4. Nội dung nghiên cứu
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn
Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường, mặt khác thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất. Do đó mà quá trình sinh trưởng phát triển và trao đổi chất của vi sinh vật có liên quan chặt chẽ với các điều kiện môi trường nuôi cấy. Có nhiều yếu tố khác nhau bao gồm các yếu tố về dinh dưỡng (nguồn cacbon, nguồn nitơ, khoáng…) và các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, nồng độ muối,…) tác động qua lại với nhau ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Tại giá trị tối thích của các yếu tố tác động, vi sinh vật sẽ phát triển tối ưu và lượng sinh khối thu được lớn nhất (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998).
Với mục đích tạo chế phẩm vi sinh vật từ chủng Bacillus amyloliquefaciens DV20208 để ứng dụng trong xử lý bùn thải của nhà máy chế biến tôm, tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của Bacillus amyloliquefaciens DV20208.
Chuẩn bị 5 bình môi trường LB lỏng, với pH = 7. Bacillus amyloliquefaciens
DV20208 được cho vào bình lắc theo các tỷ lệ: 1%; 3%; 5%; 7%; 9%. 5 bình được nuôi cấy lắc ở chế độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 35oC. Sau 24 giờ lên men, kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống được thể hiện trên hình 3.9.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống
Dựa vào hình 3.9 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy với tỷ lệ tiếp giống 5% cho mật độ tế bào cao nhất là 11,71 LogCFU/ml. Nếu tăng tỷ lệ giống lên trên 9% thì mật độ tế bào sau 24 giờ nuôi cấy giảm còn 11,32 LogCFU/ml. Nguyên nhân có thể do khi mật độ giống ban đầu quá cao thì các chất dinh dưỡng trong môi trường nhanh chóng bị cạn kiệt trước khi vi sinh vật đạt được tốc độ tăng sinh tối đa. Còn khi tỷ lệ tiếp giống thấp (1% và 3%) thì pha tiềm phát (pha Lag) kéo dài, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật do đó sau 24 giờ nuôi cấy mật độ vi khuẩn chỉ đạt 11,11 LogCFU/ml và 11,23 LogCFU/ml.
Vì vậy, để vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong vòng 24 giờ lựa chọn tỷ lệ cấp giống là 5%. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của Argue - Arias và cs. (2009).
3.2.2. Ảnh hưởng của pH
Bacillus amyloliquefaciens DV20208 được nuôi cấy lắc trong môi trường LB ở chế
độ 150 vòng/phút với nhiệt độ 35oC có giá trị pH thay đổi từ 2 đến 9, tỷ lệ tiếp giống 5%. Sau 24 giờ lên men, kết quả thể hiện trên hình 3.10 và 3.11
11.11 11.23 11.71 11.67 11.32 10.60 10.80 11.00 11.20 11.40 11.60 11.80 1 3 5 7 9 Mật độ tế bào (LogCFU/m l) Tỷ lệ cấp giống (%)
Hình 3.10. Sinh khối B. amyloliquefaciens DV20208 ở giá trị pH từ 2-9 sau nuôi cấy
Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH
Kết quả cho thấy, B. amyloliquefaciens DV20208 có thể sinh trưởng và phát triển ở cả môi trường acid và bazơ. Ở ngưỡng giá trị pH: 5; 7; 8; 9 mật độ tế bào B. amyloliquefaciens DV20208 là 11,20; 11,47; 11,76; 11,68; 11,51 LogCFU/ml. Ở ngưỡng
pH từ 2 đến 4 có sự gia tăng mật độ tế bào, nhưng sự gia tăng này không cao, kết quả này thể hiện ở hình 3.10 sau 24 giờ nuôi cấy không thấy sự thay đổi rõ rệt ở màu môi trường.
B. amyloliquefaciens DV20208 có thể sinh trưởng trong tất cả các giá trị pH từ 2 đến 9, kết
quả nghiên cứu này phù hợp với công bố của Nguyễn Thế Truyền (2013).
Qua hình 3.11 cho thấy, ở pH = 7 vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 có mật độ tế bào lớn nhất, đạt 11,76 LogCFU/ml. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó về B. amyloliquefaciens cho rằng giá trị pH thích hợp nhất cho sự phát triển sinh khối của chúng là ở dải pH trung tính, đặc biệt ở pH = 7 (Tuan and Huong, 2014; Abd-Elhalem et al., 2015; Khusro and Aarti, 2015).
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
9.10 9.32 9.42 11.20 11.47 11.76 11.68 11.51 0.00 1.50 3.00 4.50 6.00 7.50 9.00 10.50 12.00 13.50 2 3 4 5 6 7 8 9 Mật độ tế bào (LogCFU/m l) pH
Sử dụng 5 bình dung tích 150ml, mỗi bình đều chứa 50ml dung dịch môi trường LB, pH = 7, với tỉ lệ tiếp giống B. amyloliquefaciens DV20208 là 5%. Tiến hành nuôi cấy lắc 5 bình với chế độ 150 vòng/phút, mỗi bình trong mỗi ngưỡng nhiệt độ: 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC trong vòng 24 giờ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.12 cho thấy mật độ tế bào chủng B. amyloliquefaciens DV20208 đạt giá trị cao nhất là 12,05 LogCFU/ml ở 35oC (Hình 3.13). Ở nhiệt độ 30°C mật độ tế bào DV20208 đạt 11,98 LogCFU/ml. Ở nhiệt độ 30°C và 35°C cho thấy không có sự sai khác ở mức ý nghĩa (p<0,05) về giá trị LogCFU/ml. Điều này chứng tỏ chủng này thích hợp với môi trường ở nhiệt độ trong khoảng 30-35°C, kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lee A và cộng sự năm 2017 khi nghiên cứu probiotic trên B. amyloliquefaciens.
