4. Nội dung nghiên cứu
2.3.4. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Tiến hành tách chiết DNA tổng số, giải trình tự gen 16S, xử lý trình tự, tra cứu trên BLAST NCBI và vẽ cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA X., theo phương pháp Maximum likelihood.
2.3.5. Xây dựng đường chuẩn của chủng Bacillus amyloliquefaciens
Xây dựng đường tương quan giữa OD và mật độ tế bào (LogCFU/ml).
Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng sau 24h. Pha loãng dịch vi khuẩn theo các nồng độ OD ở bước sóng 600nm lần lượt là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Ở từng giá trị OD tiến hành pha loãng mẫu đến nồng độ 10-8 và cấy trang trên đĩa Petri chứa môi trường LB ở các nồng độ 10-6, 10-7, 10-8. Đặt đĩa Petri lên tủ ấm ở nhiệt độ 30oC, trong vòng 24h. Đếm các khuẩn lạc trên đĩa Petri.
Để xác định được số lượng tế bào qua các giá trị OD, tiến hành lập đường chuẩn thể hiện mối tương quan này. Kết quả của mối tương quan giữa OD và mật độ tế bào (logCFU/ml) được thể hiện ở hình 2.2.
Hình 2.2. Mối tương quan giữa OD và mật độ tế bào B. amyloliquefaciens DV20208
2.3.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn
Giống vi sinh vật được tăng sinh trong môi trường LB lỏng. Nuôi cấy lắc ở chế độ 150 vòng/phút Sau thời gian 24 giờ, tiến hành đo OD bằng máy đo quang phổ Jasco V - 750 ở bước sóng 600nm.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Vẽ đường cong sinh trưởng thể hiện ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn, trong 60 giờ, cứ 6 giờ đo 1 lần.
Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống
Tiến hành tiếp giống vi sinh vật vào các bình theo mật độ khác nhau: 1%; 3%; 5%; 7%; 9 %.
Ảnh hưởng của pH
Nuôi cấy lắc trong môi trường LB được điều chỉnh pH bằng HCl và NaOH theo các giá trị pH: 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
Các chủng vi sinh vật tuyển chọn được trong môi trường LB, bổ sung thêm NaCl vào môi trường LB với các nồng độ: 0, 1, 2, 3, 4, 5%. đo OD600 nm để xác định mật độ vi khuẩn sau 24 giờ.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
B. amyloliquefaciens được nuôi cấy ở 6 nhiệt độ khác nhau: 20; 25; 30; 35; 40; 45oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đo OD để xác định mật độ vi khuẩn sau 24 giờ.
y = 1.7478x + 8.7466 R² = 0.9964 8.8 8.9 9 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Mật độ tế bào (LogCFU/m l) OD600nm
2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn nuôi cấy ở điều kiện tối ưu, sau 24h tiến hành ly tâm ở 13000 vòng/phút trong vòng 10 phút, sau đó tiến hành xác định hoạt tính enzyme amylase, cellulase, protease và chitinase bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Môi trường xác định khả năng sinh enzyme Cellulase
Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường CMC (10g/l CMC, 1g/l (NH4)2SO4 , 1g/l K2HPO4, 0,5g/l MgSO4 .7H2O, 0,01g/l NaCl, 20 g/l Agar) (Teather and Wood, 1982).
Môi trường xác định khả năng sinh enzyme chitinase
Hoạt tính chitinase được kiểm tra trên môi trường MMHL rắn có bổ sung 0.5% colloidal chitin bằng phương pháp đục lỗ thạch kết hợp nhuộm dung dịch Lugol (Gupta et al., 2017).
Môi trường xác định khả năng sinh enzyme protease
Khả năng phân giải protein của vi khuẩn được đánh giá nhờ vào khả năng tạo vòng phân giải trên môi trường Casein (10g/l casein; 0,5g/l KCl; 1,5g/l K2HPO4; 0,5g/l MgSO4 .7H2O; 0,01g/l FeSO4 .7H2O; 20g/l agar) (Teather and Wood, 1982).
Xác định khả năng sinh enzyme amylase
Hoạt tính enzyme amylase được xác định nhờ vào khả năng tạo vòng phân giải trên môi trường có tinh bột tan gồm 1g/l K2HPO4; 0,5g/l MgSO4 .7H2O; 0,5g/l KCl; 0,01g/l FeSO4.7H2O; 2g/l NaNO3; 10g/l Tinh bột tan; 20g/l agar (Bose and Das, 1996).
