Tuyển chọn và đánh giá đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn bacillus có hoạt tính probiotic bổ sung vào thức ăn cho heo

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ THỊ THANH XUÂN TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO HEO Ngành Công nghệ sinh học Mã số 8420201 Người hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CẢM ƠN Sau hai năm học tập nghiên cứu, tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Công nghệ Sinh học Để đạt thành quả ngày hôm nay, xin bày bỏ lòng biết ơn sâu sác đến TS Nguyễn Xuân Cảnh, người thầy tận tâm học trị Người hết lịng hướng dẫn bảo động viên tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn: Tồn thể q Thầy, Khoa Cơng nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian theo học trường Công ty TNHH dược Hanvet tạo điều kiện tốt cho tơi làm thí nghiệm thực đề tài cách tốt Những người thân u gia đình ln bên cạnh, ủng hộ nguồn động viên lớn lao hy sinh nhiều để tơi có hôm Xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Vũ Thị Thanh Xuân i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệụ, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Vũ Thị Thanh Xuân ii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình, viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu probiotic 2.1.1 Lịch sử probiotic 2.1.2 Định nghĩa probiotic 2.1.3 Đặc điểm chung vi khuẩn probiotic 2.1.4 Cơ chế tác động chung probiotic 2.1.5 Vai trị probiotic vật ni 2.1.6 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 10 2.1.7 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt nam 13 2.2 Vi khuẩn Bacillus 16 2.2.1 Đặc điểm sinh học Bacillus 16 2.2.2 Cơ sở khoa học chọn chủng Bacillus sản xuất probiotic 19 2.2.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic từ chủng Bacillus chăn ni gia súc gia cầm ngồi nước 23 2.3 Probiotic chăn nuôi heo 26 2.3.1 Lợi ích probiotic chăn nuôi heo 27 2.3.2 Các ý sử dụng probiotic 28 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 30 3.1 Vật liệu 30 3.1.1 Nguồn vi sinh vật 30 3.1.2 Thiết bị dụng cụ 30 iii 3.1.3 Hóa chất 30 3.2 Phương pháp nghiên cứu 31 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 31 3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus 32 3.2.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc 32 3.2.4 Phương pháp nhuộm gram 32 3.2.5 Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A.Peskop 33 3.2.6 Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử 33 3.2.7 Phương pháp phân tích vi sinh 36 3.2.8 Phương pháp xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng Bacillus 38 2.2.9 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn sinh sinh vật kiểm định phương pháp đục lỗ thạch 38 3.2.10 Khảo sát khả chịu pH dày 39 3.2.11 Khảo sát khả chịu muối mật 40 3.2.12 Phương pháp tạo chế phẩm 40 Phần Kết thảo luận 42 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus 42 4.2 Sàng lọc tuyển chọn chủng Bacillus có đặc tính probiotic 44 4.2.1 Khảo sát hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định 44 4.2.2 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 47 4.2.3 Khảo sát khả chịu pH dày 49 4.2.4 Khảo sát khả chịu muối mật 50 4.3 Đặc điểm sinh học phân loại chủng Bacillus tuyển chọn 53 4.3.1 Đặc điểm hình thái chủng Bacillus tuyển chọn 53 4.3.2 Đặc điểm sinh hóa chủng Bacillus tuyển chọn 54 4.3.3 Phân loại chủng Bacillus tuyển chọn 56 4.4 Khảo sát điều kiện nuôi cấy 59 4.4.1 Nhiệt độ nuôi cấy 59 4.4.2 Khảo sát pH ban đầu 60 4.5 Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm 61 4.5.1 Tính đối kháng chủng tuyển chọn 61 iv 4.5.2 Quy trình lên men xốp 61 4.5.3 Khả chịu nhiệt chế phẩm 63 Phần Kết luận kiến nghị 65 5.1 Kết luận 65 5.2 Kiến nghị 65 Tài liệu tam khảo 66 Phụ lục 72 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CFU