Phân lập và định danh vi khuẩn từ bùn thải của nhà máy chế biến tôm

4. Nội dung nghiên cứu

3.1. Phân lập và định danh vi khuẩn từ bùn thải của nhà máy chế biến tôm

3.1.1. Phân lập vi khuẩn từ bùn thải của nhà máy chế biến tôm

Từ bùn thải nhà máy chế biến tôm ủ thô từ 15 đến 20 ngày, tiến hành chọn vùng có màu trắng, dùng que cấy cấy ria trên môi trường LB có pH = 7, nuôi ở 35oC trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành tuyển chọn các chủng VSV dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc nuôi trong môi trường LB sau 24 giờ. Kết quả phân lập được thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc Bacillus trên môi trường LB

Qua hình 3.1 cho thấy, chủng vi khuẩn phân lập được có màu trắng sữa, xù xì, khô ráp, tròn, bề mặt nhăn khô, tâm lồi sần sùi. Tiến hành nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi có vật kính với độ phóng đại 100x, thu được kết quả thể hiện ở hình 3.2.

Hình 3.2. Hình thái tế bào của vi khuẩn sau khi nhuộm Gram (100x)

Kết quả cho thấy, các tế bào của chủng bắt màu tím của thuốc nhuộm, chứng tỏ vi khuẩn này thuộc Gram dương. Khuẩn lạc có hình que, kích thước khoảng 3,13µm. Các đặc điểm này phù hợp với mô tả của vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thống phân loại Bergey (Buchanan and Gibbons, 1974).

3.1.2. Xác định các phản ứng test sinh - hoá của vi khuẩn Bacillus sp.

Để có thêm cơ sở khoa học để khẳng định chủng vi sinh vật phân lập được từ bùn thải nhà máy chế biến tôm là vi khuẩn Bacillus sp. tiến hành xác định các phản ứng test

sinh - hóa, bao gồm: khả năng sinh tổng hợp catalase, khả năng di động và khả năng sinh tổng hợp oxidase.

Kết quả thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp catalase

Để tiến hành phản ứng catalase, dùng que thủy tinh lấy một ít khuẩn lạc thuần đặt lên một lam kính sạch. Nhỏ vài giọt hydrogene peroxide (H2O2) 3% lên sinh khối vi khuẩn trên lam kính quan sát kết quả. Kết quả thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm catalase

Kết quả từ hình 3.3 cho thấy khi nhỏ hydrogene peroxide (H2O2) 3% lên sinh khối của vi khuẩn cho hiện tượng sủi bọt khí (do khí O2 thoát ra). Vậy có thể kết luận, chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh enzyme catalase. Catalase là enzyme có mặt ở peroxisome trong hầu hết các tế bào hiếu khí và là một thành phần trung tâm của các quá trình khử độc, ngăn chặn nhanh sự hình thành H2O2 bằng cách xúc tác cho quá trình phân giải H2O2 thành H2O và O2 (Phạm Thu Hương et al., 2017).

Kết quả thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp oxidase

Nhỏ vài giọt thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% trên giấy lọc đã được khử trùng trên một lam kính sạch. Dùng que thủy tinh vô trùng lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn cọ lên vùng thuốc thử trên giấy lọc.

Kết quả thử nghiệm cho thấy, chủng vi khuẩn này cho kết quả dương tính (thuốc thử Tetramethyl-p- phenylenediamine dihydrochloride bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu tím thẫm.

Hình 3.4. Hoạt tính sinh tổng hợp oxidase của vi khuẩn Kết quả thử nghiệm khả năng di động

Cấy đâm sâu sinh khối chủng vi khuẩn vào môi trường thạch mềm, khoảng 2/3 ống thạch. Nuôi cấy ở 35oC sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả. Kết quả được trình bày ở hình 3.5.

Hình 3.5. Khả năng di động của vi khuẩn

Kết quả thử nghiệm cho thấy, sau 24 giờ mẫu vi khuẩn phân lập được làm đục môi trường xung quanh, mọc lan ra khỏi đường cấy, cho thấy chúng có khả năng di động.