2.3.8. Khả năng đối kháng với các chủng gây bệnh
Khả năng đối kháng với chủng Escherichia coli, Ralstonia, Bacillus cereus được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch. Đường kính vòng kháng khuẩn được tính theo công thức như sau:
ΔD = D – d
Trong đó: ΔD : đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch D : đường kính vùng ức chế
D : đường kính lỗ thạch
2.3.9. Phương pháp nhân nhanh sinh khối
Cho 100ml môi trường LB được chuẩn bị trong các bình có dung tích 250ml, hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121oC, trong vòng 21 phút. Để nguội môi trường trong tủ cấy. Tiếp giống tỷ lệ 5% vào bình. Khử trùng giấy bạc và miệng bình tam giác dưới đèn cồn. Đóng nắp bình thủy tinh bằng giấy bạc, quấn chặt miệng và cổ bình tam giác bằng
parafilm. Cho bình vào lắc ở tốc độ 150 vòng/phút ở 30-35oC, 150 vòng/phút, trong vòng 24-30 giờ.
2.3.10. Phương pháp thử nghiệm ứng dụng vi khuẩn xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm
Bảng 2.1. Tỉ lệ C/N của bùn thải nhà máy chế biến tôm trước khi ủ Tỉ lệ C/N Tỉ lệ C/N thích hợp
25,6/1 25/1 – 30/1
Kết quả bảng 2.1 cho thấy tỉ lệ C/N có trong bùn thải rất thấp sẽ khiến cho các vi sinh vật chuyển hóa lượng nitơ dư thừa thành NH3 khiến cho đống ủ mất dần lượng đạm, làm giảm chất lượng phân, ngoài ra, còn gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, chúng ta phải đảm bảo tỷ lệ C/N nằm trong khoảng 25 - 30 bằng cách phối trộn với các nguyên liệu khác, ở đây nghiên cứu chọn bã thải nấm vì bã thải nấm có tỉ lệ C/N = 53,1. Ngoài ra, bã thải nấm làm tăng độ thoáng khí của khối ủ.
Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu trước khi ủ
Nguyên liệu pH Ẩm độ (%) Tỉ lệ C/N
Bùn thải 7,2 40 25,6/1
Bã thải nấm 8,31 10 53,1/1
Thí nghiệm được bố trí thành 4 công thức thể hiện ở bảng 2.3
Bảng 2.3. Các công thức ủ xử lý bùn thải
Công thức ủ
Thành phần phối trộn Bùn thải của nhà
máy chế biên tôm
Mùn cưa sau khi trồng nấm Gỗ keo lá tràm sau khi trồng nấm CT1 (mẫu đối chứng) 100 - - CT2 70 15 15 CT3 70 - 30 CT4 70 30 -
Quá trình ủ được tiến hành trong thùng xốp kích thước dài x rộng x cao: 48 x 35 x 30 (cm). Tiến hành trải một lớp bã thải nấm, sau đó trải tiếp một lớp bùn thải của nhà máy chế
biến tôm, phun sinh khối chứa Bacillus amyloliquefaciens DV20208. Tiến hành kiểm tra mẫu 5 ngày/1 lần theo các chỉ tiêu:
- Đầu vào: cảm quan, nhiệt độ, độ ẩm, mật độ E. coli , Salmonella. - Trong quá trình ủ: cảm quan, nhiệt độ, độ ẩm, độ sụt giảm thể tích
