4. Nội dung nghiên cứu
3.3. Khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208
3.3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208
Bacillus amyloliquefaciens DV20208 nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, pH = 7,
với tỉ lệ tiếp giống B. amyloliquefaciens DV20208 là 5%, ở nhiệt độ 35oC Tiến hành nuôi cấy lắc với chế độ 150 vòng/phút, trong vòng 24 giờ. Ly tâm dung dịch sau khi nuôi cấy ở chế độ 8000 vòng/phút, trong 10 phút và tiến hành xác định hoạt tính enzyme amylase, protease, cellulase và chitinase bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả
8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Mật độ tế bào(LogCFU/m l)
nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của B. amyloliquefaciens DV20208 được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.16.
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải enzyme của B. amyloliquefaciens DV20208
Đường kính vòng phân giải (cm)
Chitinase Protease Cellulase Amylase 1,8 ± 0,08 3,19 ± 0,14 1,24 ± 0,12 2,88 ± 0,08
Hình 3.15. Khả năng sinh enzyme của B. amyloliquefaciens DV20208
(A: Chitinase; B: Protease; C: Cellulase; D: Amylase)
Từ kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.15 cho thấy chủng B. amyloliquefaciens DV20208 có khả năng phân giải chitin, cellulose, protein, tinh bột. Như vậy, B. amyloliquefaciens
DV20208 có khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào tương ứng: chitinase, protease, cellulae, amylase.Trong đó, khả năng sinh enzyme protease là cao nhất, đường kính vòng phân giải đạt 3,19 ± 0,14 cm. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó của (Trịnh Thành Trung et al., 2013) về khả năng sinh enzyme ngoại bào từ B. amyloliquefaciens phân lập tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên.
3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của B. amyloliquefaciens DV20208 với các chủng vi sinh vật gây hại
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của B. amyloliquefaciens DV20208 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.16.
Hình 3.16. Khả năng đối kháng của B. amyloliquefaciens với các chủng gây bệnh
(A: E.coli; B: Ralstonia; C: B.cereus)
B. amyloliquefaciens DV20208 có khả năng đối kháng với E.coli, Ralstonia và B.cereus (Hình 3.16) với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 1,3 ± 0,2 cm; 1,08 ±
0,4 cm; 1,42 ± 0,2 cm. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cs (2012) về khả năng tạo biofilm và khả năng đối kháng với E.coli của B.subtilis UI.3 và khả năng đối kháng với mạnh với Samonella và Ralstonia của Bacillus velezensis U3.7 (Nguyễn Quang Huy and Trần Thúy Hằng, 2012). Hay công trình nghiên cứu về chủng Bacillus subtilis RB14 có khả năng kháng Rhizoctonia solani gây bệnh cây cà chua, tuy nhiên, với các chủng
vi khuẩn gây hại khác hiện chưa có nhiều kết quả nghiên cứu tương tự (Asaka and Shoda, 1996).
Bacillus amyloliquefaciens DV20208 có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao như
protease, chitinase, amylase, cellulase và có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh như:
E.coli, Ralstonia, B.cereus nên chủng vi khuẩn này có tiềm năng xử lý nguồn bùn thải của
nhà máy chế biến tôm và có khả năng kiểm soát mầm bệnh trong bùn thải.
3.4. Thử nghiệm ứng dụng B. amyloliquefaciens DV20208 xử lý bùn thải nhà máy chế
biến tôm
3.4.1. Nhân nhanh sinh khối chủng B. amyloliquefaciens DV20208
Dựa vào các kết quả nghiên cứu trong phần 2.2.6, tiến hành nuôi cấy lắc B. amyloliquefaciens DV20208 trong môi trường LB, pH = 7, ở nhiệt độ 35oC, tỉ lệ tiếp giống 5%. Sau 18 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt 12,09 LogCFU/ml. Tiến hành thu sinh khối B.
amyloliquefaciens DV20208 để thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm.
