa hẹn nhiều tiềm tương Hình 4.4: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định số chủng nghiên cứu 4.4: Nghiên cứu số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng nấm 4.4.1:Khả thủy phân tinh bột tan Sau nuôi cấy nấm môi trường có bổ sung 1-3% tinh bột tan Sau 35 ngày nuôi cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 1-2ml dung dịch thuốc thử lugol để thử Nếu vi khuẩn có enzyme cố khả thủy phân tinh bột tan chúng tạo thành vòng phân giải xung quanh vị trí nấm phát triển có màu trong, phía bên có màu xanh tím Kết thí nghiệm cho thấy ba chủng nấm có khả sinh enzyme amylase FG042, FG059 FG060 Môi trường xung quanh nấm màu suốt, phía bên màu xanh tím Ba chủng nấm FG042, FG059 FG060 có khả sinh enzyme amylase với vòng phân giải 4mm (A), 16mm 7mm (B) A B Hình 4.5: Kết thử khả phân giải tinh bột 4.4.2 Khả thủy phân protein(casein) Sau nuôi cấy nấm môi trường nấm có bổ sung 1-3% casein Sau 23 ngày nuôi cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 1-2 ml dung dịch thử lugol Nếu nấm sinh enzyme có khả phân giả casein chúng tạo thành vòng phân giải xung quanh vị trí nấm phát triển suốt, phía bên màu nâu đỏ Kết cho thấy ba chủng nấm FG042, FG059 FG060 có phản ứng dương tính: môi trường xung quanh nấm không màu, suốt Phía bên có màu nâu đỏ.Ba chủng FG042, FG059 FG060 có khả sinh enzyme protease với đường kính vòng phân giải là: 5mm (A), 7mm (B) 18mm (C) A B C Hình 4.6: Kết thử khả phân giải protein 4.4.3 Khả thủy phân CMC Nuối cấy nấm môi trường nấm có bổ sung 1-3% CMC Sau 2-3 ngày nuôi điều kiện thích hợp lấy nhỏ 1-2ml lugol để thử Nếu nấm có enzyme có khả phân hủy CMC chúng tạo vòng phân giải xung quanh vị trí nấm phát triển có màu trong, phía bên màu nâu đỏ Kết cho thấy ba chủng nấm FG042, FG059 FG060 có phản ứng dương tính: môi trường xung quanh nấm không màu, suốt Phía bên có màu đỏ Ba chủng FG042, FG059 FG060 có khả sinh enzyme có khả phân hủy CMC với đường kính vòng phân giải là: 6mm (A), 4mm (B) 10mm (C) A B C Hình 4.7: Kết thử khả phân giải cellulose chủng 4.5: Kết xác định hình thái nấm phân lập 4.5.1 Chủng FG 042 Khuẩn lạc môi trường Czapek mọc chậm, đường kính 2,0 – 3,0 cm/10 ngày nhiệt phòng, có màu lục xanh nhạt, lục Mặt dạng nhung đến xốp nhẹ, mặt trái có màu vàng đến da cam tối Chổi thường không phân nhánh có nhánh 25 đến 30 µm dài Cuống thể bình thường - cái, tẽ kích thước 12 - 18µm x 2,5 -3,0µm (ở đỉnh thường phồng 4,0 - 5,0µm), thể bình thường đến 11 kích thước 8,0 - 13µm x 2,5 -3,0 µm Bào tử trần hình cầu đến gần cầu, kích thước 2,2 - 3,2µm, ráp nhẹ Quan sát đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm vi học chủng vi nấm cần định loại kết hợp với khoá phân loại Katsuhiko Ando “Identification of fungi imperfecti”, 07-2002, chi Penicillium Raper and Thom, Chúng kết luận chủng FG042 thuộc loài: Penicillium citrinum Thom A B Hình 4.8: Penicillium citrinum:(A) Khuẩn lạc(MEA); (B) Cơ quan sinh bào tử trần bào tử trần (x 400) 4.5.2 Chủng FG059 Khuẩn lạc môi trường Czapek mọc