Qua kết quả thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn phân lập được này đều có các phản ứng dương tính liên quan đến xét nghiệm catalase, oxidase và thử nghiệm khả năng di động. Như vậy, dựa vào các kết quả thu được từ phân tích các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram kết hợp với xác định các phản ứng sinh - hóa và khóa phân loại của Bergey có thể khẳng định là chủng vi khuẩn phân lập được từ bùn thải nhà máy chế biến tôm này thuộc chi Bacillus sp. Để xác định chính xác loài của vi khuẩn này, tiến hành định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

DNA tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR trình tự 16S rRNA. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR chứa trình tự 16S rRNA được khuếch đại, kích thước 1500 bp (Hình 3.6).

Hình 3.6. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại gen 16SrRNA của vi khuẩn

(M: thang phân tử chuẩn, 1: sản phẩm PCR trình tự 16S rRNA)

Sau khi xác định sơ bộ vi sinh vật phân lập là vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Chủng vi khuẩn được gửi đi định danh tại Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Tiến hành phá mẫu thu DNA, giải trình tự gen vùng 16S rRNA. Tra cứu trên BLAST - NCBI, xây dựng cây phát sinh loài, kết quả được thể hiện ở hình 3.7 và hình 3.8.

Hình 3.7. Kết quả tra cứu trên BLAST NCBI

Chủng vi khuẩn phân lập được có trình tự vùng gene 16S rRNA tương đồng 99,42% với loài Bacillus amyloliquefaciens DSM7 = ATCC 23350, có thể kết luận rằng, chủng vi khuẩn phân lập từ bùn thải nhà máy chế biến tôm là loài Bacillus amyloliquefaciens. Đặt tên cho loài vi sinh vật này là: Bacillus amyloliquefaciens DV20208.

Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên mối quan hệ di truyền của các chủng

Theo nhiều nghiên cứu thì các chủng thuộc giống Bacillus như: Bacillus subtilis; Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis; Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus methylotrophycus; Bacillus megaterium,... đều là các chủng vi khuẩn không gây độc tố và

an toàn, thậm chí có thể sử dụng với vai trò là probiotic trong thực phẩm (Sorokulova et al., 2008; Algburi et al., 2016). Vậy chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208 đã tuyển chọn đáp ứng được yêu cầu an toàn và hoàn toàn có thể ứng dụng được trong xử lý môi trường.

3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn

Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường, mặt khác thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất. Do đó mà quá trình sinh trưởng phát triển và trao đổi chất của vi sinh vật có liên quan chặt chẽ với các điều kiện môi trường nuôi cấy. Có nhiều yếu tố khác nhau bao gồm các yếu tố về dinh dưỡng (nguồn cacbon, nguồn nitơ, khoáng…) và các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, nồng độ muối,…) tác động qua lại với nhau ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Tại giá trị tối thích của các yếu tố tác động, vi sinh vật sẽ phát triển tối ưu và lượng sinh khối thu được lớn nhất (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998).

Với mục đích tạo chế phẩm vi sinh vật từ chủng Bacillus amyloliquefaciens DV20208 để ứng dụng trong xử lý bùn thải của nhà máy chế biến tôm, tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của Bacillus amyloliquefaciens DV20208.

Chuẩn bị 5 bình môi trường LB lỏng, với pH = 7. Bacillus amyloliquefaciens

DV20208 được cho vào bình lắc theo các tỷ lệ: 1%; 3%; 5%; 7%; 9%. 5 bình được nuôi cấy lắc ở chế độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 35oC. Sau 24 giờ lên men, kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống được thể hiện trên hình 3.9.

Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống

Dựa vào hình 3.9 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy với tỷ lệ tiếp giống 5% cho mật độ tế bào cao nhất là 11,71 LogCFU/ml. Nếu tăng tỷ lệ giống lên trên 9% thì mật độ tế bào sau 24 giờ nuôi cấy giảm còn 11,32 LogCFU/ml. Nguyên nhân có thể do khi mật độ giống ban đầu quá cao thì các chất dinh dưỡng trong môi trường nhanh chóng bị cạn kiệt trước khi vi sinh vật đạt được tốc độ tăng sinh tối đa. Còn khi tỷ lệ tiếp giống thấp (1% và 3%) thì pha tiềm phát (pha Lag) kéo dài, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật do đó sau 24 giờ nuôi cấy mật độ vi khuẩn chỉ đạt 11,11 LogCFU/ml và 11,23 LogCFU/ml.

Vì vậy, để vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong vòng 24 giờ lựa chọn tỷ lệ cấp giống là 5%. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của Argue - Arias và cs. (2009).

