Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn bacillus có hoạt tính probiotic

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP  BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NĂM HỌC 2020 - 2021 Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC Sinh viên thực hiện: Hoàng Bảo Long Lớp: K62 -CNSH Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Thu Hằng TS Nguyễn Thị Minh Hằng HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Trước tiên với tình cảm sâu sắc chân thành nhất, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô Viện Công Nghệ Sinh Học – trường Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện hỗ trợ, giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu đề tài Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trường đến nay, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý Thầy Cô bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô Viện Công Nghệ Sinh Học truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập trường Nhờ có lời hướng dẫn, dạy bảo thầy cô nên đề tài nghiên cứu em hồn thiện tốt đẹp Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Thu Hằng cô Nguyễn Thị Minh Hằng - người trực tiếp giúp đỡ, quan tâm, hướng dẫn em hoàn thành tốt báo cáo thời gian qua Bước đầu vào thực tế em hạn chế nhiều bỡ ngỡ nên báo cáo Khóa luận tốt nghiệp khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp quý báu quý Thầy Cô để kiến thức em lĩnh vực hồn thiện đồng thời có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức Em xin chân thành cảm ơn! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Bacillus 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus 1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus 1.1.3 Vai trò bào tử Bacillus chế phẩm sinh học sử dụng chăn nuôi 1.1.4 Một số loài Bacillus phổ biến tự nhiên 1.1.5 Cơ sở khoa học để lựa chọn chủng Bacillus sản xuất chế phẩm Probiotic 1.1.6 Ứng dụng Bacillus chăn nuôi 10 1.2 Tổng quan Probiotic 11 1.2.1 Giới thiệu Probiotic 11 1.2.2 Vai trò Probiotic 12 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn vi sinh vật Probiotic 14 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng Probiotic chăn nuôi 14 PHẦN MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16 2.1.1 Mục tiêu chung 16 i 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Vật liệu nghiên cứu 16 2.3.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 16 2.3.2 Môi trường nghiên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus 18 2.4.2 Bảo quản giống vi khuẩn 19 2.4.3 Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng vi sinh vật 19 2.4.4 Tuyển chọn chủng Bacillus có đặc tính Probiotic 20 2.4.5 Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử 23 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus 26 3.2 Tuyển chọn chủng Bacillus có đặc tính Probiotic 29 3.2.1 Tuyển chọn chủng Bacillus có khả kháng vi sinh vật kiểm định … 27 3.2.2 Tuyển chọn chủng Bacillus có khả sinh enzyme ngoại bào 31 3.2.3 Khảo sát khả chịu NaCl 34 3.2.4 Khảo sát khả chịu nhiệt 34 3.3 Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử 36 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ … 39 4.1 Kết luận 38 4.