Nghiên cứu phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực vườn bách thảo hà nội

1 VIN KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM VIN SINH THI V TI NGUYấN SINH VT NGUYN VN BC Nghiên cứu Phân lập, phân loại, bảo quản số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza v xenlulaza gặp môi trờng đất khu vực vờn bách thảo - H Nội LUN VN THC S SINH HC Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc Mó s: 60 42 40 Ngi hng dn : TS Li Vn Hũa H Ni - 2012 LI CAM OAN Tụi xin cam oan õy l cụng trỡnh nghiờn cu ca riờng tụi di s hng dn ca TS Li Vn Hũa Cỏc s liu v kt qu c trỡnh by lun ny l trung thc cú ngun gc rừ rng Tỏc gi lun Nguyn Vn Bc MụC LụC ặt vấn đề Chơng 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Vị trí nấm sinh giới 1.2 Tính đa dạng vi nấm 1.3 Vi nấm đất 1.4 Vai trò vi nấm công nghiệp 1.5 Đặc tính đặc trng vi nấm 1.6 Hệ thống phân loại vi nấm 1.6.1 Hệ thống phân loại Robert Shaffer (1969) 1.6.2 Hệ thống Ainsworth & Bisby (1995) 1.7 Những vấn đề chung chế sinh hoá phá huỷ sinh học vi nấm gây nên 1.7.1 Đặc điểm phá huỷ sinh học vi nấm 1.7.2 Các chất trao đổi chuyển hoá xâm thực sợi nấm - loại enzym axít hữu 1.8 Các phơng pháp bảo quản vi nấm 1.8.1 Nhóm phơng pháp tiếp tục trì phát triển 1.8.2 Nhóm phơng pháp làm khô 1.8.3 Nhóm phơng pháp làm đình trao đổi chất 1.9 Lựa chọn phơng pháp bảo quản 1.10 Những nghiên cứu phân loại bảo quản vi nấm Việt Nam Chơng 2: Đối tợng, vật liệu phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Dụng cụ, thit b 2.2.2 Môi trờng nuôi cấy 2.2.3 Hoá chất chất sinh học 2.3 Phơng pháp kỹ thuật nghiên cứu 2.3.1 Phơng pháp lấy mẫu 2.3.2 Phơng pháp phân lập 2.3.3 Phơng pháp phân loại vi nấm 3 9 10 12 12 13 16 19 20 22 25 26 28 28 28 28 29 29 30 30 30 30 2.3.4 Phơng pháp nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi nấm 2.3.5 Phơng pháp bảo quản chủng nấm sợi 2.3.6 Phơng pháp phục hồi Chơng 3: Kết nghiên cứu 3.1 Kết phân lập phân loại chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo 3.1.1 Thnh phn chng loi vi nấm đất vờn Bách Thảo 3.1.2 Đặc điểm phân loại hình thái chi vi nấm phân lập đợc 3.2 Lựa chọn chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân hủy chất gelatin xenluloza phân lập từ môi trờng khu vực vờn Bách Thảo đa vào bảo quản 3.3 Kết phục hồi chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân lập từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo Hà Nội sau bảo quản glyxerin 10%, -200C silicagel 3.4 Khả sinh enzym phân huỷ chất sinh học chủng nấm sợi phân lập đợc từ môi trờng đất vờn Bách Thảo sau bảo quản 18 tháng Chơng 4: Bàn Luận 4.1 Phân lập, phân loại chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo 4.2 Lựa chọn chủng vi nấm có hoạt tính enzym phân huỷ chất sinh học (xenluloza, gelatin) để đa vào bảo quản 4.3 Bảo quản chủng vi nấm có hoạt tính enzym đợc chọn hai phơng pháp: lạnh sâu (glyxerin 10% -200C) silicagel 4.4 Khả sinh enzym phân huỷ chắt sinh học chủng nấm sợi phục hồi sau bảo quản Chơng 5: Kết luận kiến nghị TàI LIệU THAM KHảO 33 34 35 36 36 36 40 57 59 66 73 73 75 76 77 79 81 Các chữ viết tắt ATCC American Type Culture Colletion CCRC Culture Collection Research Center IMI International Mycological Institute LS Lnh sõu SLC Silicagel TBQ Trc bo qun SBQG Sau bo qun glyxerin SBQS Sau bo qun Silicagel DMSO Dimethyl sulfoxide Đặt vấn đề Nm (Fungi) mt gii sinh vt ph bin t nhiờn Chúng sinh trởng phát triển khắp nơi, loại chất với tốc độ phát triển nhanh, mạnh Đa phn cỏc nm u khụng th nhỡn thy c bng mt thng, chỳng sng phn ln t, cht mựn, xỏc sinh vt cht, cng sinh hoc kớ sinh trờn c th ng thc vt v nm khỏc Mt s loi nm cú th nhn thy c dng th