3.2.2. Ảnh hưởng của pH

Bacillus amyloliquefaciens DV20208 được nuôi cấy lắc trong môi trường LB ở chế

độ 150 vòng/phút với nhiệt độ 35oC có giá trị pH thay đổi từ 2 đến 9, tỷ lệ tiếp giống 5%. Sau 24 giờ lên men, kết quả thể hiện trên hình 3.10 và 3.11

11.11 11.23 11.71 11.67 11.32 10.60 10.80 11.00 11.20 11.40 11.60 11.80 1 3 5 7 9 Mật độ tế bào (LogCFU/m l) Tỷ lệ cấp giống (%)

Hình 3.10. Sinh khối B. amyloliquefaciens DV20208 ở giá trị pH từ 2-9 sau nuôi cấy

Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH

Kết quả cho thấy, B. amyloliquefaciens DV20208 có thể sinh trưởng và phát triển ở cả môi trường acid và bazơ. Ở ngưỡng giá trị pH: 5; 7; 8; 9 mật độ tế bào B. amyloliquefaciens DV20208 là 11,20; 11,47; 11,76; 11,68; 11,51 LogCFU/ml. Ở ngưỡng

pH từ 2 đến 4 có sự gia tăng mật độ tế bào, nhưng sự gia tăng này không cao, kết quả này thể hiện ở hình 3.10 sau 24 giờ nuôi cấy không thấy sự thay đổi rõ rệt ở màu môi trường.

B. amyloliquefaciens DV20208 có thể sinh trưởng trong tất cả các giá trị pH từ 2 đến 9, kết

quả nghiên cứu này phù hợp với công bố của Nguyễn Thế Truyền (2013).

Qua hình 3.11 cho thấy, ở pH = 7 vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 có mật độ tế bào lớn nhất, đạt 11,76 LogCFU/ml. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó về B. amyloliquefaciens cho rằng giá trị pH thích hợp nhất cho sự phát triển sinh khối của chúng là ở dải pH trung tính, đặc biệt ở pH = 7 (Tuan and Huong, 2014; Abd-Elhalem et al., 2015; Khusro and Aarti, 2015).

3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ

9.10 9.32 9.42 11.20 11.47 11.76 11.68 11.51 0.00 1.50 3.00 4.50 6.00 7.50 9.00 10.50 12.00 13.50 2 3 4 5 6 7 8 9 Mật độ tế bào (LogCFU/m l) pH

Sử dụng 5 bình dung tích 150ml, mỗi bình đều chứa 50ml dung dịch môi trường LB, pH = 7, với tỉ lệ tiếp giống B. amyloliquefaciens DV20208 là 5%. Tiến hành nuôi cấy lắc 5 bình với chế độ 150 vòng/phút, mỗi bình trong mỗi ngưỡng nhiệt độ: 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC trong vòng 24 giờ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.12.

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.12 cho thấy mật độ tế bào chủng B. amyloliquefaciens DV20208 đạt giá trị cao nhất là 12,05 LogCFU/ml ở 35oC (Hình 3.13). Ở nhiệt độ 30°C mật độ tế bào DV20208 đạt 11,98 LogCFU/ml. Ở nhiệt độ 30°C và 35°C cho thấy không có sự sai khác ở mức ý nghĩa (p<0,05) về giá trị LogCFU/ml. Điều này chứng tỏ chủng này thích hợp với môi trường ở nhiệt độ trong khoảng 30-35°C, kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lee A và cộng sự năm 2017 khi nghiên cứu probiotic trên B. amyloliquefaciens.

Ở nhiệt độ 25°C, chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 phát triển chậm và mật độ tế bào chỉ đạt 11,48 LogCFU/ml thấp hơn so với ở nhiệt độ 35°C.

Tiếp tục tăng nhiệt độ hơn nữa thì nhận thấy mật độ tế bào vi khuẩn giảm rõ rệt. Điều này chứng tỏ nhiệt độ 45°C kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi sinh vật. Ở ngưỡng nhiệt độ 45°C trở lên B. amyloliquefaciens DV20208 không thích hợp để phát

triển. Kết quả trên tương đồng với kết quả nghiên cứu của Das và cộng sự (2014).