3.4.2. Thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm
Bùn thải của nhà máy chế biến tôm được xử lý sơ bộ sẽ có kích thước hạt từ 3 - 4cm, độ ẩm của bùn thải đạt 30 - 40%, pH = 7,14; nhiệt độ ban đầu của bùn thải bằng với nhiệt độ của môi trường. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy chất hữu cơ do vi sinh vật, trong đó tỉ lệ C/N là thông số dinh dưỡng quan trọng nhất. C/N là thông số quan trọng nhất về các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật. Cacbon trong các chất thải hữu cơ được vi sinh vật đồng hóa để tạo nên tế bào mới chiếm khoảng 20 - 40%, phần còn lại được biến đổi thành CO2 và quá trình sinh năng lượng. Các tế bào vi khuẩn chứa 50%C và 5%N, do đó lượng đạm cần thiết trong khối ủ phải chiếm từ 2 - 4%. Quá nhiều cacbon sẽ làm chậm quá trình phân hủy, còn lượng đạm cao sẽ gây mùi hôi thối (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998). Tỉ lệ C/N tối ưu cho quá trình ủ phân khoảng 25/1-30/1. Ở mức tỷ lệ thấp hơn, nitơ sẽ thừa và sinh ra NH3, gây mùi khai. Ở mức tỉ lệ cao hơn, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật do thiếu N. Chúng phải trải qua nhiều chu kỳ chuyển hóa, oxy hóa các
cacbon dư cho đến khi đạt tỉ lệ C/N thích hợp. Do đó, thời gian cần thiết cho quá trình phân hủy bị kéo dài hơn và sản phẩm thu được chứa ít mùn hơn.
Thử nghiệm ứng dụng B. amyloliquefaciens DV20208 để xử lý bùn thải của nhà máy chế biến tôm theo 4 công thức, được thể hiện trong bảng 2.1. Sau khi nguyên liệu đã được xử lý sơ bộ tiến hành ủ và theo dõi quá trình ủ về nhiệt độ, độ ẩm và độ sụt giảm thể tích.
Theo dõi 4 công thức ủ, và thu thập số liệu theo chu kì 5 ngày. Số liệu mỗi lần đo được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, độ sụt giảm thể tích, mật độ VSV được thể hiện lần lượt ở bảng 3.4, bảng 3.5,bảng 3.6. bảng 3.7
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của cơ chất đến nhiệt độ trong quá trình ủ
Thời gian (ngày) CT1 CT2 CT3 CT4
0 26oC 27oC 27oC 27,5oC
5 37oC 42,5oC 40oC 40,5oC
10 39oC 48,5oC 46,5oC 46,5oC
15 37oC 47oC 43,5oC 46,5oC
20 37oC 45oC 43oC 43oC
Qua bảng thống kê số liệu về sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình ủ cho thấy:
Ở 5 ngày sau ủ, ở 3 CT phối trộn có bổ sung chế phẩm B. amyloliquefaciens DV20208 nhiệt độ tăng mạnh so với công thức đối chứng (CT1). Nguyên nhân là do sự phát nhiệt và sự lưu giữ nhiệt của chính các CT ủ. Nhiệt độ tăng cao chứng tỏ các vi sinh vật trong đống ủ hoạt động mạnh thúc đẩy quá trình phân hủy các chất hữu cơ. Sự phát nhiệt do sự oxy hoá của các hợp chất hữu cơ và khi hoá năng chuyển thành nhiệt năng trong hoạt động trao đổi chất và phân huỷ hữu cơ của vi sinh vật.
Giai đoạn từ 5-10 ngày, các công thức CT2, CT3, CT4 có nhiệt độ ủ cao hơn 45°C. Kết quả này tương tự như nghiên cứu của Lý Thị Phương Hồng (2012) với nguyên liệu là bùn từ các trạm xử lý nước thải sinh hoạt. Tuy nhiên, thời gian đạt ngưỡng nhiệt độ cao nhất theo nghiên cứu của Lý Thị Phương Hồng (2012) là chỉ sau 5 ngày sau ủ, trong khi đối với nghiên cứu này là 10 ngày.