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO … 40 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt LB Chữ viết đầy đủ Nghĩa tiếng Việt Dạng môi trường vi sinh Lysogeny Broth cho nuôi cấy khuẩn vi khuẩn DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase TSA Trypacase Soya Agar Môi trường nuôi cấy không chọn lọc thường sử dụng để nuôi cấy tăng sinh cho nhiều loại vi sinh vật, phù hợp cho vi sinh hiếu khí lẫn vi sinh kỵ khí IAA β-indol-acetic acid Chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA) ATP Là nguồn lượng giúp cho Adenosin Triphosphat bắp tế bào thể ln hoạt động, chuyển hóa EPA Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ Environmental Protection Agency FAO Food and Agriculture Tổ chức Lương thực Nông Organization of the United nghiệp Liên Hiệp Quốc hay Tổ Nations chức Nông lương Liên Hiệp Quốc WHO World Health Organization iii Tổ Chức Y Tế Thế Giới DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm chủng vi khuẩn Bacillus phân lập 26 Bảng 3.2 Xác định khả đối kháng với vi sinh vật kiểm định 29 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng Bacillus 31 Bảng 3.4 Khả chịu NaCl chủng vi khuẩn tuyển chọn 34 Bảng 3.5 Khả chịu nhiệt chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 Bảng 3.6 Thông tin định danh chủng vi khuẩn T1 NCBI 38 iv DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào khả sinh catalase chủng vi khuẩn T1 28 Hình 3.2 Sinh khối vi khuẩn, hình dạng tế bào khả sinh catalase chủng vi khuẩn Đ1-2 28 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào khả sinh catalase chủng vi khuẩn K3 28 Hình 3.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus cereus chủng K3 31 Hình 3.5 Hoạt tính protease ngoại bào chủng vi khuẩn Đ1 33 Hình 3.6 Hoạt tính cellulase ngoại bào số chủng vi khuẩn 33 Hình 3.7 Khả sinh trưởng phát triển đường kính khuẩn lạc chủng Bacillus T1 ni cấy 60ºC mơi trường LB agar 35 Hình 3.8 Kết tách ADN tổng số PCR nhân gen 16s RNA chủng vi khuẩn tuyển chọn 36 Hình 3.9 Trình tự nucleotide chủng vi khuẩn T1 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, công nghiệp sản xuất chế phẩm Probiotic chứa lợi khuẩn ứng dụng chăm sóc sức khỏe động vật phát triển áp dụng rộng rãi Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh việc bổ sung vi khuẩn có lợi cho đường ruột cần thiết từ ngành cơng nghiệp tạo men vi sinh ứng dụng vào thức ăn chăn nuôi phát triển trọng Hằng năm, giới có hàng triệu gia súc, gia cầm chết bệnh đường tiêu hóa như: Bệnh tiêu chảy gặp nhiều lợn bò, bệnh phân trắng gà, bệnh đường ruột khác Nguyên nhân chủ yếu vi sinh vật có hại xâm nhập vào thể vật chủ làm suy giảm miễn dịch, giảm chức đường ruột, phần khác vi khuẩn gây bệnh E Coli, Salmonela làm suy yếu vi sinh vật có lợi đường ruột, làm tổn thương dẫn đến bệnh tiêu chảy, nhiễm trùng đường ruột vật nuôi Các vi sinh vật có ích chế phẩm Probiotic có vai trị quan trọng sức khỏe vật ni trì trạng thái cân hệ vi sinh đường ruột, tăng cường hệ thống miễn dịch thể Không vậy, chế phẩm Probiotic sử dụng thức ăn chăn ni cịn có khả cải thiện sức khỏe vật nuôi, tăng chất lượng vật nuôi, cung cấp chất quan trọng cho thể folic acid, niacin, riboflavin, vitamin B6 B12… nên góp phần mang lại sản phẩm chất lượng ngành chăn nuôi, mang lại nguồn thu không nhỏ cho kinh tế quốc dân Trong số vi khuẩn có lợi thường sử dụng để bổ sung vào chế phẩm sinh học dùng cho động vật vi khuẩn có lợi thuộc chi Bacillus ln đặc biệt quan tâm Hiện nay, dạng chế phẩm sinh học Probiotic từ Bacillus sử dụng ngày phổ biến bệnh đường ruột gia súc Từ lí tơi thực đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có hoạt tính Probiotic” PHẦN TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐÈ NGHIÊN CỨU 1.1 1.1.1 Tổng quan Bacillus Lịch sử nghiên cứu Bacillus Vi khuẩn Bacillus phát vào năm 1835 Christion Erenberg tên loài vi khuẩn lúc “Vibio subtilis” Năm 1872, Cohn đặt tên lại Bacillus subtilis (Gordon, 1981) Họ Bacillaceae chia làm chi gồm: Bacillus, SporolactoBacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortamaculum, đặc trưng họ hình thành nội bào tử [1, 2] 1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus 1.1.2.1 Đặc điểm phân loại Theo khóa phân loại Bergey (2004) [11], Bacillus thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacillus Bộ: Bacillasles Họ: Bacillasceae Chi: Bacillus 1.1.2.2 Đặc điểm phân bố Nhờ khả sinh bào tử nên Bacillus tồn thời gian dài điều kiện khác Chúng phổ biến tự nhiên nên phân lập từ nhiều nguồn khác đất, nước, khơng khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn, … 1.1.2.3 Đặc điểm hình thái đặc điểm ni cấy Vi khuẩn Bacillus thường sinh trưởng nhiệt độ tối ưu 37ºC, vi khuẩn hiếu có lồi lại có khả phát triển mơi trường thiếu oxy Độ pH thích hợp thường 7,0 – 7,4 Bacillus trực khuẩn (hình que), thẳng gần thẳng, kích thước 0,3 – 2,2 x 1,2 – µm Các tế bào thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu trịn vng Bacillus vi khuẩn Gram dương, hầu hết dương tính với catalase Chúng thường di động nhờ roi Một tế bào hình thành nội bào tử có hình oval hình trụ Bào tử có khả chịu nhiệt, axit Sự hình thành nội bào tử khơng bị ngăn cản tiếp xúc khơng khí Các loài thuộc chi Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà giữ nguyên hình que mang bào tử, số trường hợp phình to lên chút Tùy theo loài, bào tử Bacillus nằm giữa, gần cuối, cuối tế bào [2] Hình dạng vi khuẩn mơi trường TSA (Trypcase Soya Agar) khuẩn lạc dạng trịn, rìa cưa khơng đều, đường kính – nm, màu vàng xám, tâm sẫm màu Sau ngày bề mặt vi khuẩn nhăn nheo, màu ngả nâu 1.1.2.4 Đặc điểm sinh hóa Bacillus có khả đồng hóa khơng sinh khí loại đường như: glucose, maltose, manitol, sucrose, xylose arabinose Bacillus thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), khả di động (+) hiếu khí (+) [11] 1.1.3 Vai trị bào tử Bacillus chế phẩm sinh học sử dụng chăn nuôi Trong đường ruột động vật nuôi luôn tồn nhóm vi khuẩn có lợi nhóm vi khuẩn gây bệnh Nguyên lí tồn vi khuẩn đường ruột cạnh tranh dinh dưỡng Nếu bào tử Bacillus nguyên liệu thức ăn chăn nuôi diện với số lượng lớn đường ruột cạnh tranh dinh dưỡng, không gian sống với vi khuẩn khác Bào tử Bacillus nguyên liệu thức ăn chăn nuôi phát triển nhanh, vừa chiếm dinh dưỡng lồi vi khuẩn khác (trong có vi khuẩn gây bệnh), vừa sản sinh kháng sinh thuộc nhóm subtilin làm ức chế sinh trưởng vi khuẩn gây bệnh loại nấm hại Bào tử Bacillus có khả chịu acid dày dịch tiêu hóa, đồng thời khơng chống acid nên vai trị chống lại vi khuẩn gây bệnh đảm bảo C1(1) Cám C2(1) Cám C2(2) Cám 10 C2(3) Cám 11 T1 Thóc 12 T2(1) Thóc 13 T3 Thóc 14 T4(1) Thóc 15 T5 Thóc 16 T6(1) Thóc 17 T6(2) Thóc 18 L1 Dạ dày lợn 19 L2 Dạ dày lợn 20 L4 Dạ dày lợn 21 L3(1) 22 N1(1) Ngô 23 N1(2) Ngô 24 Đ1 Đậu tương 25 Đ1-2 Đậu tương 26 Đ2 Đậu tương Màu trắng ngà, nhạt Màu trắng ngà , trơn, mọc Màu vàng ngà, có bờ nhăn Màu trắng có bờ nhăn Màu trắng hồng, mọc Màu trắng ngà Màu trắng, trơn, mọc Màu trắng nhạt, trơn Màu trắng đục, có bờ nhăn Màu trắng nhạt Màu trắng ngà, mọc lan Màu vàng ngà, mọc li ti Màu trắng ngà, mọc Màu trắng ngà, mọc li ti Dạ dày lợn Màu trắng trơn, mỏng Màu trắng, trơn , mọc dày Màu trắng ngà, mọc Màu trắng, bề mặt nhăn, mọc dày Màu trắng đục, mọc lan, tạo mép cưa Màu trắng trơn, mọc mỏng 27 + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + + Trực khuẩn + A B C Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc (A), hình dạng tế bào (B) khả sinh catalase (C) chủng vi khuẩn T1 A B C Hình 3.2 Sinh khối vi khuẩn (A), hình dạng tế bào (B) khả sinh catalase (C) chủng vi khuẩn Đ1-2 A B C Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc (A), hình dạng tế bào (B) khả sinh catalase (C) chủng vi khuẩn K3 28 Các chủng vi khuẩn có khả thuộc chi Bacillus sau phân lập giữ ống nghiệm chưa mội trường LB agar ống thạch nghiêng để sử dụng cho thí nghiệm Các chủng vi khuẩn bảo quản -20ºC glycerol nhằm giữ giống thời gian dài 3.2 Tuyển chọn chủng Bacillus có đặc tính Probiotic 3.2.1 Tuyển chọn chủng Bacillus có khả kháng vi sinh vật kiểm định Để hạn chế phát triển vi khuẩn gây bệnh, ngồi việc cạnh tranh dinh dưỡng khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh đặc tính quan trọng chủng vi sinh vật chọn làm Probiotic Do đó, từ chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành tuyển chọn chủng có hoạt tính đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột gồm E coli sp (gây tiêu chảy, viêm ruột, tạo độc tố đường ruột động vật), Shigella sp (trực khuẩn lị gây bệnh đường ruột, tiêu chảy người vật nuôi), Bacillus cereus (gây ngộ độc thực phẩm), Salmonella sp (sốt thương hàn, gây tiêu chảy người vật nuôi) Kết xác định khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Xác định khả đối kháng với vi sinh vật kiểm định Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định STT Mã hóa VK E coli sp Shigella sp B cereus Salmonella sp D/d D/d D/d D/d K1(1) - - - - K2 - - - 1,3 K2(1) - - - - K3 2,17 - 1,78 K4 - - - - C1 - - - - C1(1) - - - - 29 C2(1) - - - - C2(2) - - - - 10 C2(3) - - 2,25 - 11 T1 - 1,6 1,13 6,25 12 T2(1) - - 1,5 - 13 T3 - - - - 14 T4(1) - - - - 15 T5 - - - - 16 T6(1) - - - 17 T6(2) - - - - 18 L1 - - - - 19 L2 - - - - 20 L4 - - - - 21 L3(1) - - - - 22 N1(1) - - - - 23 N1(2) - - - - 24 Đ1 - - - 25 Đ1-2 - - - 2,86 26 Đ2 1,25 - 1,5 2,5 Nhận xét: Qua kết nhận trình bày Bảng 3.2 cho thấy: Có 8/26 chủng Bacillus có khả kháng – loại vi sinh vật kiểm định, chủng: T1, T6(1), T2(1), K3, K2, Đ1-2, Đ2, Đ1 Trong chủng vi khuẩn có khả kháng vi khuẩn kiểm định, đáng ý chủng vi khuẩn: Chủng T1 phân lập từ thóc có hoạt tính đối kháng 3/4 loại vi sinh vật gây bệnh Shigella sp., Bacillus cereus Salmonella sp Với hoạt tính đối kháng thể trị số D/d 1,6; 1,13 6,25; Chủng K3 phân lập từ khoai tây kháng E coli, Bacillus cereus (Hình 3.4) Salmonella sp Với hoạt tính đối kháng D/d tương ứng 2,17; 1,78 4,0; Chủng Đ2 phân lập từ bột đậu tương có khả ức chế sinh trưởng E coli, Bacillus cereus Salmonella sp Với D/d tương ứng 1,25; 1,5 2,5 30 Hình 3.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus cereus chủng K3 3.2.2 Tuyển chọn chủng Bacillus có khả sinh enzyme ngoại bào Khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) chủng Probiotic có vai trị quan trọng, nhằm hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, chuyển hóa chất khó tiêu thành chất dễ tiêu, phân hủy thức ăn dư thừa chuồng nuôi làm giảm mùi hôi thối chuồng trại Khả sinh loại enzyme ngoại bào amylase, protease, cellulase 26 chủng vi khuẩn phân lập trình bày Bảng 3.3 số hình ảnh thu nhận q trình làm thí nghiệm trình bày Hình 3.5 Hình 3.6 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng Bacillus Mã hóa VK Hoạt tính amilase Hoạt tính cellulase Hoạt tính protease ngoại bào ngoại bào ngoại bào D d (mm) (mm) T3 T1 T5 - - D/d D d (mm) (mm) - - - D/d D d (mm) (mm) D/d - - - - 10 - - - - 3 - - - 31 T6(1) - - - 3 - - - T4(1) - - - - - - - - - T2(1) - - - - - - - - - T6(2) - - - - - - - - - C2(2) - - - 