Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens trong thử nghiệm xử lý bùn thải của nhà máy chế biến tôm

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ NGUYỄN CHÂU GIANG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens TRONG THỬ NGHIỆM XỬ LÝ BÙN THẢI CỦA NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TƠM KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Đà Nẵng - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ NGUYỄN CHÂU GIANG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens TRONG THỬ NGHIỆM XỬ LÝ BÙN THẢI CỦA NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TƠM Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 7420201 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng viên hướng dẫn: TS Đoàn Thị Vân Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu hướng dẫn Tiến sĩ Đồn Thị Vân Khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng chưa cơng bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Đà Nẵng, tháng năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Châu Giang i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực khoá luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình thực đề tài khố luận Để hồn thành khố luận tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, xin chân thành cảm ơn đến TS Đồn Thị Vân tận tình hướng dẫn, khích lệ, động viên định hướng cho tơi suốt q trình thực khố luận tốt nghiệp Cảm ơn bạn 17 CNSH đồng hành tơi, ln hỗ trợ nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khố luận Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bùn thải tôm 1.1.1 Thực trạng ngành xuất tôm 1.1.2 Khái quát bùn thải 1.1.3 Thành phần đặc tính bùn thải tôm 1.1.4 Quy định bùn thải Việt Nam 1.1.5 Hiện trạng giải pháp xử lý bùn thải 1.1.6 Vai trò ứng dụng vi sinh vật xử lý bùn thải 10 1.2 Khái quát chung Bacillus amyloliquefaciens 11 1.2.1 Lịch sử phát 11 1.2.2 Vị trí phân loại 12 1.2.3 Phương pháp phân lập 12 1.2.4 Đặc điểm sinh học phân bố tự nhiên 13 1.2.5 Đặc điểm sinh lý sinh hóa Bacillus amyloliquefaciens 13 1.2.6 Một số ứng dụng Bacillus amyloliquefaciens 14 iii CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Phạm vi nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp thu mẫu phân lập vi sinh vật từ bùn thải nhà máy chế biến tôm 18 2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 18 2.3.3 Phương pháp test phản ứng sinh hóa chủng Bacillus 18 2.3.4 Định danh vi sinh vật kỹ thuật sinh học phân tử 19 2.3.5 Xây dựng đường chuẩn chủng Bacillus amyloliquefaciens 19 2.3.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn 20 2.3.7 Phương pháp xác định khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn 21 2.3.8 Khả đối kháng với chủng gây bệnh 21 2.3.9 Phương pháp nhân nhanh sinh khối 21 2.3.10 Phương pháp thử nghiệm ứng dụng vi khuẩn xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm 22 2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Phân lập định danh vi khuẩn từ bùn thải nhà máy chế biến tôm 24 3.1.1 Phân lập vi khuẩn từ bùn thải nhà máy chế biến tôm 24 3.1.2 Xác định phản ứng test sinh - hoá vi khuẩn Bacillus sp 25 3.1.3 Định danh vi khuẩn Kỹ thuật sinh học phân tử 26 3.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn 28 3.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 28 3.2.2 Ảnh hưởng pH 29 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 30 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl 31 3.2.5 Xây dựng đường cong sinh trưởng 32 iv 3.3 Khảo sát đặc tính sinh học vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208 33 3.3.1 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208 33 3.3.2 Khảo sát khả đối kháng B amyloliquefaciens DV20208 với chủng vi sinh vật gây hại 34 3.4 Thử nghiệm ứng dụng B amyloliquefaciens DV20208 xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm 35 3.4.1 Nhân nhanh sinh khối chủng B amyloliquefaciens