Vào ngày 10 sau khi ủ, CT3 Nhiệt độ đạt ngưỡng tối đa ở 46,5°C và ở CT2 và CT4 lần lượt là 48,5°C và 46,5°C nguyên nhân là do vật liệu phối trộn là gỗ keo lá tràm sau khi trồng nấm có độ rỗng cao hơn mùn cưa sau khi trồng nấm nên khả năng khuếch tán khí tốt nhưng khả năng giữ nhiệt kém.
Ở 2 công thức (CT2, CT4) có bổ sung chế phẩm B.amyloliquefaciens DV20208, đều giữ nhiệt trên 45oC cho tới ngày thứ 15. Đây là sự khác biệt rõ ràng với công thức đối chứng (nhiệt độ đống ủ luôn thấp hơn 40°C). Tuy nhiên, ở ngưỡng nhiệt độ này thấp hơn khi ủ compost bằng thành phần chất hữu cơ trong chất thải rắn sinh hoạt (CTRSH) (~70°C, Nhà máy Compost Vietstar, 2014) và cũng thấp hơn khi ủ bùn thải từ các trạm xử lý nước thải sinh hoạt (~61°C, Lý Thị Phương Hồng 2012), nhưng cao hơn so với ủ bằng bùn từ ao nuôi tôm (~31°C, Trần Thị Thùy Dương 2012).
Nhiệt độ tăng vi sinh vật sẽ chuyển hóa các chất hữu cơ phức tạp thành đơn giản góp phần giúp cho đống ủ nhanh hoai mục hơn. Feachem et al. (1983), nhiệt độ đống ủ trên 45°C có khả năng tiêu diệt mầm mống một số loại bệnh hại (E. coli, Salmonella) có trong bùn thải nhà máy chế biến tôm.
Ngày thứ 15 đến ngày 20 , nhiệt độ tại các CT ủ đều giảm dần do các chất hữu cơ đã được phân hủy gần hết, vậy nên các vi sinh vật phát triển chậm lại, quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ ít hơn. Ngoài ra một phần là do sự thất thoát nhiệt trong quá trình ủ, nên lượng nhiệt sinh ra ngày càng ít.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của cơ chất đến độ ẩm trong quá trình ủ
Thời gian (ngày) CT1 CT2 CT3 CT4
0 82,5 72,8 73,7 74,2
5 79,8 69,2 71,5,3 70,9
10 76,1 67,5 69,2 69,3
15 73,2 63,1 66,1 67,3
20 71,3 63 65 64,6
Trong quá trình ủ, độ ẩm là một trong những yếu tố quan trọng trong việc tạo môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển nên yếu tố độ ẩm được kiểm tra thường xuyên và duy trì trong khoảng tối ưu. Độ ẩm đầu vào trung bình của 4 công thức là 74,05% với ẩm độ này thì quá trình ủ ban đầu chưa hiệu quả vì theo Bertoldi et al. (1983), nếu vật liệu hữu cơ có sự phối trộn với bùn thải, thì ẩm độ yêu cầu là đạt khoảng 65 - 67%, khi đó quá trình ủ đạt hiệu quả và ẩm độ này cũng được cho là thích hợp cho vi khuẩn hiếu khí hoạt động (Lê Hoàng Việt và Nguyễn Hữu Chiếm, 2013; Rudat et al., 1999).Ở 3 công thức (CT2, CT3, CT4) nhiệt độ tăng cao hơn cho nên hơi nước sẽ được tách ra khỏi khối ủ nhanh hơn qua con đường bốc hơi nước do đó độ ẩm của 3 công thức ủ này giảm nhiều hơn so với CT1 100% bùn thải nên độ kết dính cao, độ xốp thấp nên khả năng thông khí và thoát hơi nước trong khối ủ kém hơn so với các CT phối trộn.