qu, nh nm ln v nm mc Ngi ta c tớnh gii nm cú khong 1,5 triu loi, khong 70.000 loi nm ó c cỏc nh phõn loi hc phỏt hin v miờu t, nhiờn tớnh a dng ca gii Nm cũn l iu n [29] Cỏc loi nm hoi sinh úng vai trũ quan trng chu trỡnh tun hon vt cht v nng lng t nhiờn Nm cú th phõn gii cỏc cht hu c phc thnh cỏc cht n gin, c bit l cỏc cht khú phõn gii nh xenluloza, ligin thnh cht vụ c Do ú, nú l yu t quan trng lm tng phỡ nhiờu ca t Nm cú ý ngha rt quan trng i sng ca ngi, chỳng cú vai trũ thc tin kinh t, khoa hc v cỏc chu trỡnh vt cht, nng lng t nhiờn [30] Nhiu loi nm c s dng cụng ngh thc phm, s dng lm thc n hoc cỏc sn phm ca quỏ trỡnh lờn men Tuy nhiờn, bờn cnh nhng li ớch to ln ú, nhiu loi nm li gõy bnh cho ngi, ng thc vt [32] ó cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v khu h vi nm mụi trng khụng khớ t nhiờn, trờn cỏc sn phm cụng-nụng nghip khỏc nhau, dc phm, t, nhng vi s lng cha nhiu nc ta, khớ hu nhit i m rt thớch hp cho s phỏt trin ca nhiu loi vi nm, chỳng phong phỳ c v s lng v thnh phn chng loi gúp phn kho sỏt s a dng v thnh phn chng loi, c tớnh sinh hc v tỡm kim cỏc chng vi nm mi cha c phỏt hin Vit Nam núi chung v mụi trng t núi riờng, lun ny tin hnh Nghiên cứu phân lập, phân loại, bảo quản số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza xenlulaza gặp môi trờng đất khu vực Vờn Bỏch tho-H Ni 2 Mc tiờu ca chỳng tụi a l: Phõn lp, phõn loi mt s chng nm si cú hot tớnh gelainaza v xenlulaza gp mụi trng t khu vc Vn Bỏch tho-H Ni Bảo quản chủng vi nấm phân lập đợc số phơng pháp bảo quản Góp phần xây dựng su tập chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ cho nghiên cứu vào su tập giống Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng nấm sợi từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo Phân loại xác định đến chi, loài chủng nấm sợi phân lập đợc Xác định hoạt tính enzym phân huỷ số chất sinh học nh gelatin, xenluloza chủng nấm sợi phân lập phân loại Bảo quản loài nấm sợi có hoạt tính enzym cao phơng pháp silicagel bảo quản glyxerin 10% nhiệt độ -200C Phục hồi chủng vi nấm bảo quản sau 18 tháng, kiểm tra độ khiết, độ sống sót, độ ổn định hình thái khả sinh enzym phân huỷ chất sinh học chúng Xây dựng su tập chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ cho nghiên cứu góp phần vào su tập giống Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam 3 Chơng Tổng quan ti liệu 1.1 Vị trí nấm sinh giới Trớc đây, nấm đợc xếp vào ngành (Mycota) dới giới thực vật bậc thấp Hiện nấm không đợc xem ngành dới giới thực vật bậc thấp, mà nấm giới riêng biệt giới sinh vật Theo Takhtajan (1973): Không có sở đáng kể để xếp nấm vào thực vật Vi nấm có hàng loạt đặc điểm riêng biệt sau õy: - Dinh dỡng: Nấm không dinh dỡng theo kiểu quang hợp nh thực vật kiểu nuốt thức ăn nh động vật Nấm dị dỡng cách hấp thụ hay thẩm thấu Nấm hấp phụ chất dinh dỡng cách tiết môi trờng cỏc enzym để phân giải chất có cấu trúc phức tạp thành nhng chất có cấu trúc đơn giản sau hấp phụ qua màng - Cấu trúc tế bào: Các nấm thật (Eumycota) có thành phần hoá học vách tế bào kitin (thực vật có vách tế bào xenluloza) - Sinh hoá: Chất dự trữ nấm glycogen giống nh động vật cũn thực vật có chất dự trữ tinh bột Ngoài ra, nấm hình thành sản phẩm giống với động vật nh axớt amin - Phơng thức sống: Nấm dị dỡng cách hấp thụ, động vật dị dỡng cách nuốt thức ăn, thực vật dị dỡng cách quang hợp - Cá thể phát sinh: Trong trình phát triển cá thể nấm tiến hoá cao có giai đoạn song hạch ( nm tỳi nm m), giai đoạn song hạch sinh vật khác - Cơ thể dinh dỡng: Sợi phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm, nhng thực vật có thể dinh dỡng dạng có rễ, thân, - Sinh sản: Nấm sinh sản