DV20208 35 3.4.2 Thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BLAST : Basic Local Alignment Search Tool CFU : Colony forming units MT : Môi trường NCBI : National Center for Biotechnology Information OD : Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Axit ribonucleic VK : Vi khuẩn VKQH : Vi khuẩn quang hợp VSV : Vi sinh vật vi DANH MỤC BẢNG Bảng Tiêu đề bảng Trang 2.1 Tỉ lệ C/N bùn thải nhà máy chế biến tôm trước ủ 22 2.2 Thành phần nguyên liệu trước ủ 22 2.3 Các công thức ủ xử lý bùn thải 22 3.1 Đường kính vịng phân giải enzyme B amyloliquefaciens DV20208 34 3.4 Ảnh hưởng chất đến nhiệt độ trình ủ 36 3.5 Ảnh hưởng chất đến độ ẩm trình ủ 37 3.6 Ảnh hưởng chất đến độ sụt giảm thể tích khối ủ 38 3.7 Mật độ VSV tổng số VSV gây bệnh sau trình ủ (15 ngày) 39 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.1 Kim ngạch xuất tôm Việt Nam năm 2019 – 2020 1.4 Phản ứng sinh hoá B amyloliquefaciens B subtilis 14 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 18 2.2 Mối tương quan OD mật độ tế bào 20 3.1 Hình thái khuẩn lạc Bacillus mơi trường LB 24 3.2 Hình thái tế bào vi khuẩn sau nhuộm Gram (100x) 24 3.3 Kết thử nghiệm catalase 25 3.4 Hoạt tính sinh tổng hợp oxidase vi khuẩn 26 3.5 Khả di động vi khuẩn 26 3.6 Kết phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA vi khuẩn 27 3.7 Kết tra cứu BLAST NCBI 27 3.8 Cây phát sinh loài dựa mối quan hệ di truyền chủng 28 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 29 3.10 Sinh khối DV20208 giá trị pH từ 2-9 sau 24 nuôi cấy 30 3.11 Ảnh hưởng pH 30 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ 31 3.13 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl 32 3.14 Đường cong sinh trưởng B amyloliquefaciens DV20208 33 3.15 Khả sinh enzyme B amyloliquefaciens DV20208 34 3.16 3.18 Khả đối kháng B amyloliquefaciens với chủng gây bệnh Các công thức ủ sau 20 ngày 34 40 viii Ni cấy lắc B amyloliquefaciens DV20208 bình mơi trường LB lỏng, pH=7 với nồng độ muối NaCl thay đổi từ 1, 3, 5, 7, 9% Nuôi cấy lắc với chế độ 150 vòng/phút 35oC Sau 24 ni cấy, kết thể hình 3.13 Mật độ tế bào (LogCFU/ml) 12.50 12.06 11.76 12.00 11.46 11.29 11.50 10.73 11.00 10.50 10.00 Nồng độ muối NaCl (%) Hình 3.13 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl Kết từ hình 3.13 cho thấy, sau 24 nuôi cấy vi khuẩn DV20208 lồi ưa muối, chúng có khả chịu đựng sống sót tất nồng độ muối, có khả sinh trưởng phát triển nồng độ muối cao 9% với tỷ lệ mật độ vi khuẩn dao động không đáng kể Mật độ tế bào vi khuẩn B amyloliquefaciens DV20208 giảm dần nồng độ muối tăng dần So với nồng độ muối 5%, 7%, 9% nồng độ muối 1% 3% có mật độ tế bào vi khuẩn cao Ngoài ra, DV20208 phát triển tốt nồng độ muối 3% môi trường nuôi với mật độ 12,06 LogCFU/ml điều phù hợp với nghiên cứu trước khảo sát khả chịu muối B amyloliquefaciens (Ngô Thị Thu Thảo et al., 2016; Das et al., 2014) 3.2.5 Xây dựng đường cong sinh trưởng Đường cong sinh trưởng xây dựng với mục đích nghiên cứu định tính VSV theo thời gian xác định thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998) Tiến hành nuôi cấy lắc B amyloliquefaciens DV20208 với chế độ 150 vịng/phút mơi trường LB lỏng pH = 7, tỷ lệ cấp giống 5% nhiệt độ 35°C thời gian 60h Kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật: thông qua mối tương quan giá trị OD phương trình tương quan để tính mật độ tế bào Từ đó, xây dựng đường cong sinh trưởng B.amyloliquefaciens DV20208 (hình 3.15) 32 Mật độ tế bào(LogCFU/ml) 12.50 12.00 11.50 11.00 10.50 10.00 9.50 9.00 8.50 8.00 12 18 24 30 36 Thời gian (giờ) 42 48 54 60 Hình 3.14 Đường cong sinh trưởng B amyloliquefaciens DV20208 Kết xác định mật độ tế bào vi khuẩn thời gian khác thể hình 3.14 cho thấy: B amyloliquefaciens DV20208 sinh trưởng phát triển tốt (pha log) khoảng thời gian từ 12 đến 24 giờ, sau 24 nuôi cấy, mật độ tế bào đạt 12,20 LogCFU/ml Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào giảm dần bắt đầu pha suy vong sau 30 giờ, hàm lượng chất dinh dưỡng môi trường cạn kiệt, cạnh tranh chất dinh dưỡng VK diễn ra, với sản phẩm trình trao đổi chất ức chế phát triển VK nên số lượng tế bào sinh số lượng tế bào (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998) Chủng B amyloliquefaciens có khả sinh bào tử để trở trạng thái tiềm sinh nên kéo dài thời gian nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt chủng giữ mức ổn định định mật độ tế bào Vì vậy, ni cấy B amyloliquefaciens DV20208 mơi trường LB lỏng, pH = 7, tỷ lệ cấp giống 5% nhiệt độ 35°C, tiến hành thu sinh khối mốc 18 nuôi cấy Trong hầu hết nghiên cứu lựa chọn thời gian sinh trưởng thích hợp, chủng Bacillus lên men khoảng thời gian từ 18-24 (Sreekumar and Krishnan, 2010; Han et al., 2014; Tuan and Huong, 2014) để đảm bảo cho sinh khối thu với tỷ lệ cao 3.3 Khảo sát đặc tính sinh học vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208 3.3.1 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208 Bacillus amyloliquefaciens DV20208 nuôi cấy môi trường LB lỏng, pH = 7, với tỉ lệ tiếp giống B amyloliquefaciens DV20208 5%, nhiệt độ 35oC Tiến hành nuôi cấy lắc với chế độ 150 vòng/phút, vòng 24 Ly tâm dung dịch sau nuôi cấy chế độ 8000 vòng/phút, 10 phút tiến hành xác định hoạt tính enzyme amylase, protease, cellulase chitinase phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết 33 nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào B amyloliquefaciens DV20208 thể bảng 3.1 hình 3.16 Bảng 3.1 Đường kính vịng phân giải enzyme B amyloliquefaciens DV20208 Đường kính vịng phân giải (cm) Chitinase Protease Cellulase Amylase 1,8 ± 0,08 3,19 ± 0,14 1,24 ± 0,12 2,88 ± 0,08 Hình 3.15 Khả sinh enzyme B amyloliquefaciens DV20208 (A: Chitinase; B: Protease; C: Cellulase; D: Amylase) Từ kết bảng 3.1 hình 3.15 cho thấy chủng B amyloliquefaciens DV20208 có khả phân giải chitin, cellulose, protein, tinh bột Như vậy, B amyloliquefaciens DV20208 có khả sinh loại enzyme ngoại bào tương ứng: chitinase, protease, cellulae, amylase.Trong đó, khả sinh enzyme protease cao nhất, đường kính vịng phân giải đạt 3,19 ± 0,14 cm Điều phù hợp với nghiên cứu trước (Trịnh Thành Trung et al., 2013) khả sinh enzyme ngoại bào từ B amyloliquefaciens phân lập Vườn Quốc gia Hoàng Liên 3.3.2 Khảo sát khả đối kháng của B amyloliquefaciens DV20208 với các chủng vi sinh vật gây hại Đánh giá khả kháng khuẩn B amyloliquefaciens DV20208 phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết thu thể hình 3.16 34 Hình 3.16 Khả đối kháng B amyloliquefaciens với chủng gây bệnh (A: E.coli; B: Ralstonia; C: B.cereus) B amyloliquefaciens DV20208 có khả đối kháng với E.coli, Ralstonia B.cereus (Hình 3.16) với đường kính vịng kháng khuẩn 1,3 ± 0,2 cm; 1,08 ± 0,4 cm; 1,42 ± 0,2 cm Theo kết nghiên cứu Nguyễn Quang Huy cs (2012) khả tạo biofilm khả đối kháng với E.coli B.subtilis UI.3 khả đối kháng với mạnh với Samonella Ralstonia Bacillus velezensis U3.7 (Nguyễn Quang Huy and Trần Thúy Hằng, 2012) Hay cơng trình nghiên cứu chủng Bacillus subtilis RB14 có khả kháng Rhizoctonia solani gây bệnh cà chua, nhiên, với chủng vi khuẩn gây hại khác chưa có nhiều kết nghiên cứu tương tự (Asaka and Shoda, 1996) Bacillus amyloliquefaciens DV20208 có khả sinh enzyme ngoại bào cao protease, chitinase, amylase, cellulase có khả đối kháng với VSV gây bệnh như: E.coli, Ralstonia, B.cereus nên chủng vi khuẩn có tiềm xử lý nguồn bùn thải nhà máy chế biến tơm có khả kiểm soát mầm bệnh bùn thải 3.4 Thử nghiệm ứng dụng B amyloliquefaciens DV20208 xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm 3.4.1 Nhân nhanh sinh khối chủng B amyloliquefaciens DV20208 Dựa vào kết nghiên cứu phần 2.2.6, tiến hành nuôi cấy lắc B amyloliquefaciens DV20208 môi trường LB, pH = 7, nhiệt độ 35oC, tỉ lệ tiếp giống 5% Sau 18 nuôi cấy, mật độ tế bào đạt 12,09 LogCFU/ml Tiến