nhanh đường kính 3.0-4.0 cm/14 ngày nhiệt độ 250C, bề mặt dạng nhung, mịn xốp nhẹ sinh từ đám cuống đầu sinh bào tử trần, có màu lục lơ đến xanh đậm Giọt tiết thường nhiều, màu vàng rơm đến nâu đỏ; mặt trái thường có màu đỏ từ đỏ san hô đến nâu xẫm Đầu sinh bào tử trần hình tia đến gần cầu, kích thước thay đổi từ 100150µm đường kính, thường sinh cấu trúc nhỏ từ sợi khí sinh; cuống sinh bào tử trần sinh từ hệ sợi có kích thước 500µm dài x 5-8µm đường kính, nhẵn, màu nhạt, thành dày; bọng hình gần cầu, kích thước đến 20µm; thể bình tầng: cuống thể bình bao phủ hầu hết toàn bề mặt bọng, kích thước 67µm x 2-3µm; thể bình 7-10µm x 2-2,5µm; bào tử gần cầu đến cầu, 2,5-3,4µm, thường gai ráp, tạo thành đám màu lục giống nhóm A nidulans Quan sát đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm vi học chủng vi nấm cần định loại kết hợp với khoá phân loại Katsuhiko Ando “Identification of fungi imperfecti”, 07-2002, Chi Aspergillus Raper and Fennel (1965), kết luận chủng FG042 thuộc loài Aspergillus sydowi A B C D Hình 4.9: Aspergillus sydowi: (A) Khuẩn lạc(MEA); (B-C) Cơ quan sinh bào tử trần bào tử trần (x 400); (D) Hüll cell(x 400) 4.5.3 Chủng FG 060 Mô tả: Khuẩn lạc môi trường Czapek sinh trưởng nhanh, 5-6 cm/10 ngày nhiệt độ 250C, với hệ nấm chìm thường xốp bông, lỏng lẻo nâng đỡ sợi khí sinh, lúc đầu có màu trắng sau chuyển sang màu lục vàng nhạt gần nâu oliu vàng chanh; mặt trái không màu; mùi không rõ ràng Đầu sinh bào tử trần hình tia, hầu hết 150-300 µm đường kính, lên đến 400 500 µm, với chuỗi bào tử tẽ thành cột lỏng, tạo thành cột thực sự; cuống sinh bào tử trần hầu hết sinh từ hệ sợi nền, không màu, thường dài 2-3 mm, dài đến 4-5mm; bọng thường hình cầu gần hình bình, với cuống thể bình bao phủ hầu hết ¾ bề mặt bọng, kích thước thay đổi thường 40-50 µm đường kính lên đến 60-70µm đầu lớn đặc biệt cuống dài; thể bình thay đổi, đầu tầng kích thước 12-15µm x 3-5µm, đầu tầng cuống thể bình 8-12µm x 4-5µm thể bình 810µm x 3-3,5µm, hai cấu trúc thường xảy chí có đầu; bào tử trần nhiều thay đổi, hình lê - hình trứng non, hình gần cầu đến cầu già, kích thước 4-7µm, đến 8-10µm, nhẵn ráp nhẹ Quan sát đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm vi học chủng vi nấm cần định loại kết hợp với khoá phân loại Katsuhiko Ando “Identification of fungi imperfecti”, 07-2002, Chi Aspergillus Raper and Fennel (1965), kết luận chủng FG042 thuộc loài Aspergillus oryzae Hình 4.10: Aspergillus oryzae: Khuẩn lạc (Cz); đầu sinh bào tử trần (x 400); bào tử trần (x 400) 4.6 Kết định danh sinh học phân tử chủng nghiên cứu 4.6.1 Tách chiết AND tổng số từ nấm Để khẳng định chắn định danh đến loài chủng nghiên cứu, tiến hành giải trình tự gen 5,8S ARN riboxom FG042, FG059, FG060 để hỗ trợ cho việc định danh chủng Từ dịch nuôi cấy chủng nấm chọn, qua nhiều bước xử lý thu ADN genom Độ tinh sản phẩm kiểm tra phổ hấp thụ tử ngoại điện di gel agaroza 1% Hình ảnh điện di (Hình 4.11) cho thấy mẫu ADN sạch, bị đứt gẫy, sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Hình 4.11: Kết điện di đồ AND tổng số ba chủng nấm Đường chạy số AND tổng số chủng FG042 Đường chạy số AND tổng số chủng FG059 Đường chạy số AND tổng số chủng FG060 4.5.