Ẩm độ bắt đầu giảm từ 15 ngày sau ủ, ẩm độ duy trì trong khoảng từ 72 – 75%, tương tự kết quả của Trần Ngọc Hữu và cs. (2014) với ẩm độ sau 7 tuần ủ rơm có chủng nấm Trichoderma dao động trong khoảng từ 64% đến 75%. Ẩm độ đạt tương đương với nghiên cứu của Võ Phú Đức (2013), ủ bùn thải cá với tro qui mô 2 tấn cũng cho ẩm độ sau 49 ngày ủ đạt 60%. Kết quả nghiên cứu cũng tương tự kết quả ủ phân hữu cơ từ bùn thải cá và mạc cưa tỉ lệ 3:7 của Lê Thị Kim Oanh và Trần Thị Mỹ Diệu (2016), ẩm độ sau 32 ngày ủ là 60%. Nhìn chung, ẩm độ của các kết quả nghiên cứu đều vượt so với tiêu chuẩn của Nghị định 108/2017/NĐ-CP. Do đó, sau khi quá trình ủ kết thúc, phân HCVS thu được cần để khô hoặc phơi nắng hoặc được sấy nhẹ nếu muốn sử dụng dưới dạng phân bón HCVS thương phẩm.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của cơ chất đến độ sụt giảm thể tích khối ủ (%)
Thời gian (ngày) CT1 CT2 CT3 CT4
0 100% 100% 100% 100%
5 96,7% 79,2% 85,5% 79,5%
10 93,2% 76,3% 80,0% 76,7%
15 87,3% 72,6% 75,1% 74,2%
20 86,3% 63,2% 73,7% 73,7%
Ở 20 ngày ủ, ở các CT đều sụt giảm thể tích một cách rõ rệt, chứng tỏ hệ VSV hoạt động mạnh. CT ủ có bổ sung chế phẩm có độ sụt giảm thể tích lớn và nhanh, CT đối chứng độ sụt giảm chậm hơn so với 3 mẫu trên.
Ở 5 ngày đầu, VSV mới thích nghi nên độ sụt giảm thể tích thấp, CT1 đạt 96,7%, CT2 có độ sụt giảm thể tích cao nhất là 79,2% và ở CT3, CT4 có độ sụt giảm thể tích lần lượt là 85,5% và 79,5%.
Sau 20 ngày ủ, độ sụt giảm thể tích vẫn tiếp tục giảm tương tự kết quả ủ phân hữu cơ từ bùn thải cá và mạc cưa, rơm của Lê Thị Kim Oanh và Trần Thị Mỹ Diệu (2016) với độ sụt giảm thể tích sau khi ủ hoai là 36 - 46% hỗn hợp bùn và mạc cưa và chiếm 34 - 49% thể tích hỗn hợp bùn và rơm.
Qua đó, cho thấy ở CT2 cho hiệu quả xử lý tốt nhất và CT1 cho hiệu quả thấp nhất.
Yếu tố cảm quan
Bùn từ trạm xử lý nước thải chế biến tôm khi lấy từ nhà máy đã có màu đen của bùn và mùi hôi, tanh, hôi thối do trong bùn thải có chứa một lượng lớn chất hữu cơ tích tụ, cộng
với lượng bùn có trong bể gây tình trạng phân hủy kị khí, vi sinh vật yếm khí hoạt động sản sinh khí H2S, CH4 gây mùi hôi thối khó chịu.
Sau khi phối trộn thì giảm bớt phần nào mùi thối. Trong 5 ngày đầu, ở CT2, CT3, CT4 xuất hiện giòi, khi nhiệt độ tăng lên cao. 10 ngày sau ủ tất cả các CT đều xuất hiện mốc trắng. Lúc này, mùi cũng giảm bớt và gần như không còn hôi thối sau khi ủ ở các công thức trên. Khi nhiệt độ bắt đầu giảm vào ngày thứ 15 sau ủ thì bắt đầu xuất hiện các đốm màu trắng của Bacillus amyloliquefaciens DV20208 ở các CT ủ đồng thời không còn xuất hiện mốc trắng. Các CT ủ có màu nâu và mùi đất. Điều này khác biệt rõ ràng với CT1 (đối chứng) vẫn còn mùi hôi thối, màu đen của bùn thải.