Colony-forming unit CMC Carboxy methyl cellulose Co1 Escherichia coli NA Nutrinet agar NB Nutrient broth NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction Ps1 Pasteurella suiseptica Sc1 Salmonella choleraesuis TSA Tryptone soy agar TSB Tryptic Soy Broth ADN Deoxyribonucleic acid rARN Ribosomal ribonucleic acid Cs Cộng vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tóm tắt chế tác động chủ yếu chủng probiotic lên vật chủ 12 Bảng 2.2 Tóm tắt số thơng tin vài sản phẩm probiotic có mặt thị trường 16 Bảng 2.3 Kết bổ sung probiotic cho heo sau cai sữa (thí nghiệm heo lai D x YL từ ngày tuổi 28 đến 56 ngày) 27 Bảng 2.4 Kết quảcủa probiotic (hỗn hợp L acidophillus, L sporogenes L kefir) đến tăng trưởng tỷ lệ tiêu chảy heo từ sơ sinh đến cai sữa 28 Bảng 4.1 Kết phân lập vi sinh vật từ nguôn khác 42 Bảng 4.2 Đường kính vịng đối kháng chủng Bacillus phân lập với chủng vi khuẩn gây bệnh 44 Bảng 4.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng Bacillus 47 Bảng 4.4 Đánh giá khả chịu pH dày chủng vi khuẩn 49 Bảng 4.5 Đánh giá khả chịu muối mật chủng vi khuẩn 51 Bảng 4.6 Kết API 50CH chủng Bacillus chọn 54 Bảng 4.7 Kết môi tương quan di truyền dòng vi khuẩn tuyển chọn có ngân hàng gen (NCBI) 56 Bảng 4.8 Tính đối kháng chủng nghiên cứu 61 Bảng 4.9 Cơ chất thích hợp cho q trình lên men xơp 62 Bảng 4.10 Hàm lượng vi khuẩn biến động theo thời gian ủ lên men xốp 63 Bảng 4.11 Tỷ lệ sống sót nguyên liệu sấy 1000C 63 vii DANH MỤC HÌNH, Hình 2.1 Cơ chế tác động chung probiotic động vật Hinh 2.2 Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus 17 Hình 3.1 Sơ đồ bố trí nghiệm tổng qt 31 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc sống chủng vi khuẩn phân lập môi trường NA 43 Hình 4.2 Hoạt tính đối kháng chủng Bacillus phân lập với vi khuẩn kiểm định 46 Hình 4.3 Vịng phân giải chất chủng vi khuẩn tuyển chọn 48 Hình 4.4 Hình thái tế bào bào tử chủng chọn (ở độ phóng đại 1250 lần) 53 Hình 4.5 Kết ABI 50 CH chủng Bacillus tuyển chọn 55 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose dòng vi khuẩn tuyển chọn 56 Hình 4.7 Cây phân loại chủng 23 57 Hình 4.8 Cây phân loại chủng 24 58 Hình 4.9 Cây phân loại chủng 25 58 Hình 4.10 Khảo sát nhiệt độ ni cấy chủng Bacillus chọn 59 Hình 4.11 Khảo sát pH ni đến khả sinh trưởng 60 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Thị Thanh Xuân Tên luận văn: Tuyển chọn đánh giá đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic bổ sung vào thức ăn cho heo Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Tuyển chọn đánh giá đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic để tạo chế phẩm Phương pháp nghiên cứu: Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bào tử Xác định số đặc tính probiotic khả chịu axit, chịu muối mật, sinh enzyme ngoại bào, kháng khuẩn gây bệnh Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA để định danh loài Kết kết luận Từ chất chứa ruột phân heo từ trại chăn nuôi, tơi phân lập 40 chủng vi khuẩn có khả sinh bào tử Qua bước sàng lọc tuyển chọn đặc tính probiotic chủng Bacillus chọn chủng 23, 24 25 có tiềm sử dụng làm probiotic Kết xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy chủng 23 B vegensis với mức tương đồng 99,93%, chủng 24 B paralicheniformis với mức tương đồng 100% chủng 25 B coagulans với mức tương đồng 99,66% Xác định nhiệt độ, pH ban đầu thích hợp cho ni cấy Đối với B vegensis 370C, pH 7,0; B paralicheniformis 370C, pH 7,0 B coagulans 400C, pH 7,0 Chọn chất thời gian lên men xốp thích hợp cho hàm lượng vi khuẩn cao Đối với B vegensis tinh bột sắn + 10% đậu tương 72 giờ; B paralicheniformis tinh bột sắn + 5% đậu tương 48 giờ; B coagulans cám gạo 48 ix nghiên cứu sinh trưởng phát triển mạnh nhiệt độ 370C Kết phù hợp với nghiên cứu tác giải Nguyễn Đức Quỳnh Như (2008) phân lập