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR Mồi PCR thiết kế sở chọn vùng có tính bảo thủ cao Để thực điều này, tra cứu Ngân hàng gen quốc tế dựa sở số trình tự gen 5,8S ARN riboxom chủng vi nấm, sử dụng số phần mềm để trợ giúp tính toán thiết kế mồi Thông số cặp mồi lựa chọn trình bày bảng 4.4, kích thước đoạn gen thu theo tính toán lý thuyết khoảng 500bp Bảng 4.4: Trình tự thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Trình tự mồi cho 5,8S rARN Tm(0C) %GC M1 5’ TCC GTA GGT GAA CCT GCG 3’ 58,4 61,11 M2 5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’ 56,4 45,0 Mã hiệu 4.6.3 Tách dòng giải trình tự 5,8S rARN riboxom chủng Từ ADN genom chủng nghiên cứu, sử dụng cặp mồi M1, M2 tiến hành PCR nhân đoạn gen 5,8S với chu trình nhiệt nêu phần phương pháp Hình 4.12: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 5,8S chủng Giếng 2,3,4: sản phẩm PCR chủng tương ứng FG042, FG059 FG060 Giếng : thang ADN chuẩn 500bp Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ gen 5,8S ARN riboxom nấm khuôn ADN genom theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 500 bp Kết điện di đồ sản phẩm PCR (hình 4.12) cho thấy sản phẩm PCR chủng xuất băng có kích thước khoảng 500bp Như chu trình phản ứng PCR thiết lập hoàn toàn phù hợp với mục đích nhân dòng đoạn gen 5,8S chủng nghiên cứu Kết cho thấy, khuyếch đai đoạn gen 5,8S ARN riboxom chủng phân lập Trên sở tiến hành tinh lượng lớn sản phẩm PCR để tiến hành đọc trình tự nucleotit 4.5.3 Kết giải trình tự gene 5,8S chủng Nấm Trình tự gen xác định theo phương pháp Sanger&đtg Sau xử lý liệu thu qua chương trình GENE DOC, nhận trình tự hoàn chỉnh gen 5,8S ARN riboxom chủng *Kết trình tự đoạn gen 5,8S ARN riboxom chủng FG042 có độ dài 547bp TTTAGCGACT GCGGATGACA TTACCGAGTG CGGGCCCCTC GGGGCCCAAC CTCCCACCCG TGTTGCCCGA ACCTATGTTG CCTCGGCGGG CCCCGCGCCC GCCGACGGCC CCCCTGAACG CTGTCTGAAG TTGCAGTCTG AGACCTATAA CGAAATTAGT TAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC CGGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAACTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAGT CTTTGAACGC ACATTGCGCC CTCTGGTATT CCGGAGGGCA TGCCTGTCCG AGCGTCATTG CTGCCCTCAA GCCCGGCTTG TGTGTTGGGC CCCGTCCCCC CCGCCGGGGG GACGGGCCCG AAAGGCAGCG GCGGCACCGC GTCCGGTCCT CGAGCGTATG GGGCTTCGTC ACCCGCTCTA GTAGGCCCGG CCGGCGCCAG CCGACCCCCA ACCTTTAATT ATCTCAGGTT GACCTCGGAT CAGGTAGGGA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT ATCAAAACCC GGAGGAA Chúng sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự đoạn gen chủng FG042 với trình tự gen 5,8S ARN riboxom nấm khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) với gen 5,8S ARN riboxom Penicillium citrinum P5-10-M3 (KP003825) phân lập vùng biển Trung Quốc *Kết trình tự đoạn gen 5,8S ARN riboxom chủng FG059 có độ dài 537 bp CTTCCGTAGG GGGAACCTGC