hành thu sinh khối B amyloliquefaciens DV20208 để thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm 3.4.2 Thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm Bùn thải nhà máy chế biến tơm xử lý sơ có kích thước hạt từ - 4cm, độ ẩm bùn thải đạt 30 - 40%, pH = 7,14; nhiệt độ ban đầu bùn thải với nhiệt độ môi trường Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến trình phân hủy chất hữu vi sinh vật, tỉ lệ C/N thơng số dinh dưỡng quan trọng C/N thông số quan trọng chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật Cacbon chất thải hữu vi sinh vật đồng hóa để tạo nên tế bào chiếm khoảng 20 - 40%, phần lại biến đổi thành CO2 trình sinh lượng Các tế bào vi khuẩn chứa 50%C 5%N, lượng đạm cần thiết khối ủ phải chiếm từ - 4% Quá nhiều cacbon làm chậm trình phân hủy, cịn lượng đạm cao gây mùi hôi thối (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998) Tỉ lệ C/N tối ưu cho trình ủ phân khoảng 25/1-30/1 Ở mức tỷ lệ thấp hơn, nitơ thừa sinh NH3, gây mùi khai Ở mức tỉ lệ cao hơn, hạn chế phát triển vi sinh vật thiếu N Chúng phải trải qua nhiều chu kỳ chuyển hóa, oxy hóa 35 cacbon dư đạt tỉ lệ C/N thích hợp Do đó, thời gian cần thiết cho trình phân hủy bị kéo dài sản phẩm thu chứa mùn Thử nghiệm ứng dụng B amyloliquefaciens DV20208 để xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm theo công thức, thể bảng 2.1 Sau nguyên liệu xử lý sơ tiến hành ủ theo dõi trình ủ nhiệt độ, độ ẩm độ sụt giảm thể tích Theo dõi công thức ủ, thu thập số liệu theo chu kì ngày Số liệu lần đo lặp lại lần lấy giá trị trung bình Sự ảnh hưởng nhiệt độ, độ ẩm, độ sụt giảm thể tích, mật độ VSV thể bảng 3.4, bảng 3.5,bảng 3.6 bảng 3.7 Bảng 3.4 Ảnh hưởng chất đến nhiệt độ trình ủ Thời gian (ngày) CT1 CT2 CT3 CT4 26oC 27oC 27oC 27,5oC 37oC 42,5oC 40oC 40,5oC 10 39oC 48,5oC 46,5oC 46,5oC 15 37oC 47oC 43,5oC 46,5oC 20 37oC 45oC 43oC 43oC Qua bảng thống kê số liệu thay đổi nhiệt độ trình ủ cho thấy: Ở ngày sau ủ, CT phối trộn có bổ sung chế phẩm B amyloliquefaciens DV20208 nhiệt độ tăng mạnh so với công thức đối chứng (CT1) Nguyên nhân phát nhiệt lưu giữ nhiệt CT ủ Nhiệt độ tăng cao chứng tỏ vi sinh vật đống ủ hoạt động mạnh thúc đẩy trình phân hủy chất hữu Sự phát nhiệt oxy hoá hợp chất hữu hoá chuyển thành nhiệt hoạt động trao đổi chất phân huỷ hữu vi sinh vật Giai đoạn từ 5-10 ngày, công thức CT2, CT3, CT4 có nhiệt độ ủ cao 45°C Kết tương tự nghiên cứu Lý Thị Phương Hồng (2012) với nguyên liệu bùn từ trạm xử lý nước thải sinh hoạt Tuy nhiên, thời gian đạt ngưỡng nhiệt độ cao theo nghiên cứu Lý Thị Phương Hồng (2012) sau ngày sau ủ, nghiên cứu 10 ngày Vào ngày 10 sau ủ, CT3 Nhiệt độ đạt ngưỡng tối đa 46,5°C CT2 CT4 48,5°C 46,5°C nguyên nhân vật liệu phối trộn gỗ keo tràm sau trồng nấm có độ rỗng cao mùn cưa sau trồng nấm nên khả khuếch tán khí tốt khả giữ nhiệt 36 Ở cơng thức (CT2, CT4) có bổ sung chế phẩm B.amyloliquefaciens DV20208, giữ nhiệt 45oC ngày thứ 15 Đây khác biệt rõ ràng với công thức đối chứng (nhiệt độ đống ủ thấp 40°C) Tuy nhiên, ngưỡng nhiệt độ thấp ủ compost thành phần chất hữu chất thải rắn sinh hoạt (CTRSH) (~70°C, Nhà máy Compost Vietstar, 2014) thấp ủ bùn thải từ trạm xử lý nước thải sinh hoạt (~61°C, Lý Thị Phương Hồng 2012), cao so với ủ bùn từ ao nuôi tôm (~31°C, Trần Thị Thùy Dương 2012) Nhiệt độ tăng vi sinh vật chuyển hóa chất hữu phức tạp thành đơn giản góp phần giúp cho đống ủ nhanh hoai mục Feachem et al (1983), nhiệt độ đống ủ 45°C có khả tiêu diệt mầm mống số loại bệnh hại (E coli, Salmonella) có bùn thải nhà máy chế biến tơm Ngày thứ 15 đến ngày 20 , nhiệt độ CT ủ giảm dần chất hữu phân hủy gần hết, nên vi sinh vật phát triển chậm lại, trình chuyển hóa hợp chất hữu Ngồi phần thất thoát nhiệt trình ủ, nên lượng nhiệt sinh ngày Bảng 3.5 Ảnh hưởng chất đến độ ẩm trình ủ Thời gian (ngày) CT1 CT2 CT3 CT4 82,5 72,8 73,7 74,2 79,8 69,2 71,5,3 70,9 10 76,1 67,5 69,2 69,3 15 73,2 63,1 66,1 67,3 20 71,3 63 65 64,6 Trong trình ủ, độ ẩm yếu tố quan trọng việc tạo môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển nên yếu tố độ ẩm kiểm tra thường xuyên trì khoảng tối ưu Độ ẩm đầu vào trung bình cơng thức 74,05% với ẩm độ trình ủ ban đầu chưa hiệu theo Bertoldi et al (1983), vật liệu hữu có phối trộn với bùn thải, ẩm độ yêu cầu đạt khoảng 65 - 67%, q trình ủ đạt hiệu ẩm độ cho thích hợp cho vi khuẩn hiếu khí hoạt động (Lê Hoàng Việt Nguyễn Hữu Chiếm, 2013; Rudat et al., 1999).