- Đầu ra (dùng sản phẩm sau ủ đánh giá chất lượng phân): cảm quan, độ ẩm, mật độ
E. coli , Salmonella.
2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 03 lần. Kết quả được tính toán và xử lí bằng toán thống kê trên chương trình MS - Excel.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và định danh vi khuẩn từ bùn thải của nhà máy chế biến tôm
3.1.1. Phân lập vi khuẩn từ bùn thải của nhà máy chế biến tôm
Từ bùn thải nhà máy chế biến tôm ủ thô từ 15 đến 20 ngày, tiến hành chọn vùng có màu trắng, dùng que cấy cấy ria trên môi trường LB có pH = 7, nuôi ở 35oC trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành tuyển chọn các chủng VSV dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc nuôi trong môi trường LB sau 24 giờ. Kết quả phân lập được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc Bacillus trên môi trường LB
Qua hình 3.1 cho thấy, chủng vi khuẩn phân lập được có màu trắng sữa, xù xì, khô ráp, tròn, bề mặt nhăn khô, tâm lồi sần sùi. Tiến hành nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi có vật kính với độ phóng đại 100x, thu được kết quả thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Hình thái tế bào của vi khuẩn sau khi nhuộm Gram (100x)
Kết quả cho thấy, các tế bào của chủng bắt màu tím của thuốc nhuộm, chứng tỏ vi khuẩn này thuộc Gram dương. Khuẩn lạc có hình que, kích thước khoảng 3,13µm. Các đặc điểm này phù hợp với mô tả của vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thống phân loại Bergey (Buchanan and Gibbons, 1974).
3.1.2. Xác định các phản ứng test sinh - hoá của vi khuẩn Bacillus sp.
Để có thêm cơ sở khoa học để khẳng định chủng vi sinh vật phân lập được từ bùn thải nhà máy chế biến tôm là vi khuẩn Bacillus sp. tiến hành xác định các phản ứng test
sinh - hóa, bao gồm: khả năng sinh tổng hợp catalase, khả năng di động và khả năng sinh tổng hợp oxidase.
Kết quả thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp catalase
Để tiến hành phản ứng catalase, dùng que thủy tinh lấy một ít khuẩn lạc thuần đặt lên một lam kính sạch. Nhỏ vài giọt hydrogene peroxide (H2O2) 3% lên sinh khối vi khuẩn trên lam kính quan sát kết quả. Kết quả thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm catalase
Kết quả từ hình 3.3 cho thấy khi nhỏ hydrogene peroxide (H2O2) 3% lên sinh khối của vi khuẩn cho hiện tượng sủi bọt khí (do khí O2 thoát ra). Vậy có thể kết luận, chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh enzyme catalase. Catalase là enzyme có mặt ở peroxisome trong hầu hết các tế bào hiếu khí và là một thành phần trung tâm của các quá trình khử độc, ngăn chặn nhanh sự hình thành H2O2 bằng cách xúc tác cho quá trình phân giải H2O2 thành H2O và O2 (Phạm Thu Hương et al., 2017).
Kết quả thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp oxidase
Nhỏ vài giọt thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% trên giấy lọc đã được khử trùng trên một lam kính sạch. Dùng que thủy tinh vô trùng lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn cọ lên vùng thuốc thử trên giấy lọc.
Kết quả thử nghiệm cho thấy, chủng vi khuẩn này cho kết quả dương tính (thuốc thử Tetramethyl-p- phenylenediamine dihydrochloride bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu tím thẫm.
Hình 3.4. Hoạt tính sinh tổng hợp oxidase của vi khuẩn Kết quả thử nghiệm khả năng di động
Cấy đâm sâu sinh khối chủng vi khuẩn vào môi trường thạch mềm, khoảng 2/3 ống thạch. Nuôi cấy ở 35oC sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả. Kết quả được trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5. Khả năng di động của vi khuẩn
Kết quả thử nghiệm cho thấy, sau 24 giờ mẫu vi khuẩn phân lập được làm đục môi trường xung quanh, mọc lan ra khỏi đường cấy, cho thấy chúng có khả năng di động.
Qua kết quả thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn phân lập được này đều có các phản ứng dương tính liên quan đến xét nghiệm catalase, oxidase và thử nghiệm khả năng di động. Như vậy, dựa vào các kết quả thu được từ phân tích các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram kết hợp với xác định các phản ứng sinh - hóa và khóa phân loại của Bergey có thể khẳng định là chủng vi khuẩn phân lập được từ bùn thải nhà máy chế biến tôm này thuộc chi Bacillus sp. Để xác định chính xác loài của vi khuẩn này, tiến hành định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
DNA tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR trình tự 16S rRNA. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR chứa trình tự 16S rRNA được khuếch đại, kích thước 1500 bp (Hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại gen 16SrRNA của vi khuẩn
(M: thang phân tử chuẩn, 1: sản phẩm PCR trình tự 16S rRNA)
Sau khi xác định sơ bộ vi sinh vật phân lập là vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Chủng vi khuẩn được gửi đi định danh tại Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Tiến hành phá mẫu thu DNA, giải trình tự gen vùng 16S rRNA. Tra cứu trên BLAST - NCBI, xây dựng cây phát sinh loài, kết quả được thể hiện ở hình 3.7 và hình 3.8.