phát tán bào tử 4 Nhờ thành tựu nghiên cứu v cấu trúc nhân, màng tế bào, ty thể, cấu trúc phân tử ARN riboxom; thành phần sinh hoá; phơng thức dinh dỡng gianh giới động vật thực vật bị mờ đi, mà rõ nét gianh giới sinh vật không nhân sinh vật có nhân Hiện nay, có nhiều quan điểm khác việc xếp ngành nấm vào giới sinh vật Theo hệ thống giới Whittaker (1978) ngành nấm đợc xếp vào giới khác nhau: Các ngành nấm nhầy tế bào (Acrasiomycota), nấm nhầy thật (Myxomycota), nấm trứng (Oomycota) nấm cổ (Chytridiomycota) đợc xếp vào giới Protoctista; ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota), nấm túi (Ascomycota), nấm đảm (Basidiomycota), nấm bất toàn (Deuteromycota) địa y (Lichenomycota) đợc xếp vào giới nấm Theo Whittaker giới nấm gồm ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota) ngành nấm thật (Eumycota), dó ngành nấm thật bao gồm phân ngành: nấm túi (Ascomycotina), nấm đảm (Basidiomycotina), nấm bất toàn (Deuteromycotina) địa y ( Lichenes) Ngoài có số hệ thống khác nh hệ thống giới Lucile Mc Cook (năm 2004), hệ thống giới Bryce Kendrick (2001) 1.2 Tính đa dạng vi nấm Vi nấm có khả phát triển hầu hết dạng sinh thái, sử dụng hầu hết sản phẩm tự nhiên sản phẩm ngời làm Chúng sinh vật lý tởng sinh trởng vùng hoang dã, chúng có khả thay đổi để thích nghi với điều kiện sống Ví dụ, loài chi Aureobasidium sinh trởng nơi nhiệt độ thấp (vùng Antarctica) đá nhiệt độ từ -100 đến -200, chống chịu nhiệt độ thấp từ 700C đến -800C Nhng chi có loài sinh trởng vùng nhiệt đới Phần lớn vi nấm hiếu khí sinh trởng mụi trng cú hoạt độ nớc cao Nhng ngời ta phát đợc vi nấm kỵ khí cỏ cừu (Yarlett CS, 1986) phát đợc nhiều loài sinh trởng đợc chất có hoạt độ nớc thấp (aw [...]... dạng sợi sống ở trong đất rất khó phân lập bằng các kỹ thuật cơ bản Chúng sống cộng sinh đặc hiệu với cây rừng (nấm rễ - ectomycorrhizal), hoặc sống hoại sinh phân huỷ gỗ, rác Một số vi nấm có bào tử động thờng sống trong nớc có thể có mặt trong đất, chúng đợc nghiên cứu bằng các kỹ thuật đặc biệt Nấm tồn tại trong đất ở dạng sợi, bào tử (vô tính hoặc hữu tính) , bào tử áo hoặc các thể hạch nấm Chỉ có. .. có giai đoạn sợi mới có các hoạt động trao đổi chất đáng kể, các giai đoạn sau là giai đoạn ngủ phục hồi cấu trúc, khi ú hoạt động trao đổi chất ít và có tầm quan trọng hạn chế trong việc chuyển hoá đất Nấm sống trong đất hầu hết ở trạng thái ngủ Để phân tích nấm đất cần có các hiểu biết về sinh thái học để phân biệt giữa dạng sợi và trạng thái nghỉ của chúng Kỹ thuật phân lập nm trong đất bao gồm:... loãng, một lợng đất lớn hơn có xu hớng lắng nhanh trong hỗn dịch và mất đi trong quá trình hoà tan, do đó các chủng nấm trong các phức hợp đất hạt to ít khi phân lập đợc Kỹ thuật Warcup khắc phục đợc nhợc điểm này Kỹ thuật rửa đất (Parkinsons & Williams 1961, Gams và Domsch 1967) Hai kỹ thuật đầu đợc sử dụng để phân lập các vi nấm tồn tại ở các dạng bào tử Để phân lập các vi nấm từ các mảnh dạng sợi phải... không đặc hiệu và kỹ thuật đặc hiệu Các kỹ thuật này đợc Kjoler và Struwe (1982), Jensen et al (1986) và Gams (1998) tổng hợp và giới thiệu nh sau [16]: Kỹ thuật cấy đĩa pha loãng (Kochs ches PlattenguBverfahren): Kỹ thuật này đợc sử dụng nhiều nhất để xác định số lợng các vi nấm phát sinh bào tử Đối với vi nấm ít bào tử dùng phơng pháp này không chính xác Kỹ thuật đĩa đất của Warcup (1950) Trong k thut... Gams và Domsch 1967) Hai kỹ thuật đầu đợc sử dụng để phân lập các vi nấm tồn tại ở các dạng bào tử Để phân lập các vi nấm từ các mảnh dạng sợi phải dùng phơng pháp rửa đất Trong phơng pháp này hầu hết các bào tử đợc loại bỏ Các mẫu đất đợc rửa kết hợp với rây, nhờ đó các mảnh nhỏ với các kích thớc