GGAAGGATCA TTACTGAGTG CGGGCTGCCT CCGGGCGCCC AACCTCCCAC CCGTGAATAC CTAACACTGT TGCTTCGGCG GGGAACCCCC TCGGGGGCGA GCCGCCGGGG ACTACTGAAC TTCATGCCTG AGAGTGATGC AGTCTGAGTC TGAATATAAA ATCAGTCAAA ACTTTCAACA ATGGATCTCT TGGTTCCGGC ATCGATGAAG AACGCAGCGA ACTGCGATAA GTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCA TCGAGTCTTT GAACGCACAT TGCGCCCCCT GGCATTCCGG GGGGCATGCC TGTCCGAGCG TCATTGCTGC CCATCAAGCC CGGCTTGTGT GTTGGGTCGT CGTCCCCCCC GGGGGACGGG CCCGAAAGGC AGCGGCGGCA CCGTGTCCGG TCCTCGAGCG TATGGGGCTT TGTCACCCGC TCGACTAGGG CCGGCCGGGC GCCAGCCGAC GTCTCCAACC ATTTTCTTCA GGTGACCTCG GATCAGTAGT CCCCAGA Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng FG059 với trình tự gen 5,8S ARN riboxom nấm khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) với gen 5,8S ARN riboxom chủng Aspegillus sydowi FS99 (KF706662) phân lập từ trầm tích biển Trung Quốc *Kết trình tự đoạn gen 5,8S ARN riboxom chủng FG060 có độ dài 528 bp GATTGATTTG CGTTCGGCAA GCGCCGGCCG GGCCTACAGA GCGGGTGACA AAGCCCCATA CGCTCGAGGA TCGGACGCGG TGCCGCCGCT GCCTTTGGGG CCCGTCCCCC CCGGAGAGGG GACGACGACC CAACACACAA GCCGTGCTTG ATGGGCAGCA ATGACGCTCG GACAGGCATG CCCCCCGGAA TACCAGGGGG CGCAATGTGC GTTCAAAGAC TCGATGATTC ACGGAATTCT GCAATTCACA CTAGTTATCG CATTTCGCTG CGTTCTTCAT CGATGCCGGA ACCAAGAGAT CCATTGTTGA AAGTTTTAAC TGATTGCGAT ACAATCAACT CAGACTTCAC TAGATCAGAC AGAGTTCGTG GTGTCTCCGG CGGGCGCGGG CCCGGGGCTG AGAGCCCCCG GCGGCCATGA ATGGCGGGCC CGCCGAAGCA ACTAAGGTAC AGTAAACACG GGTGGGAGGT TGGGCTCGCT AGGAACCCTA CACTCGGTAA TGATCCTTCC GCAGGTTCAC CTACGGAA Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng FG060 với trình tự gen 5,8S rARN riboxom nấm đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (100%) với gen 5,8S ARN riboxom Aspegillus oryzae QRF378 (KP278186) phân lập từ Trung Quốc Từ số đặc điểm hình thái so sánh trình tự gene 5,8S rARN riboxom chủng phân lập Chúng kết luận chủng FG042 thuộc loài Penicillium citrinum, chủng FG060 thuộc loài Aspegillus oryzae FG059 thuộc loài Aspegillus Sydowi Trên thực tế, số loài nấm mốc Aspergillus oryzae (A oryzae) loài có ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm A oryzae loại nấm mốc giàu enzym thủy phân nội bào ngoại bào (amylase, protease, pectinase…) Hiện chúng sử dụng để sản xuất nhiều loại thực phẩm sản xuất nước tương, nước mắm, súp miso rượu sake Nhật Bản… A oryzae dùng để sản xuất tương, loại thực phẩm phổ biến Việt Nam A oryzae có khả tiết môi trường enzym thủy phân xenlulase, pectinase, xylanase hemixenlulase sống môi trường có nguồn chất tương ứng Ngoài ra, A oryzae sử dụng công nghiệp sản xuất α- amylase ứng dụng trình lên men thực phẩm nghiên cứu từ nhiều kỉ [21] Bộ gen di truyền A oryzae phân tích biết kỹ vào năm 2001 Hệ gene gồm nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene 37 triệu cặp base.Hiện loại nấm mốc A oryzae nghiên cứu rộng rãi sản xuất quy mô công nghiệp Trong đó, Penicillium citrinum ứng dụng sản xuất thực phẩm: ngũ cốc, phô mai (vì lợi ích sắc tố đỏ) [23] Penicillium citrinum sinh hợp chất có hoạt tính