sàng lọc số chủng Bacillus có hoạt tính probiotic ni trồng thủy sản Cịn chủng Bacillus coagulans 400C sau 24 ni cho mật độ tế bào nhất: 62x107CFU/ml Vậy 400C nhiệt độ nuôi cấy tối ưu chủng Bacillus coagulans 4.4.2 Khảo sát pH ban đầu Trị số pH ban đầu mơi trường có vai trị quan trọng, góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn đồng hóa tổng hợp chất cần thiết Nên pH có ảnh hưởng rõ rệt đến tạo thành sinh khối tế bào Do đó,pH yếu tố quan trọng cần nghiên cứu.Với nhóm vi khuẩn Bacillus, pH:6,0-8,5 khoảng pH thích hợp cho sinh trưởng phát triển chúng Chính vậy,để xác định ảnh hưởng pH ban đầu đến tạo thành sinh khối tế bào chủng Bacillus nghiên cứu,tôi nuôi cấy chủng chọn môi trường NB với điều kiện nhiệt độ tối ưu chọn trước, giá trị pH môi trường ban đầu 6,0; 7,0, 8,0 9,0 máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút, thời gian 24 Kết đánh giá qua hàm lượng vi khuẩn bảng sau: Hình 4.11 Khảo sát pH ni đến khả sinh trưởng 60 Từ kết phân tích hình 4.11 cho thấy: - Các chủng Bacillus tuyển chọn sau 24 nuôi cấy, hàm lượng vi sinh vật cao giá trị pH môi trường ban đầu 7.0 Từ phân tích tơi nhận thấy để thuận lợi cho việc nuôi cấy thu sinh khối tiến hành nuôi chủng Bacillus tuyển chọn với mơi trường ni cấy có giá trị pH ban đầu điều chỉnh pH: 7,0 Mặt khác so sánh với kết nghiên cứu Phương Thi Hương, Vũ Văn Hạnh (2017) lựa chọn điều kiện lên men cho sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BSVN15 hoàn giống 4.5 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM 4.5.1 Tính đối kháng chủng tuyển chọn Các chủng ni cấy mơi trường NB lắc 200 vịng 48 để thu dịch nuôi Thử khả đối kháng chủng theo phương pháp nhỏ kết qủa khả quan cho thấy, chủng khơng có tính đối kháng mạnh, tạo điều kiện thuận lợi để tạo hồn hợp chế phẩm Bảng 4.8 Tính đối kháng chủng nghiên cứu Chủng B vegensis B vegensis B paralicheniformis - B coagulan - B paralicheniformis B coagulan - - - Chú thích: (-) khơng đối kháng Bảng cho thấy, chủng tuyển chọn khơng có khả kìm hãm Đó sở để đưa chủng vào hỗn hợp 4.5.2 Quy trình lên men xốp 4.5.2.1 Lựa chọn chất lên men xốp Với tính chất probiotic – chế phẩm sinh học, lựa chọn nguyên liệu rẻ, số lượng lớn, dễ thu mua làm chất cho lên men xốp như: gạo xay, cám gạo, tính bột sắn (khoai mỳ), đậu tương, hỗn hợp hai vài chất để tìm chất thích hợp q trình lên men xốp Kết trình bày bảng 4.9 Bổ sung 10% giống cấp vào chất sấy vô trùng cho độ ẩm 61 đạt khoảng 40-45% Nuôi 48 nhệt độ ni cấy thích hợp, sau thu mẫu xác đinh khả sinh trưởng chủng riêng rẽ Bảng 4.9 Cơ chất thích hợp cho q trình lên men xôp Cơ chất Hàm lượng vi khuẩn (x107 CFU/g) B vegensis B paralicheniformis B coagulans Tinh bột sắn (TBS) 120 187 Đậu tương (ĐT) 36 78 24 Gạo xay (GX) 210 156 Cám gạo (CG) 50 48 360 TBS + 5% ĐT 410 885 29 TBS + 10% ĐT 660 572 512 TBS + 20% ĐT 400 372 24 TBS + % GX 316 412 TBS + 10 % GX 215 218 TBS + 20% GX 180 178 TBS + 5% CG 117 126 TBS+ 10% CG 80 108 TBS + 20% CG 63 97 Từ bảng cho thấy chất thích hợp cho q trình lên men xốp chủng chọn lựa sau: + Đối với chủng B vegensis chất cho hàm lượng vi khuẩn cao sau 48 ủ tinh bột sắn + 10% đậu tương cho hàm vi khuẩn đạt 660 x107 CFU/g + Đối với chủng B paralicheniformis chất cho hàm lượng vi khuẩn cao sau 48 ủ tinh bột sắn + 5% đậu tương cho hàm lượng 88,55x107 CFU/g + Đối với chủng B coagulans chất cho hàm lượng vi khuẩn cao sau 48 cám gạo cho hàm lượng vi khuẩn 363x107 CFU/g 4.5.2.2 Thời gian lên men xốp thích hợp Với chất lên men xốp chọn tiếp tục tiến hành khảo sát thời gian lên men xốp thích hợp Cách làm tương chọn chất lên men xốp thích hợp Cứ sau 24 tiến hành lấy mẫu để xác định khả sinh trưởng chủng vi sinh vật 62 Bảng 4.10 Hàm lượng vi khuẩn biến động theo thời gian ủ lên men xốp Hàm lượng vi khuẩn (x107 CFU/g) Thời gian lên men xốp B.vegensis