Bảng 3.7. Mật độ VSV tổng số và VSV gây bệnh sau quá trình ủ (20 ngày)
Công thức ủ CT1 CT2 CT3 CT4
Mật độ VSV tổng số (CFU/g) 7,67 x 105 5,2 x 106 3,6 x 105 4,09 x 105 Mật độ Salmonella trong 25 gram
mẫu (CFU) 3,1 KPH KPH KPH
E.coli (CFU) 5,98 x 105 2,47 1,1 x 102 0,78 x 103
Mật độ VSV tổng số sau 20 ngày sau ủ ở CT2 là 5,2 x 106 (CFU/g), CT3 là 3,6 x 105 (CFU/g), CT4 là 4, 09 x 105 (CFU/g). Mật độ này có sự gia tăng ở các ngày tiếp theo, đối với CT1 có mật độ là 7,67 x 106 (CFU/g) cao hơn các công thức ủ có bổ sung B. amyloliquefaciens DV20208 vì nhiệt độ của CT ủ này chưa cao (<40°C) nên không thể
tiêu diệt được VSV gây hại, nên mật độ VSV tổng số ở đây bao gồm cả mật độ VSV hữu hiệu và VSV gây hại. Nhìn chung, mật độ VSV có sự gia tăng ở các CT ủ đều đạt chỉ tiêu về chất lượng phân HCVS với nguồn vi sinh là đạt ngưỡng là >106 CFU/g. Vì theo quy định được thể hiện trong Nghị định 108/2017 phân HCVS là dạng phân bón hữu cơ có ít nhất một loài vi sinh vật có ích. Qua kết quả bảng 3.7 cho thấy, không có sự xuất hiện của
Salmonella và mật độ E.coli (ở ngưỡng cho phép là 1,1 x 103 CFU/g) sau khi ủ do trong quá trình ủ nhiệt độ tăng cao ở 10 ngày sau ủ, và nhiệt độ được duy trì trong 10 ngày tiếp theo. Kết quả E.coli ở ngưỡng cho phép đối với các công thức có bổ sung chế phẩm và đạt thấp hơn nghiên cứu sản xuất phân hữu cơ từ bùn thải bia với trộn với than bùn, mùn cưa và cỏ khô của Kalatzi et al. (2016) sau 60 ngày ủ E.coli từ 68-1292 CFU/g chất khô. Kết quả nghiên cứu cũng đạt thấp hơn nghiên cứu của Nartey et al. (2017) khi nghiên cứu ủ phân hữu cơ từ bùn thải rắn hữu cơ với phế phẩm nông nghiệp với mật số E.coli đạt 0,2
CFU/g chất khô. Tuy nhiên, với kết quả về mật số vi khuẩn gây bệnh E.coli và Salmonella đều dưới ngưỡng quy định cho phép về chất lượng phân HCVS sau ủ theo tiêu chuẩn 10TCN 526:2002, TCVN 7185/2002/BNNPTNT và Nghị định 108/2017/NĐ-CP. Vì vậy,
vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 có tiềm năng trong ứng dụng để xử lý bùn thải nhà máy sản xuất tôm.
Hình 3.17. Các công thức ủ sau 20 ngày
Từ các kết quả trên cho thấy, B. amyloliquefaciens DV20208 có tiềm năng trong ứng dụng để xử lý bùn thải nhà máy sản xuất tôm. Điều này có thể được giải thích rằng, bnn thải của nhà máy chế biến tôm là môi trường đặc hiệu cho B. amyloliquefaciens DV20208 sinh trưởng, nên khi sử dụng chủng VK này để xử lý bùn thải, vi sinh vật phát triển nhanh trong các công thức ủ, giúp phân huỷ nhanh các chất hữu cơ trong bùn thải. Sau 20 ngày ủ, ở CT2, CT3, CT4 được xử lý bằng VK B. amyloliquefaciens DV20208 đều không có
hmm lượng Salmonella ở trong 25g mẫu. Từ các kết quả trên cho thấy, phối trộn theo CT2 cho kết quả tối ưu hơn các công thức ủ còn lại.