sinh học ví dụ 3S-3,5-dimethyl8-methoxy-3,4- dihydro-1H-isochromen-6-ol gây độc cho tế bào Penicillium citrinum chúng sinh alkaloids có hoạt tính chống ung thư đồng thời sinh hoạt chất chống cầu khuẩn [12] Nấm sử dụng để sản xuất số extrolites axit asteric compactin, axit tanzowaic A, quinolactacins, quinocitrinines, Ochratoxin, Citrinum [9] Vì vậy, Penicillium citrinum nguồn khai thác hoạt chất tuyệt vời PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1: Kết luận - Từ mẫu trầm tích Hải miên thu Vịnh Bái Tử Long tuyển chọn chủng: FG060, FG059, FG042 có khả kháng vi sinh vật kiểm định cao FG060 kháng E.faecalis , B.cereus , S.aureus với vòng kháng khuẩn 25,33mm; 22,03 mm; 20,03 mm; chủng FG059 kháng E faecalis , B cereus ,C albicans với vòng kháng khuẩn 20,33mm; 24,67mm; 19mm; FG042 kháng B cereus, S aureus với vòng kháng khuẩn 20,67mm; 26,33mm - Cả ba chủng có khả sinh enzyme, chủng FG059 có khả sinh amylase cao với vòng phân giải 16mm, chủng FG060 có khả sinh protease cao với vòng phân giải 18mm sinh cellulase với vòng phân giải 10mm - Đã xác định đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu nuôi cấy môi trường đặc trưng quan sát kính hiển vi điện tử SEM, kết hợp với giải trình tự 5,8S ARN riboxom chủng, kết cho thấy chủng FG042 thuộc loài Penicillium citrinum, chủng FG060 thuộc loài Aspegillus oryzae FG059 thuộc loài Aspegillus Sydowi 5.2: Kiến nghị Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện trình lên men thu nhận dịch để tách chiết phân tích cấu trúc hoạt chất chủng nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch Phạm Văn Ty (1977), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3, Nxb Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi Sinh Vật Học, Nhà xuất giáo dục, 2007 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, Thực phẩm Mỹ phẩm, NXB Giáo dục Tài liệu tiếng anh Amira MGE, Ahmed AL, Tatsufumi O (2009) Modulation of carcinogen metabolizing enzymes by chromanone A; a new chromone derivative from algicolous marine fungus Penicillium sp Environ Toxicol Pharmacol 28:317322 B M Jaber et al (2012), Isolation and molecular identification of Ascomycetes in sediments and waters of the Gulf of Aqaba, Red Sea, Natural Science J Swathi, K Narendra, K M Sowjanya and A Krishna Satya (2013), Marine fungal metabolites as a rich source of bioactive compounds JanKhlmeyer / Erika Kohlmeyer (1979) “ Marine mycology: the higher Fungi” Jeffrey JC, Suman G, Ikechukwu O, Eleftherios M (2011) Antifungal Jos A M P Houbraken & Jens C Frisvad & Robert A Samson(2010), Fungal Diversity 44:117–133 10 Katia D, Teresa APRS, Ana CF, Armando CD (2012) Analytical techniques for discovery of bioactive compounds from marine fungi, Trends Analy Chem p.34 11 Katsuhiko Ando et al (2004), “Sampling an Isolation methods Fungi” NITE Japan 12 Mi-Hee C, Hyeon-Jin KK, Yeop J, Seong CH (2008) The isolation and characterisation of Pseudozyma sp JCC207 a novel producer of squalene Appl Microbiol Biotechnol 78:963-972 