B.paralicheniformis B.coagulans 24 437 208 121 48 660 885 360 72 760 783 230 Từ kết cho ta thấy chủng chọn thời gian tốt để lên men xốp 48-72 Cụ thể thời gian lên men xốp chủng sau: + Đối với chủng B vegensis thời gian lên men xốp tốt 72 cho hàm lượng vi khuẩn đạt 760x107 CFU/g + Đối với chủng B paralicheniformis thời gian lên men xốp tốt 48 cho hàm lượng vi khuẩn đạt 885x107 CFU/g + Đối với chủng B coagulans thời gian lên men xốp tốt 48 cho hàm lượng vi khuẩn đạt 360x107CFU/g 4.5.3 Khả chịu nhiệt chế phẩm Bảng 4.11 Tỷ lệ sống sót nguyên liệu sấy 1000C Tỷ sót lệ sống sót (%) Thời gian B vegensis B paralicheniformis B coagulans ban đầu 100 100 100 30 phút 97.86 86.21 100 60 phút 95.25 85.33 93.27 90 phút 85.56 72.43 89.34 120 phút 81.88 65.37 86.36 Từ bảng 4.11 thấy, nguyên liệu sản xuất dạng bào tử có khả chịu nhệt 1000C tốt Thể cụ thể sau: + Với thời gian 30 phút sấy loại nguyên liệu có tỷ lệ sống 63 sót ≥ 85% Đặc biệt nguyên liệu Bacillus coagualns sau 30 phút có tỷ lệ sống đạt 100% + Với thời gian 60 phút tỷ lệ sống sót ngun liệu B vegensis, B paralicheniformis B coagulans 95.25 %, 85.33% 93.27% + Với thời gian 90 phút tỷ lệ sống sót ngun liệu có tỷ lệ sống sót ≥ 72.43% + Với thời gian 120 phút tỷ lệ sống sót nguyên liệu đạt cao đạt ≥ 65% nguyên liệu B paralicheniformis Còn nguyên liệu B vegensis, B coagulas có tỷ lệ sống đạt ≥ 81% 64 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ thực nghiệm trên, thu kết sau: Từ chất chứa ruột phân heo từ trại chăn nuôi, phân lập 40 chủng vi khuẩn có khả sinh bào tử Qua bước sàng lọc tuyển chọn đặc tính probiotic chủng Bacillus điều kiện in vitro, nhận thấy chủng 23, 24 25 có tiềm sử dụng làm probiotic Kết xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy chủng 23 B vegensis với mức tương đồng 99,93%, chủng 24 B paralicheniformis với mức tương đồng 100% chủng 25 B coagulans với mức tương đồng 99,66% Xác định nhiệt độ, pH ban đầu thích hợp cho ni cấy Đối với B vegensis 370C, pH 7,0; B paralicheniformis 370C, pH 7,0 B coagulans 400C, pH 7,0 Chọn chất thời gian lên men xốp thích hợp cho hàm lượng vi khuẩn cao Đối với B vegensis tinh bột sắn + 10% đậu tương 72 giờ; B paralicheniformis tinh bột sắn + 5% đậu tương 48 giờ; B coagulans cám gạo 48 5.2 KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp nên thực tất nội dung nghiên cứu cách sâu sắc Do đó, có điều kiện tiếp tục nghiên cứu vấn đề này, chúng tối xin đề nghị nghiên cứu tiếp số nội dung sau: - Nghiên cứu khảo sát điều kiện nuôi cấy khác ảnh hưởng đến hàm lượng vi khuẩn: nguồn cacbon, nguồn nito, - Nghiên cứu khảo sát chất lượng chế phẩm sau thời gian bảo quản nhiệt độ phịng - Thử nghiệm chế phẩm quy mơ chăn nuôi làm sở cho việc sản xuất sử dụng chế phẩm đại trà 65 TÀI LIỆU TAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bùi Thị Huyền, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương, Trần Quốc Việt (2010) “Nghiên cứu thông số kĩ thuật cho sản xuất chế phẩm vi sinh vật cấy dạng lỏng dạng bột dùng chế biến, bảo quản thức ăn thô xanh phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại” Tạp chí khoa học hàng năm, Viện Chăn ni Việt Nam Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa lợn NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Đồn Anh Dũng,Nguyễn Cơng Hà, Lý Nguyễn Bình Lê Nguyễn Đoan Duy (2015), “Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn probiotic LactoBacillus plantarum chế biến sữa chua” tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Đỗ Thị Dung, Lê Thanh Bình, Hồng Thị Đăng Dương, Võ Đình Quàng (2017), “ Tuyển chọn chủng Bacillus spp Sinh enzyme kháng Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng chết sớm (EMS) tơm, Tạp chí phát triển khoa học công nghệ (6) Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu (2009), “Nghiên cứu khả sống