Ở công thức (CT2, CT3, CT4) nhiệt độ tăng cao nước tách khỏi khối ủ nhanh qua đường bốc nước độ ẩm cơng thức ủ giảm nhiều so với CT1 100% bùn thải nên độ kết dính cao, độ xốp thấp nên khả thơng khí nước khối ủ so với CT phối trộn 37 Ẩm độ bắt đầu giảm từ 15 ngày sau ủ, ẩm độ trì khoảng từ 72 – 75%, tương tự kết Trần Ngọc Hữu cs (2014) với ẩm độ sau tuần ủ rơm có chủng nấm Trichoderma dao động khoảng từ 64% đến 75% Ẩm độ đạt tương đương với nghiên cứu Võ Phú Đức (2013), ủ bùn thải cá với tro qui mô cho ẩm độ sau 49 ngày ủ đạt 60% Kết nghiên cứu tương tự kết ủ phân hữu từ bùn thải cá mạc cưa tỉ lệ 3:7 Lê Thị Kim Oanh Trần Thị Mỹ Diệu (2016), ẩm độ sau 32 ngày ủ 60% Nhìn chung, ẩm độ kết nghiên cứu vượt so với tiêu chuẩn Nghị định 108/2017/NĐ-CP Do đó, sau trình ủ kết thúc, phân HCVS thu cần để khô phơi nắng sấy nhẹ muốn sử dụng dạng phân bón HCVS thương phẩm Bảng 3.6 Ảnh hưởng chất đến độ sụt giảm thể tích khối ủ (%) Thời gian (ngày) CT1 CT2 CT3 CT4 100% 100% 100% 100% 96,7% 79,2% 85,5% 79,5% 10 93,2% 76,3% 80,0% 76,7% 15 87,3% 72,6% 75,1% 74,2% 20 86,3% 63,2% 73,7% 73,7% Ở 20 ngày ủ, CT sụt giảm thể tích cách rõ rệt, chứng tỏ hệ VSV hoạt động mạnh CT ủ có bổ sung chế phẩm có độ sụt giảm thể tích lớn nhanh, CT đối chứng độ sụt giảm chậm so với mẫu Ở ngày đầu, VSV thích nghi nên độ sụt giảm thể tích thấp, CT1 đạt 96,7%, CT2 có độ sụt giảm thể tích cao 79,2% CT3, CT4 có độ sụt giảm thể tích 85,5% 79,5% Sau 20 ngày ủ, độ sụt giảm thể tích tiếp tục giảm tương tự kết ủ phân hữu từ bùn thải cá mạc cưa, rơm Lê Thị Kim Oanh Trần Thị Mỹ Diệu (2016) với độ sụt giảm thể tích sau ủ hoai 36 - 46% hỗn hợp bùn mạc cưa chiếm 34 - 49% thể tích hỗn hợp bùn rơm Qua đó, cho thấy CT2 cho hiệu xử lý tốt CT1 cho hiệu thấp Yếu tố cảm quan Bùn từ trạm xử lý nước thải chế biến tôm lấy từ nhà máy có màu đen bùn mùi hôi, tanh, hôi thối bùn thải có chứa lượng lớn chất hữu tích tụ, cộng 38 với lượng bùn có bể gây tình trạng phân hủy kị khí, vi sinh vật yếm khí hoạt động sản sinh khí H2S, CH4 gây mùi thối khó chịu Sau phối trộn giảm bớt phần mùi thối Trong ngày đầu, CT2, CT3, CT4 xuất giòi, nhiệt độ tăng lên cao 10 ngày sau ủ tất CT xuất mốc trắng Lúc này, mùi giảm bớt gần khơng cịn thối sau ủ công thức Khi nhiệt độ bắt đầu giảm vào ngày thứ 15 sau ủ bắt đầu xuất đốm màu trắng Bacillus amyloliquefaciens DV20208 CT ủ đồng thời khơng cịn xuất mốc trắng Các CT ủ có màu nâu mùi đất Điều khác biệt rõ ràng với CT1 (đối chứng) cịn mùi thối, màu đen bùn thải Bảng 3.7 Mật độ VSV tổng số VSV gây bệnh sau q trình ủ (20 ngày) Cơng thức ủ CT1 CT2 CT3 CT4 Mật độ VSV tổng số (CFU/g) 7,67 x 105 5,2 x 106 3,6 x 105 4,09 x 105 Mật độ Salmonella 25 gram mẫu (CFU) 3,1 KPH KPH KPH 5,98 x 105 2,47 1,1 x 102 0,78 x 103 E.coli (CFU) Mật độ VSV tổng số sau 20 ngày sau ủ CT2 5,2 x 106 (CFU/g), CT3 3,6 x 105 (CFU/g), CT4 4, 09 x 105 (CFU/g) Mật độ có gia tăng ngày tiếp theo, CT1 có mật độ 7,67 x 106 (CFU/g) cao cơng thức ủ có bổ sung B amyloliquefaciens DV20208 nhiệt độ CT ủ chưa cao (10 CFU/g Vì theo quy định thể Nghị định 108/2017 phân HCVS dạng phân bón hữu có lồi vi sinh vật có ích Qua kết bảng 3.7 cho thấy, khơng có xuất Salmonella mật độ E.coli (ở ngưỡng cho phép 1,1 x 103 CFU/g) sau ủ trình ủ nhiệt độ tăng cao 10 ngày sau ủ, nhiệt độ trì 10 ngày Kết E.coli ngưỡng cho phép công thức có bổ sung chế phẩm đạt thấp nghiên cứu sản xuất phân hữu từ bùn