13 Punyasloke B, Balsam TM, Phillip C (2006) The current status of natural products from marine fungi and their potential as antiinfective agents J Ind Microbiol Biotechnol 33:325-337 14 Raghukumar C (2008) Marine fungal biotechnology: an ecological perspective Fungal Divers 31:19-35 15 Raper B & Fennell D (1965) “The genus Aspergillus”, Baltimo Wiliam & Wilkin, USA 16 Raper B & Thom C (1968), “A manual of Penicillia”, Hafner Publishing company, New York & London 17 Samuel P, Prince L, Prabakaran (2011) Antibacterial Activity of Marine derived Fungi Collected from South East Coast of Tamilnadu India PJ Microbiol Biotech Res 1(4):86-94 18 Sherif S Ebada and Peter Proksch (2012), The Chemistry of Marine Sponges Handbook of Marine Natural Products (190-294) 19 Swathi Jangala, Katta Meera Sowjanya, Kumara Narendra, Rathnakar Reddy KVN, Alapati Krishna Satya (2013) Isolation, identification and production of bioactive metabolites from marine fungi collected from coastal area of Andhra Pradesh India J Pharmacy Res 6:663-666 Các trang wed tham khảo 20 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 21 http://text.123doc.org/document/2002762-phan-lap-tuyen-chon-nam-mocaspergillus-oryzae-tu-cac-nguon-tu-nhien-nhu-gao-ngo-san-dau-tuong.htm 22 http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR 23 http://www.kilobooks.com/cau-tao-va-ung-dung-cua-pennicilium-334967 24.http://www.vnua.edu.vn:85/tc_khktnn/Upload%5C2102014tc%20so%205%204 pdf 25 http://en.wikipedia.org/wiki/Marine_fungi LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết số liệu nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc thực luận văn cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn trích rõ nguồn gốc Sinh viên Nguyễn Thị Xuân Linh [...]... đề tài: Sàng lọc và định danh một số chủng nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật được phân lập từ các mẫu thu thập ở vịnh Bái Tử Long , nhằm đánh giá sự đa dạng của nấm từ môi trường biển, tìm kiếm các chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật cao nhất đồng thời định danh các chủng được lựa chọn 1.2: Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn được các chủng nấm biển có hoạt tính kháng vi sinh vật cao,... chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học mới Nấm có nguồn gốc từ biển, đặc biệt, đã mang lại một số lượng ngày càng tăng các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học [8][4][17][10][19] 2.4 Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ nấm biển Bảng 2.3: Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ biển [12] Nấm Hoạt tính sinh học Ascomycetous Hoạt tính kháng virut Fusarium sp Gây độc... 4.1: Một số hình ảnh nơi lấy mẫu và các mẫu thu được 4.2: Phân lập nấm từ trầm tích và hải miên biển Từ các mẫu trầm tích và hải miên đã thu nhập, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu, cấy chải lên các môi trường phân lập với các nồng độ khác nhau sau đó nuôi ở 28⁰C Hình 4.2: Một số hình ảnh khi phân lập nấm Hình 