mơi trường đường tiêu hóa động vật số chủng vi sinh vật nhằm bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics”, Tạp chí khoa học, 09(55), Trường Đại học Nơng lâm, Đại học Huế tr 82-84 Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu (2009), “Nghiên cứu khả sống mơi trường đường tiêu hóa động vật số chủng vi sinh vật nhằm bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotic”, Tạp chí khoa học, 09 Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế tr.82-84 Hội Chăn nuôi Việt Nam (2008), “Probiotic – lợi ích triển vọng”, tạp chí chăn nuôi, 08 tr.5-9 Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình VSV Cơng nghiệp NXB Khoa học kỹ thuật,Hà Nội tr 100-108 Lã Văn Kính (1998), Những tiến khoa học kỹ thuật công nghệ sản xuất thức ăn gia súc vai trò probiotic sức khỏe động vật, Báo cáo khoa học, Trung tâm Thông tin KH & CN, Sở KHCN Môi trường Tp.HCM 66 10 Lê Thanh Bình, Phạm Thị Ngọc Lan, Yoshimi Benno (1999), “Tác dụng tăng trưởng gia cầm chế phẩm vi sinh vật PRO 99”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 1999 tr 139-144 11 Lương Đức Phẩm (2007), Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản NXB Nông nghiệp, Hà Nội tr 112-152 12 Nguyễn Lan Anh, Đinh Mỹ Hằng, Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Hương Giang, Nguyễn Thị Lộc (2003), “Đặc điểm chủng vi khuẩn LactoBacillus plantarum có ứng dụng cơng nghệ sản xuất nước CVAS”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm tr 159-161 13 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.224-230 14 Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thuỳ Châu (2003), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm tr 251-255 15 Nguyễn Văn Bá cs (2002), Sử dụng chế phẩm Lactic phòng chống tiêu chảy heo con, Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp bộ, trường ĐH Cần Thơ 16 Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003), “Đặc điểm phân loại chủng LactoBacillus probiotic CH123 CH 126 phân lập từ đường ruột gà”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm tr 101-105 17 Phạm Thị Trân Châu (2007), Công nghệ sinh học (tập 3) NXB Giáo dục, Hà Nội 18 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2009), Công nghệ vi sinh môi trường, NXB Giáo dục, Hà Nội 19 Phương Thị Hương, Vũ Văn Hạnh (2017) “ Lựa chọn điều kiện lên men cho sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BSVN15 ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic chăn ni” tạp chí Cơng nghệ Sinh học 20 Trần Quốc Việt c.s (2008), Nghiên cứu thông số kĩ thuật sản xuất probiotic dạng lỏng va dạng bột dùng chăn nuôi, Báo cáo khoa học hàng năm,Viện chăn nuôi, Viện vi sinh vật Công nghệ Sinh học – Đại học Quốc Gia Hà Nội 21 Trần Quốc Việt c.s (2010), Nghiên cứu sản xuất probiotic enzyme tiêu hóa dùng chăn ni, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ, Viện Chăn nuôi Việt Nam 67 22 Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB Giáo dục,Hà Nội tr.45-56, 97-102, 163-171 23 Trần Thị Dân (2002), Thay đổi sinh lý heo con, Tài liệu giảng dạy, Trường Đại học Nông lâm Tp HCM II Tài liệu tiếng Anh: 24 Apajalahti J.H.A, L.K Sarkilabti, B.R.E Maki, J.P Heikkinen, P.H Nurminen and W.E Holben (1998), “Effective recovery of bacteria DNA and percentguanine-plus-cytosin-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens”, Appl Environ Microbiol, 64 pp 4084 – 4088 25 Aronson A I and Fitz J 1976, Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat, Bacterial Rev 40 pp 360-402 26 Arturo A., Mario Rosa M., and Maria A M., (2006), “Probiotic for animal nutrition in the European Union”, Regulation and safety assessments, 45 pp 91-95 27 Badre Halimi, Carine Dortu, Anthong Argwelles Arias philippe Thonart, Bernard joris Patrick Pakes (2010), Antilisterial Activity on Poultry Meat of