Hình 3.7. Kết quả tra cứu trên BLAST NCBI
Chủng vi khuẩn phân lập được có trình tự vùng gene 16S rRNA tương đồng 99,42% với loài Bacillus amyloliquefaciens DSM7 = ATCC 23350, có thể kết luận rằng, chủng vi khuẩn phân lập từ bùn thải nhà máy chế biến tôm là loài Bacillus amyloliquefaciens. Đặt tên cho loài vi sinh vật này là: Bacillus amyloliquefaciens DV20208.
Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên mối quan hệ di truyền của các chủng
Theo nhiều nghiên cứu thì các chủng thuộc giống Bacillus như: Bacillus subtilis; Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis; Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus methylotrophycus; Bacillus megaterium,... đều là các chủng vi khuẩn không gây độc tố và
an toàn, thậm chí có thể sử dụng với vai trò là probiotic trong thực phẩm (Sorokulova et al., 2008; Algburi et al., 2016). Vậy chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208 đã tuyển chọn đáp ứng được yêu cầu an toàn và hoàn toàn có thể ứng dụng được trong xử lý môi trường.
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn
Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường, mặt khác thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất. Do đó mà quá trình sinh trưởng phát triển và trao đổi chất của vi sinh vật có liên quan chặt chẽ với các điều kiện môi trường nuôi cấy. Có nhiều yếu tố khác nhau bao gồm các yếu tố về dinh dưỡng (nguồn cacbon, nguồn nitơ, khoáng…) và các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, nồng độ muối,…) tác động qua lại với nhau ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Tại giá trị tối thích của các yếu tố tác động, vi sinh vật sẽ phát triển tối ưu và lượng sinh khối thu được lớn nhất (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998).
Với mục đích tạo chế phẩm vi sinh vật từ chủng Bacillus amyloliquefaciens DV20208 để ứng dụng trong xử lý bùn thải của nhà máy chế biến tôm, tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của Bacillus amyloliquefaciens DV20208.
Chuẩn bị 5 bình môi trường LB lỏng, với pH = 7. Bacillus amyloliquefaciens
DV20208 được cho vào bình lắc theo các tỷ lệ: 1%; 3%; 5%; 7%; 9%. 5 bình được nuôi cấy lắc ở chế độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 35oC. Sau 24 giờ lên men, kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống được thể hiện trên hình 3.9.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống
Dựa vào hình 3.9 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy với tỷ lệ tiếp giống 5% cho mật độ tế bào cao nhất là 11,71 LogCFU/ml. Nếu tăng tỷ lệ giống lên trên 9% thì mật độ tế bào sau 24 giờ nuôi cấy giảm còn 11,32 LogCFU/ml. Nguyên nhân có thể do khi mật độ giống ban đầu quá cao thì các chất dinh dưỡng trong môi trường nhanh chóng bị cạn kiệt trước khi vi sinh vật đạt được tốc độ tăng sinh tối đa. Còn khi tỷ lệ tiếp giống thấp (1% và 3%) thì pha tiềm phát (pha Lag) kéo dài, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật do đó sau 24 giờ nuôi cấy mật độ vi khuẩn chỉ đạt 11,11 LogCFU/ml và 11,23 LogCFU/ml.
Vì vậy, để vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong vòng 24 giờ lựa chọn tỷ lệ cấp giống là 5%. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của Argue - Arias và cs. (2009).
3.2.2. Ảnh hưởng của pH
Bacillus amyloliquefaciens DV20208 được nuôi cấy lắc trong môi trường LB ở chế
độ 150 vòng/phút với nhiệt độ 35oC có giá trị pH thay đổi từ 2 đến 9, tỷ lệ tiếp giống 5%. Sau 24 giờ lên men, kết quả thể hiện trên hình 3.10 và 3.11
11.11 11.23 11.71 11.67 11.32 10.60 10.80 11.00 11.20 11.40 11.60 11.80 1 3 5 7 9 Mật độ tế bào (LogCFU/m l) Tỷ lệ cấp giống (%)
Hình 3.10. Sinh khối B. amyloliquefaciens DV20208 ở giá trị pH từ 2-9 sau nuôi cấy
Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH
Kết quả cho thấy, B. amyloliquefaciens DV20208 có thể sinh trưởng và phát triển ở