4.2 cho chúng ta thấy một số hình ảnh của quá trình phân lập nấm từ trầm tích và hải miên biển Các. .. sợi gọi là sợi nấm hay khuẩn ti (hypha) Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn (sept) Sợi nấm có đường kính trung bình 5-10 µm, đôi khi rất lớn (tới 25µm) nhưng cũng có khi rất nhỏ (1-2µm) Có sợi nấm trong suốt không màu, có sợi có màu Một số sợi nấm tiết sắc tố vào môi trường nuôi cấy Một số sợi nấm khác có thể tiết ra các hợp chất hữu cơ , kết tinh trên bề mặt sợi nấm Đa số sợi nấm phân nhánh nhiều... nấm có sự khác biệt về mặt hình thái khi mọc trên môi trường phân lập Nhìn chung các chủng phân lập có một số hình dạng khuẩn lạc như trong, một số khuẩn lạc có sắc tố trắng đục, xanh địa y, vàng và một số hình dạng dị thường Chúng tôi tiến hành làm sạch và kiểm tra độ thu n khiết của các chủng nấm thu được bằng các kỹ thu t vi sinh truyền thống, chúng tôi đã chọn ra được 20 chủng nấm thu n khiết được. .. bào tử vô tính Ở nấm thu c các chi Penicillium và Aspergillus có các đầu bào tử trần với nhiều sợi nấm phân hóa khác nhau Chẳng hạn ở chi Penicillium bắt đầu từ đoạn sợi chưa phân nhánh gọi là cuống nấm rồi các các sợi phân nhánh bậc một gọi là cành tiếp đó là sợi phân nhánh bậc hai gọi là cành nhánh Phần sinh ra các bào tử trần gọi là thể bình Thể bình có thể có một lớp hoặc hai lớp - Nang bào tử kín... ảnh, kính hiển vi nấm mốc có thể phát triển, sinh axit và làm mờ các vật liệu này Nhiều nấm sợi kí sinh trên người, trên động vật, thực vật và gây ra các bệnh nấm khá nguy hiểm Nhiều nấm sợi sinh ra các độc tố có thể gây bệnh ung thư và nhiều bệnh tật khác Trong tự nhiên nấm sợi phân bố rộng rãi và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, ấy là quá trình phân giải các chất hữu cơ và hình thành... hoại sinh hoặc cộng sinh Nấm sinh sản bằng bào tử vô tính và bào tử hữu tính Các bào tử vô tính khác nhau ở hình thái và ở nguồn gốc phát sinh Căn cứ vào đặc điểm phát sinh người ta phân ra thành bào tử kín và bào tử trần Một dạng bào tử vô tính không phải là dạng sinh sản được gọi là bào tử màng dày hay bào tử áo Chúng do một đoạn sợi nấm tích lũy nhiều chất dinh dưỡng và có thành tế bào dày lên mà... chất có hoạt tính sinh học đầu tiên từ cephalosporium acremonium được phân lập từ một đường cống nước thải ở bờ biển Sardinian Nấm biển đã được thăm dò ở mức độ ít hơn nhiều các loài nấm trên cạn Nghiên cứu trước đây cho thấy nấm có nguồn gốc từ biển đã được công nhận là nguồn khai khác các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học mới bao gồm chống khối u, kháng khuẩn, kháng vius, kháng nấm, kháng. .. vật và đặc điểm chung của vi nấm Vi nấm là vi sinh vật nhân thật , gồm tất cả các loài nấm men và nấm sợi không sinh thể quả lớn (mũ nấm) Nấm nói chung thộc một giới riêng biệt (giới Nấm -Fungi), chúng có các đặc điểm chung sau đây: Cơ thể là một tản (thallus), tức là một cơ thể có bộ máy dinh dưỡng chưa phân hóa thành các cơ quan riêng biệt Tản của nấm có thể là đơn bào hay đa bào, đa số có dạng sợi