5 - - - C1 - - - 3 - - - C1(1) - - - 15 - - - C2(1) - - - C2(3) - - - 5 - - - N1(2) - - - 2 - - - L4 - - - - - - - - - L2 - - - - - - - - - L1 - - - - - - - - - L3(1) - - - - - - - - - K3 6 15 15 K2 - - - 11 2,75 - - - K1(1) 5 15 1,88 - - - K2(1) - - - - - - - - - K4 - - - - - - - - - N1(1) - - - 5 - - - 10 3,5 Đ1-2 7 15 7,5 - - - Đ2 10 - - - Đ1 5 10 3,33 20 6,67 - 20 10 K1 - - - - - Kết nhận Bảng 3.2 cho thấy cấy 26 chủng vi khuẩn phân lập mơi trường có chất khoáng thay nguồn pepton, dịch chiết nấm men tinh bột/CMC/casein, có 17/26 chủng có khả sinh trưởng tạo vòng phân giải suốt xung quanh khuẩn lạc 1/3 loại mơi trường khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 32 Trong số chủng Bacillus có khả sinh enzyme ngoại bào mơi trường có nguồn C tinh bột/CMC/casein, có chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme mạnh chủng T1, K3, Đ1-2 Đ1 Cụ thể: Chủng T1 có hoạt tính amylase cellulase ngoại bào với tỷ lệ D/d tương ứng Chủng K3 có hoạt tính loại enzyme với tỷ lệ D/d sinh trưởng mơi trường xác định hoạt tính amylase, cellulase protease 6; 15 Chủng Đ1-2 có hoạt tính amylase cellulase ngoại bào với tỷ lệ D/d tương ứng 7,5 Chủng Đ1 sinh loại enzyme với hoạt tính amylase, cellulase protease (D/d) tương ứng 10; 3,33 6,67 Hình 3.5 Hoạt tính protease ngoại bào chủng vi khuẩn Đ1 Hình 3.6 Hoạt tính cellulase ngoại bào số chủng vi khuẩn 33 Kết xác định khả kháng vi sinh vật kiểm định sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn T1, K3, Đ1-2, Đ1 khơng có khả kháng vi khuẩn gây bệnh quan tiêu hóa mà cịn có hoạt tính enzyme ngoại bào cao Do vậy, đề tài tiến hành lựa chọn chủng vi khuẩn để tiến hành bước khảo sát 3.2.3 Khảo sát khả chịu NaCl Một số đặc tính cần có chủng Probiotic phải có khả chịu NaCl hệ thống tiêu hóa Do vậy, đề tài tiến hành khảo sát khả chịu muối chúng nồng độ muối Kết thu trình bày Bảng 3.4 Bảng 3.4 Khả chịu NaCl chủng vi khuẩn tuyển chọn Tên chủng vi khuẩn Trị số OD600nm ni cấy vi khuẩn mơi trường có nồng độ NaCl (w/v) khác 1% 3% 5% 7% 10% K3 0,900 0,951 0,692 0,317 0,164 Đ1-2 0,917 0,962 0,517 0,255 0,197 Đ1 0,844 0,353 0,119 0,095 0,094 T1 0,962 0,81 0,622 0,308 0,013 Kết khảo sát khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn cho thấy có chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng mạnh mơi trường có nồng độ NaCl khoảng – 5% chủng K3, Đ1-2 T1 Trên sở kết thí nghiệm khảo sát khả chịu NaCl, đề tài lựa chọn chủng K3, Đ1-2 T1 để khảo sát khả chịu nhiệt 3.2.4 Khảo sát khả chịu nhiệt Nhiê ̣t đô ̣ mô ̣t yếu tố môi trường có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng phát triển của chủng q trình ni cấy thực tiễn Ở điề u kiê ̣n nuôi cấy phịng thí nghiê ̣m, chủng ni cấy thường có mơ ̣t giá trị nhiệt ̣ xác định thích hơ ̣p cho q trình sinh trưởng 34 phát triển Do vậy, đề tài tiếp tục khảo sát khảo sát khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn loại nhiệt độ cao 45ºC 60ºC Kết nhận trình bày Bảng 3.5 Hình 3.7 Bảng 3.5 Khả chịu nhiệt chủng vi khuẩn tuyển chọn STT Chủng Khả chịu nhiệt 45ºC 60ºC T1 +++++ ++++ K3 +++++ + Đ1-2 +++++ ++++ Ghi chú: (+++++): Vi khuẩn sinh trưởng tốt, tạo > 30 khuẩn lạc/đĩa (++++):Vi khuẩn sinh trưởng trung bình, tạo < 30 khuẩn lạc/đĩa (+): Vi khuẩn sinh trưởng kém, tạo < khuẩn lạc/đĩa Hình 3.7 Khả sinh trưởng phát triển đường kính khuẩn lạc chủng Bacillus T1 nuôi cấy 60ºC môi trường LB agar Trong số chủng vi khuẩn tuyển chọn , chủng T1 Đ1-2 chịu nhiệt tốt sinh trưởng phát triển hai nhiệt độ thích hợp cho