thải bia với trộn với than bùn, mùn cưa cỏ khô Kalatzi et al (2016) sau 60 ngày ủ E.coli từ 68-1292 CFU/g chất khô Kết nghiên cứu đạt thấp nghiên cứu Nartey et al (2017) nghiên cứu ủ phân hữu từ bùn thải rắn hữu với phế phẩm nông nghiệp với mật số E.coli đạt 0,2 CFU/g chất khô Tuy nhiên, với kết mật số vi khuẩn gây bệnh E.coli Salmonella ngưỡng quy định cho phép chất lượng phân HCVS sau ủ theo tiêu chuẩn 10TCN 526:2002, TCVN 7185/2002/BNNPTNT Nghị định 108/2017/NĐ-CP Vì vậy, 39 vi khuẩn B amyloliquefaciens DV20208 có tiềm ứng dụng để xử lý bùn thải nhà máy sản xuất tơm Hình 3.17 Các cơng thức ủ sau 20 ngày Từ kết cho thấy, B amyloliquefaciens DV20208 có tiềm ứng dụng để xử lý bùn thải nhà máy sản xuất tơm Điều giải thích rằng, bnn thải nhà máy chế biến tôm môi trường đặc hiệu cho B amyloliquefaciens DV20208 sinh trưởng, nên sử dụng chủng VK để xử lý bùn thải, vi sinh vật phát triển nhanh công thức ủ, giúp phân huỷ nhanh chất hữu bùn thải Sau 20 ngày ủ, CT2, CT3, CT4 xử lý VK B amyloliquefaciens DV20208 khơng có hmm lượng Salmonella 25g mẫu Từ kết cho thấy, phối trộn theo CT2 cho kết tối ưu cơng thức ủ cịn lại 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Phân lập định danh vi khuẩn B amyloliquefaciens DV20208 từ bùn thải nhà máy chế biến tơm B amyloliquefaciens DV20208 có màu trắng sữa, xù xì, khơ ráp, trịn, bề mặt nhăn khơ, tâm lồi sần sùi, bắt màu tím với thuốc nhuộm Gram, có khả di động, phản ứng dương tính với catalase sinh tổng hợp oxidase VK B amyloliquefaciens DV20208 có trình tự vùng gen 16s rRNA tương đồng 99,42% với với loài Bacillus amyloliquefaciens DSM7 1.2 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng B amyloliquefaciens DV20208 pH = 7, nhiệt độ từ 30 - 35oC , thu sinh khối sau 18 nuôi cấy Với điều kiện nuôi cấy trên, B amyloliquefaciens DV20208 có khả sinh enzyme ngoại bào cao (amylase, chitinase, cellulase, protease) có khả đối kháng với chủng VSV gây bệnh (E coli, Salmonella, B.cereus) có bùn thải nhà máy chế biến tôm 1.3 Thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm cho thấy, B amyloliquefaciens DV20208 giúp cải thiện rõ rệt mùi màu sắc bùn thải sau 20 ngày Bùn thải sau xử lý có mật độ E coli Salmonella phù hợp với tiêu chuẩn 10TCN 526:2002, TCVN 7185/2002/BNNPTNT Nghị định 108/2017/NĐ-CP Kiến nghị Do thời gian thực đề tài hạn chế ảnh hưởng dịch Covid-19, nên nhóm xin đề xuất số hướng nghiên cứu sau: Tiếp tục đánh giá tất tiêu chí chất lượng bùn thải nhà máy sản xuất tơm vịng 30 ngày ủ Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất sử dụng chế phẩm vi sinh từ chủng B amyloliquefaciens DV20208 Đánh giá hiệu ứng dụng bùn thải nhà máy sản xuất tôm sau xử lý loại trồng khác 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Algburi, A., Volski, A., Cugini, C., Walsh, E.M., Chistyakov, V.A., Mazanko, M.S., Bren, A.B., Dicks, L.M., Chikindas, M.L (2016) Safety properties and probiotic potential of Bacillus subtilis KATMIRA1933 and Bacillus amyloliquefaciens B-1895 Advances in Microbiology 6(6), 432–452 Alpas, H., Bozoglu, F (2000) The combined effect of high hydrostatic pressure, heat and bacteriocins on inactivation of foodborne pathogens in milk and orange juice World Journal of Microbiology and Biotechnology 16(4), 387–392 Arguelles-Arias, A., Ongena, M., Halimi, B., Lara, Y., Brans, A., Joris, B., Fickers, P (2009) Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens Microb Cell Factories 8, 1–12 Barredo, J.L (2005) Microbial enzymes and biotransformations Humana Press Inc 151180 Benitez, L.B., Velho, R.V., da Motta, A de S., Segalin, J., Brandelli, A (2012) Antimicrobial factor from Bacillus amyloliquefaciens inhibits Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood Arch Microbiol 194(3), 177–185 Biradar, V., Ashwini, S., Lachuriye, P., Fatima, S., Syed, A (2016) Isolation of Soil Bacteria for Potential Production of Antibiotics and their Inhibitory Effect on Growth of Pathogens Int J Curr Microbiol App Sci 5(8), 514–524 Borriss, R., Chen, X.