Amylosin, Bacteriocin from Bacillus amyloliquefaciens GA1, Probiotic & Antimicro Prot, DOI10.1007/s 12602-00-9040-9 28 Bula J.A, Costilow R, Sapple E.S (1978), “Biology of Bacillus popillae, Adv Appl, Microbiol, 23 pp 1-18 29 Czerucka D and Rampal P (2002), “Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens”, Microbes and infection, pp 733-739 30 Dai D., Nanthkumar N N., Newburg D S and Walker W.A (2000), “Role of oligosaccharides and glycol conjugates in intestinal host defense J Pediatric Gastroenterol Nutr, 30 pp S23–S33 31 Eui-Sun Son and Jong-Il Kim (2002), Purification and Characterization of Caseinolytic Extracellular protease from Bacillus amyloliquefaciens S94, The Journal of Microbiology, 40 (1) pp 26-32 32 FAO/WHO (2002), Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002 33 FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, 68 Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria Argentina October 2001 34 Fialho E.T., Vassalo M, Lima J.A.F and Bertechine A.G (1998), “Probiotics utilization for piglets from 10 to 30 kg (performance and metabolism assay)”, In: Proceedings Contributed Papers - Vol The 8th World Conference on Animal Production June 28-July 4, 1998, Seoul National University, Seoul, Korea pp 622-623 35 Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals” J Appl Bacteriol, 66 pp 65–78 36 Fuller R (1992), “History and development of probiotics”, In: R Fuller (Ed.) Probiotics: The Scientific Basis pp 1−8 Chapman & Hall, London 37 Galassi G.; Sandrucci A.; Tamburini A.; Succi G (2001), “Energy utilization of a low N-diet added with an antibiotic or with a probiotic in fattening pigs”, Animal physiology – Nutrition, Proceedings of the 15th symposium on energy metabolism in animals, Wageningen pp 145-148 38 Gardiner G.E., O’Sullivan E., Kelly J., Auty M.A.E., Fitzgerald G.F (2000), “Comparative Survival Rates of Human-Derived Probiotic LactoBacillus paracasei and L salivarius Strains during Heat Treatment and Spray Drying”, Applied and Environmental Microbiology 66(6) pp 2605-2612 39 Gibson T Gordon Ruth E (1975), Bacillus in Bergey`s Manual of Detemenative Bacteriology, R.E Buchanan & N.E Gibbons Editors, willion & Wilkins, pp576-583 40 Glick B (1995), The immune system of poultry, Poultry Production P Hunton, ed Elsevier Science, Amsterdam pp 55-62 41 Hector C (2006), Assessing The Results Of The EU Ban On Antibiotic Feed Additives 42 Hershberg R.M and L F Mayer (2000), “Antigen processing and presentation by intestinal epithelial cells – polarity and complexity”, Immunol Today 21 pp 123–128 43 Hong, H.A., Duc le, H., and Cutting, S.M., 2005, The use of bacterial spore formers as probiotics, FEMS Microbiol Rev 29 pp 813-835 44 Idris SE, Iglesias DJ, Talon M, Borriss R (2007), Tryptophan- dependen production of Indoles-3-Acetic (IAA) affects level of plant grawth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42, Molecular-Microbe Interactions, 20 ( 6) pp 619-626 69 45 Jans D (2005), “Probiotics in Animal Nutrition”, Booklet www Fefana.org pp 4-18 46 Lessard M and Brisson G J (1987), “Effect of a LactoBacillus fermentation product on growth, immune response and fecal enzyme activity in weaned pigs”, Can J Anim Sci, 67 pp 509-516 47 Navas Sánchez, Yannellys; Quintero Moreno, Armando; Ventura, Max; Casanova, Angel; Páez, Angel y Romero, Santos (1995), “Use of probiotics in the feeding of pigs in the postweaning phase”, Revista Científica, 5(3) pp 193-198 48 Patterson J.A and Burkholder K.M (2003), “Application of prebiotics and probiotics in poultry production”, J Animal Science, 82 pp 627-631 49 Qamar A., Aboudola S and Warny M (2001), “Saccharomyces boulardii stimulates intestinal immunoglobulin A immune response to Clostridium difficile toxin A in mice”, Infect Immun, 69 