3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl

11.48 11.98 12.05 11.69 10.74 9.60 9.90 10.20 10.50 10.80 11.10 11.40 11.70 12.00 12.30 25 30 35 40 45 Mật độ tế bào(LogCFU/m l) Nhiệt độ °C

Nuôi cấy lắc B. amyloliquefaciens DV20208 trong 5 bình môi trường LB lỏng, pH=7 với nồng độ muối NaCl thay đổi từ 1, 3, 5, 7, 9%. Nuôi cấy lắc với chế độ 150 vòng/phút ở 35oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, kết quả được thể hiện ở hình 3.13.

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl

Kết quả từ hình 3.13 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn DV20208 là loài ưa muối, chúng có khả năng chịu đựng và sống sót ở tất cả các nồng độ muối, có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nồng độ muối cao nhất là 9% với tỷ lệ mật độ vi khuẩn dao động không đáng kể. Mật độ tế bào vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 giảm dần khi nồng độ muối tăng dần. So với nồng độ muối 5%, 7%, 9% thì ở nồng độ muối 1% và 3% có mật độ tế bào vi khuẩn cao hơn. Ngoài ra, DV20208 phát triển tốt nhất ở nồng độ muối 3% trong môi trường nuôi với mật độ 12,06 LogCFU/ml điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây khi khảo sát khả năng chịu muối của B. amyloliquefaciens (Ngô Thị Thu Thảo et al., 2016; Das et al., 2014).

3.2.5. Xây dựng đường cong sinh trưởng

Đường cong sinh trưởng được xây dựng với mục đích nghiên cứu định tính VSV theo thời gian và xác định thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998) Tiến hành nuôi cấy lắc B. amyloliquefaciens DV20208 với chế độ 150 vòng/phút trên môi trường LB lỏng pH = 7, tỷ lệ cấp giống là 5% ở nhiệt độ 35°C trong thời gian 60h. Kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật: thông qua mối tương quan giữa giá trị OD và phương trình tương quan để tính mật độ tế bào. Từ đó, xây dựng được đường cong sinh trưởng của

B.amyloliquefaciens DV20208 (hình 3.15). 11.76 12.06 11.46 11.29 10.73 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 1 3 5 7 9 Mật độ tế bào (LogCFU/m l) Nồng độ muối NaCl (%)

Hình 3.14. Đường cong sinh trưởng của B. amyloliquefaciens DV20208

Kết quả xác định mật độ tế bào vi khuẩn ở các thời gian khác nhau được thể hiện ở hình 3.14 cho thấy: B. amyloliquefaciens DV20208 đều sinh trưởng và phát triển tốt nhất (pha log) trong khoảng thời gian từ 12 đến 24 giờ, sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt 12,20 LogCFU/ml. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào giảm dần và bắt đầu pha suy vong sau 30 giờ, do hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng của VK diễn ra, cùng với sản phẩm của quá trình trao đổi chất đã ức chế sự phát triển của VK nên số lượng tế bào sinh ra ít hơn số lượng tế bào mất đi (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998). Chủng B. amyloliquefaciens có khả năng sinh bào tử để trở về trạng thái tiềm sinh nên khi kéo dài thời gian nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì chủng vẫn giữ được một mức ổn định nhất định về mật độ tế bào.

Vì vậy, khi nuôi cấy B. amyloliquefaciens DV20208 trong môi trường LB lỏng, pH = 7, tỷ lệ cấp giống là 5% ở nhiệt độ 35°C, sẽ tiến hành thu sinh khối ở mốc 18 giờ nuôi cấy. Trong hầu hết các nghiên cứu lựa chọn thời gian sinh trưởng thích hợp, các chủng

Bacillus đều được lên men trong khoảng thời gian từ 18-24 giờ (Sreekumar and Krishnan,

2010; Han et al., 2014; Tuan and Huong, 2014) để đảm bảo cho sinh khối thu được với tỷ lệ cao.

3.3. Khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208 3.3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus 3.3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208

Bacillus amyloliquefaciens DV20208 nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, pH = 7,

với tỉ lệ tiếp giống B. amyloliquefaciens DV20208 là 5%, ở nhiệt độ 35oC Tiến hành nuôi cấy lắc với chế độ 150 vòng/phút, trong vòng 24 giờ. Ly tâm dung dịch sau khi nuôi cấy ở chế độ 8000 vòng/phút, trong 10 phút và tiến hành xác định hoạt tính enzyme amylase, protease, cellulase và chitinase bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả

8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Mật độ tế bào(LogCFU/m l)

nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của B. amyloliquefaciens DV20208 được thể