-H., Rueckert, C., Blom, J., Becker, A., Baumgarth, B., Fan, B., Pukall, R., Schumann, P., Spröer, C (2011) Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens subsp nov and Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum subsp nov based on complete genome sequence comparisons International journal of systematic and evolutionary microbiology 61(8): 1786–1801 Bose, K., Das, D (1996) Thermostable alpha-amylase production using Bacillus licheniformis NRRL B14368 Indian J Exp Biol 34, 1279-1282 Buchanan, J.R Gibbons, N.E (1974) Bergey’s manual of determinative bacteriology The Williams and Wilkins Company Bùi Văn Lệ, Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Vũ Hồng Liên (1999) Giáo trình Thực tập sinh hố ngành cơng nghệ sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP.HCM, 67tr 42 Richard R.B., Muray P.D (2009) Methods in enzymology, guide to protein purification London NW1 7BY, UK Cao, H., He, S., Wei, R., Diong, M., Lu, L (2011) Bacillus amyloliquefaciens G1: a potential antagonistic bacterium against eel-pathogenic Aeromonas hydrophila Evid Based Complement Altern Med 87, 32-43 Das, B.K., Neha Nidhi, R., Roy, P., Muduli, A., Swain, P., Mishra, S., Jayasankar, P (2014) Antagonistic activity of cellular components of Bacillus subtilis AN11 against bacterial pathogens International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 3(5), 795–809 Đỗ Thị Xuân, Nguyễn Thị Phương, Nguyễn Mỹ Hoa, Trần Nam Kha (2017) Hiệu bùn thải bia bùn cá xử lý phơi nắng sinh trưởng suất rau trồng nhà lưới Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô 2, 81-96 Environmental Protection Agency (1998) An Analysis of Composting as an Environmental Remedintion Technology US EPA Erginkaya, Z., Unal, E., Kalkan, S (2011) Importance of microbial antagonisms about food attribution Sci Microb Pathog Commun Curr Res Technol Adv 3rd Ed Formatex Res Cent Spain 2, 1342–1348 Fan, B., Borriss, R., Bleiss, W., Wu, X (2012) Gram-positive rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 colonizes three types of plants in different patterns J Microbiol 50, 38–44 Fu, S., Sun, J., Qian, L., Li, Z., 2008 Bacillus phytases: present scenario and future perspectives Appl Biochem Biotechnol 151(12), 1–8 Gupta, N., Kumar, A., Laksh, S.A., Rana, M (2017) Process optimization of extracellular chitinase production from Bacillus sp Isolated from fish waste Dumping site European journal of pharmaceutical and medical research 4(9), 474–480 Huỳnh Công Khánh, Trần Sỹ Nam, Nguyễn Thị Ngọc Thuỷ (2017) Nghiên cứu sử dụng bùn thải nhà máy chế biến thủy sản ủ phân compost kết hợp với rơm lục bình Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 3(112), 10-14 Huỳnh Đức Long, Đỗ Văn Mạnh, Lê Xuân Thanh Thảo (2017) Ứng dụng chế phẩm vi sinh vật chịu mặn để xử lý ô nhiễm đáy Âu thuyền Thọ Quang, Đà Nẵng Tạp Chí Phân Tích Hóa Lý Và Sinh Học - Tập 22 Số Đặc Biệt 2017 Idriss, E.E., Makarewicz, O., Farouk, A., Rosner, K., Greiner, R., Bochow, H., Richter, T., Borriss, R (2002) Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens 43 FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect Microbiology 148(3), 2097– 2109 Ji, S.H., Paul, N.C., Deng, J.X., Kim, Y.S., Yun, B.