pp 2762 50 Rolfe R.D (2000), “The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health”, J Nutr, 130 pp 396S–402S 51 Sander, M E., Morelli, L and Tompkins, T A (2003), Sporeformers as human probiotic: Bacillus, sporolactoBacillus, and BreviBacillus, Comprehensive Review in food Science and food Safety pp.101-110 52 Sanders M E and Klaenhammers T R (2001), “The scientific basis of LactoBacillus acidophilus NCFM functionality as a probiotic”, J Dairy Sci 84 pp 319-321 53 SCAN (2000): Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the Safety of Use of Bacillus Species in Animal Nutrition European Commission Health & Consumer Protection Directorate-General 54 Schat K.A and Myers T J (1991), “Avian Intestinal Immunity”, Crit Rev Poult Biol, pp 19–34 55 Schillinger U (1996), “Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods”, Trend in food Science and Technology, 64 pp 158-164 56 Sutyak K, Wrawan R, Aroutchera A, Chikindas M (2008), Isolation of the Bacillus amyloliquefaciens antimicrobial peptide subtilesin from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens, J Appl Microbiol 104 pp 1067-1074 70 57 Vahjen W., Glaser V and Simon O (1998), “Influence of xylanase supplemented feed on the development of selected bacterial groups in the intestinal tract of broiler chicks”, J Agr Sci., 130 pp 489-500 58 Van der Wielen P.W.J, Biesterveld J S., Notermans S., Hofstra H and Van knapen F (2000), “Role of volatile fatty acid development of the cecal microflora in broiler chicken during growth”, Appl Environ Microbiol, 66 pp 2536-2540 59 Zhu S.Y., Zhong T., Pandya Y and Joerger R D (2002), “16S rRNA-based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens”, Appl Microbiol, 68 pp 124–137 60 www.cynosura.org/index.php 71 PHỤ LỤC + Trình tự chủng 23 GGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTC TCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCG GCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGC AGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCG GTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCAT AAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCG GCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTT GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAA CCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGA TTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTA AACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCA GTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCA CTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGA CTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTC AGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTA CGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTT CCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGA CTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCT TGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTC TGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCC TAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGC TCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAG GAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCG GCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCG CCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACC ATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCC CAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACA TCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGC CGCCAGCGTTCGTCCTGAGCAGA + Trình tự chủng 24: GGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTC GTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCA TGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGAC 72 TGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAGCCTCGCGGCTTC GCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGG GCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTC ACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTC GTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGC ACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAG AGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACAT GCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCG ACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGG CGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGG GTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAG ACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCA CCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTC CAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAAC CGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACG TATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACC GTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGT TTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTT CGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGT GTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTG CCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTG TAAGTGGTAGCTAAAAGCCACCTTTTATAATTGAACCATGCGGTTCAATCAA GCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGG TTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTGACATCAGGGAGCAAGCTCCC ATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGA GCCAG + Trình tự chủng 25: CACCTTCGGCGGCTGGCTCCGTAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACA AACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCAC CGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGGGT TGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGAATGGTTTTCTGGGATTGGCTTAACCTCG CGGTCTCGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTC ATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC GGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGTCAAGGGT TGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACA ACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAGGCCCTGTCTCCAG GGAGGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATT 73 AAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTC AGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGC ACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGG ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGT CAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTA CGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGCC TCCCAGTTTCCAATGACCGCTTGCGGTTGAGCCGCAAGATTTCACATCAGAC TTAAGAAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTG CCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGG CCGGGTACCGTCAAGGCGCCGCCCTGTTCGAACGGCACTTGTTCTTCCCCGG CAACAGAGTTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCG TCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT TTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTAC GCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGG GCCCATCTGTAAGTGACAGCCAAAGCCGTCTTTCCTTTTTCCTCCATGCGGA GGAAAAAACTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGCGTTATCCCGATCTTA CAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCTTTTAAAAG CAAGCTTTTAAAAGGTCCGCACGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGC GTTCGTCCTGAGCA 74 ... số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic bổ sung vào thức ăn cho heo Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Tên sở đào tạo: Học vi? ??n Nơng nghiệp Vi? ??t Nam Mục đích nghiên cứu: Tuyển chọn. .. chọn đánh giá đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic để tạo chế phẩm Phương pháp nghiên cứu: Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bào tử Xác định số đặc tính probiotic. .. đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic bổ sung vào thức ăn cho heo? ?? với định hướng tìm vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic phù hợp với heo nội địa Đề tài thực