ni cấy vi sinh vật ưa nhiệt 45ºC 60ºC Trong đó, chủng K3 sinh trưởng tốt nhiệt độ 45ºC bị ức chế sinh trưởng 60ºC 35 3.3 Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử Các chủng Bacillus K3, Đ1-2 T1 tuyển chọn nhân sinh khối môi trường LB lỏng, thu sinh khối vi khuẩn tách chiết ADN tổng số Kết tách chiết điện di kiểm tra ADN tổng số gel agarose 1,0% trình bày Hình 3.8A cho thấy ADN tổng số vi khuẩn tách chiết thành công ADN tổng số vi khuẩn sau tách chiết sử dụng làm khuôn cho nhân gen 16s RNA phản ứng PCR với cặp mồi 27F 1492R Kết phản ứng PCR sau điện di kiểm tra gel agarose 1,5% thể Hình 3.8B cho thấy đoạn gen 16s RNA chủng vi khuẩn K3, Đ1-2 T1 nhân thành công với băng đặc hiệu có kích thước khoảng 1,5 kb A B Hình 3.8 Kết tách ADN tổng số (A) PCR nhân gen 16s RNA (B) chủng vi khuẩn tuyển chọn 1,2: ADN tổng số chủng T1 K3(1) M: Marker 1kb 4, 6: Sản phẩm PCR nhân gen 16s RNA chủng T1, K3 Đ1-2 36 Do mục tiêu khóa luận phân lập chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, nên tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên sản phẩm PCR số chủng vi khuẩn (chủng T1) để gửi đọc trình tự nucleotide Kết trình tự nucleotide gen 16s RNA chủng vi khuẩn T1 trình bày Hình 3.9 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACA TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCG GACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAAC TCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTT CAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGC GCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTA GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAA AGTCTGTCGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTA AAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAATAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCAC CTTGACGGTACCTAGCCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGC CGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA AGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCA ACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGA GAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGA ACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAG CGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC CGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCT GCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACT GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCT CTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCATAGTGACAGG TGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGC ACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGAC GTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT GGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACA AATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGC TGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCC CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCC GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGAC AGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC Hình 3.9 Trình tự nucleotide chủng vi khuẩn T1 37 Bảng 3.6 Thông tin định danh chủng vi khuẩn T1 NCBI Chủng Max Query vi khuẩn Score Coverage T1 2769 100% E-value Độ tương Thuộc lồi đồng 0,0 99,8% Bacillus amyloliquefaciens Trình tự nucleotide so sánh độ tương đồng di truyền với lồi ngân hàng gen NCBI cơng cụ BLAST Kết tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự gen 16s RNA chủng T1 (Bảng 3.6) chủng T1 có gen 16s RNA có độ tương đồng 99,8% với trình tự gen tương ứng loài Bacillus amyloliquefaciens Kết định