-S., Yu, S.H (2013) Biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 against fungal plant diseases Mycobiology 41(4), 234–242 Joster, J., Woodruff, H (2010) Antibiotic substances produced by bacteria Annals of the New York Academy of Sciences 1213(1), 125–136 Kadaikunnan, S., Rejiniemon, T.S., Khaled, J.M., Alharbi, N.S., Mothana, R (2015) Invitro antibacterial, antifungal, antioxidant and functional properties of Bacillus amyloliquefaciens Research Journal of Microbiology 10(9), 393–402 Lê Hoàng Việt, Nguyễn Võ Châu Ngân, Nguyễn Văn Phủ (2015) Hiệu xử lý nước thải chế biến thuỷ sản bể lọc sinh học hiếu khí ngập nước Tạp Chí Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ 94–101 Lê Thị Kim Oanh, 2004 Nghiên cứu phân hủy hiếu khí sản xuất compost từ chất thải rắn sinh hoạt hữu thành phố Hồ Chí Minh Sở Khoa học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Kim Oanh Trần Thị Mỹ Diệu, (2016) Nghiên cứu sản xuất compost nhằm tái sử dụng bùn thải từ nhà máy xử lý nước thải chế biến cá da trơn Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ, 18(2M): 99-114 Lê Thị Loan (2002) Một số đặc tính sinh hố, miễn dịch sinh học phân tử chủng Bacillus Du NT sản xuất sinh phẩm, Viện Vacxin sở Đà Lạt Lee, H.-J., Kim, H.-Y (2011) Lantibiotics, class I bacteriocins from the genus Bacillus J Microbiol Biotechnol 21, 229–235 McSpadden Gardener, B.B., 2004 Ecology of Bacillus and Paenibacillus spp in Agricultural systems Phytopathology 94(11), 1252–1258 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Linh Thước (2010) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục Phạm Thu Hương, Lê Thị Thuỷ, Đinh Nho Thái, Nguyễn Thị Hồng Loan (2017) Nghiên cứu tinh xác đinh số tính chất catalase từ Bacillus subtilis PY79 Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 33(1S), 268-276 44 Priest, F.G., Goodfellow, M., Shute, L.A., Berkeley, R.C.W (1987) Bacillus amyloliquefaciens sp nov nom rev Int J Syst Bacteriol 37(18), 69–71 Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K (2009) Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59, 550-554 Sansinenea, E., Ortiz, A (2011) Secondary metabolites of soil Bacillus spp Biotechnol Lett 33, 1523–1538 Sapre, M.P., Jha, H., Patil, M.B (2005) Purification and characterization of a thermoalkalophilic xylanase from Bacillus sp World Journal of Microbiology & Biotechnology 21, 649–654 Saxelin, M (2008) Probiotic formulations and applications, the current probiotics market, and changes in the marketplace: a European perspective Clinical Infectious Diseases 46, S76–S79 Sorokulova, I.B., Pinchuk, I.V., Denayrolles, M., Osipova, I.G., Huang, J.M., Cutting, S.M., Urdaci, M.C (2008) The safety of two Bacillus probiotic strains for human use Digestive diseases and sciences 53(4), 954–963 Sutyak, K.E., Wirawan, R.E., Aroutcheva, A.A., Chikindas, M.L (2008) Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptide subtilosin from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens J Appl Microbiol 104, 1067–1074 Teather, R.M., Wood, P.J (1982) Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen Applied, Environment Microbiology 43, 777–780 Trịnh Thành Trung, Nguyễn Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Mạnh Hùng, Đào Thị Lương, Dương Văn Hợp (2011) So sánh đa dạng vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử vườn Quốc gia Hoàng Liên vùng đất canh tác nông nghiệp lân cận Hội Nghị Khoa Học Toàn Quốc Về Sinh Thái Và Tài Nguyên Vi Sinh Vật 996–1003 Yao, A.V., Bochow, H., Karimov, S., Boturov, U., Sanginboy, S., Sharipov, A.K (2006) Effect of FZB 24® Bacillus subtilis as a biofertilizer on cotton yields in field tests Arch Phytopathol Plant Prot 39, 323–328 45 46 ... sinh khối B amyloliquefaciens DV20208 để thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm 3.4.2 Thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm Bùn thải nhà máy chế biến tôm xử lý sơ có kích... nên chủng vi khuẩn có tiềm xử lý nguồn bùn thải nhà máy chế biến tơm có khả kiểm sốt mầm bệnh bùn thải 3.4 Thử nghiệm ứng dụng B amyloliquefaciens DV20208 xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm 3.4.1... GIANG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens TRONG THỬ NGHIỆM XỬ LÝ BÙN THẢI CỦA NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TÔM Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 7420201 KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng vi? ?n