danh sinh học phân tử chứng minh chủng vi khuẩn T1 phân lập thuộc chi Bacillus sp 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã phân lập 26 chủng vi khuẩn có khả thuộc chi Bacillus sp từ nguồn thức ăn chăn nuôi - Tuyển chọn chủng vi khuẩn ký hiệu K3, Đ1-2, T1 có hoạt tính Probiotic: + Kháng vi sinh vật kiểm định + Có hoạt tính amylase, protease, cellulase ngoại bào với đường kính vịng phân giải chất lớn + Có khả sinh trưởng mơi trường có pH thấp + Có khả sinh trưởng mơi trường có nồng độ NaCl cao + Có khả chịu nhiệt - Đã định danh chủng vi khuẩn T1 thuộc loài Bacillus amyloliquefaciens phương pháp sinh học phân tử 4.2 Kiến nghị Do thời gian hạn chế nên chưa thực số công việc cần tiếp tục thực sau: - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển chủng tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng - Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng chủng Bacillus amyloliquefaciens T1 tạo chế phẩm thức ăn chăn nuôi 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Đức Duy Anh (2005) Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM Vũ Ngọc Bội (2004) Nghiên cứu trình thủy phân protein cá enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 Luận án tiến sĩ Sinh học, Tp HCM Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2008) Vi sinh vật học Nxb Giáo dục Bùi Hữu Đoàn, Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Thanh Sơn Nguyễn Huy Đạt (2011) Các tiêu dùng ngiên cứu chăn nuôi gia cầm NXB Nông nghiệp HN Vũ Minh Đức, Bùi Thị Việt Hà, Chu Văn Mẫn, Ngô Tự Thành (2009) Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, số 25, trang 101 - 106 Đỗ Thị Giang (1988) Nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm αamylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis ni cấy phương pháp chìm Luận án PTS, Hà Nội Đào Huyên (2002) Vấn đề sử dụng kháng sinh chăn ni Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Chăn nuôi, số 6, trang 23-27 Lê Hồng Mận (2006) Kỹ thuật chăn nuôi lợn nơng hộ, trang trại phịng chữa bệnh thường gặp NXB Lao động – Xã hội, Hà Nội Nguyễn Văn Thanh (2009) Công nghệ sinh học Dược NXB Giáo Dục Việt Nam, trang 315 40 10 Trần Quốc Việt (2008) Ảnh hưởng việc bổ sung Probiotic vào phần đến khả tiêu hóa, tốc độ sinh trưởng, hiệu sử dụng thức ăn tỉ lệ mắc bệnh tiêu chảy lợn lợn thịt Tạp chí Khoa học Công nghệ chăn nuôi, số 11 10 Tài liệu Tiếng Anh 11 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1984), Sci Ref QR81, 4, B46 12 Fuller, R (1989), Probiotic in man and animals J Appl Bact, 66, 365-378 13 Hong H A., Khaneja R., et al (2009) Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract Res Microbiol, 160(2): 134-43 14 Hong H A., Huang J M., et al (2008) The safety of Bacillus subtilis and Bacillus indicus as food Probiotics J Appl Microbiol, 105(2): 510-20 15 Naidu A S., Bidlack W R., et al (1999) Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB) Crit Rev Food Sci Nutr, 39(1): 13-126 16 NRC (1998) Nutrient Requirement of Swine, 10th ed, National Academy Press Washington, 47 – 70 17 Pushkarev A M., Tuigunova V G., et al (2007) Use of antagonistic Bacillus subtilis bacteria for treatment of nosocomial urinary tract infections Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2: 90-3 18 Tam N K., Uyen N Q., et al (2006) The intestinal life cycle of Bacillus subtilis and close relatives J Bacteriol, 188(7): 2692-700 19 Sorokulova I B., Pinchuk I V., et al (2008) The safety of two Bacillus Probiotic strains for human use Dig Dis Sci, 53(4): 954-63 41