Ở nhiệt độ 25°C, chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 phát triển chậm và mật độ tế bào chỉ đạt 11,48 LogCFU/ml thấp hơn so với ở nhiệt độ 35°C.
Tiếp tục tăng nhiệt độ hơn nữa thì nhận thấy mật độ tế bào vi khuẩn giảm rõ rệt. Điều này chứng tỏ nhiệt độ 45°C kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi sinh vật. Ở ngưỡng nhiệt độ 45°C trở lên B. amyloliquefaciens DV20208 không thích hợp để phát
triển. Kết quả trên tương đồng với kết quả nghiên cứu của Das và cộng sự (2014).
3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
11.48 11.98 12.05 11.69 10.74 9.60 9.90 10.20 10.50 10.80 11.10 11.40 11.70 12.00 12.30 25 30 35 40 45 Mật độ tế bào(LogCFU/m l) Nhiệt độ °C
Nuôi cấy lắc B. amyloliquefaciens DV20208 trong 5 bình môi trường LB lỏng, pH=7 với nồng độ muối NaCl thay đổi từ 1, 3, 5, 7, 9%. Nuôi cấy lắc với chế độ 150 vòng/phút ở 35oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, kết quả được thể hiện ở hình 3.13.
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
Kết quả từ hình 3.13 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn DV20208 là loài ưa muối, chúng có khả năng chịu đựng và sống sót ở tất cả các nồng độ muối, có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nồng độ muối cao nhất là 9% với tỷ lệ mật độ vi khuẩn dao động không đáng kể. Mật độ tế bào vi khuẩn B. amyloliquefaciens DV20208 giảm dần khi nồng độ muối tăng dần. So với nồng độ muối 5%, 7%, 9% thì ở nồng độ muối 1% và 3% có mật độ tế bào vi khuẩn cao hơn. Ngoài ra, DV20208 phát triển tốt nhất ở nồng độ muối 3% trong môi trường nuôi với mật độ 12,06 LogCFU/ml điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây khi khảo sát khả năng chịu muối của B. amyloliquefaciens (Ngô Thị Thu Thảo et al., 2016; Das et al., 2014).
3.2.5. Xây dựng đường cong sinh trưởng
Đường cong sinh trưởng được xây dựng với mục đích nghiên cứu định tính VSV theo thời gian và xác định thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998) Tiến hành nuôi cấy lắc B. amyloliquefaciens DV20208 với chế độ 150 vòng/phút trên môi trường LB lỏng pH = 7, tỷ lệ cấp giống là 5% ở nhiệt độ 35°C trong thời gian 60h. Kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật: thông qua mối tương quan giữa giá trị OD và phương trình tương quan để tính mật độ tế bào. Từ đó, xây dựng được đường cong sinh trưởng của
B.amyloliquefaciens DV20208 (hình 3.15). 11.76 12.06 11.46 11.29 10.73 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 1 3 5 7 9 Mật độ tế bào (LogCFU/m l) Nồng độ muối NaCl (%)
Hình 3.14. Đường cong sinh trưởng của B. amyloliquefaciens DV20208
Kết quả xác định mật độ tế bào vi khuẩn ở các thời gian khác nhau được thể hiện ở hình 3.14 cho thấy: B. amyloliquefaciens DV20208 đều sinh trưởng và phát triển tốt nhất (pha log) trong khoảng thời gian từ 12 đến 24 giờ, sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt 12,20 LogCFU/ml. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào giảm dần và bắt đầu pha suy vong sau 30 giờ, do hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng của VK diễn ra, cùng với sản phẩm của quá trình trao đổi chất đã ức chế sự phát triển của VK nên số lượng tế bào sinh ra ít hơn số lượng tế bào mất đi (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998). Chủng B. amyloliquefaciens có khả năng sinh bào tử để trở về trạng thái tiềm sinh nên khi kéo dài thời gian nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì chủng vẫn giữ được một mức ổn định nhất định về mật độ tế bào.
Vì vậy, khi nuôi cấy B. amyloliquefaciens DV20208 trong môi trường LB lỏng, pH = 7, tỷ lệ cấp giống là 5% ở nhiệt độ 35°C, sẽ tiến hành thu sinh khối ở mốc 18 giờ nuôi cấy. Trong hầu hết các nghiên cứu lựa chọn thời gian sinh trưởng thích hợp, các chủng
Bacillus đều được lên men trong khoảng thời gian từ 18-24 giờ (Sreekumar and Krishnan,
2010; Han et al., 2014; Tuan and Huong, 2014) để đảm bảo cho sinh khối thu được với tỷ lệ cao.
3.3. Khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208 3.3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus 3.3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens DV20208
Bacillus amyloliquefaciens DV20208 nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, pH = 7,
với tỉ lệ tiếp giống B. amyloliquefaciens DV20208 là 5%, ở nhiệt độ 35oC Tiến hành nuôi cấy lắc với chế độ 150 vòng/phút, trong vòng 24 giờ. Ly tâm dung dịch sau khi nuôi cấy ở chế độ 8000 vòng/phút, trong 10 phút và tiến hành xác định hoạt tính enzyme amylase, protease, cellulase và chitinase bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả
8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Mật độ tế bào(LogCFU/m l)
nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của B. amyloliquefaciens DV20208 được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.16.
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải enzyme của B. amyloliquefaciens DV20208
Đường kính vòng phân giải (cm)
Chitinase Protease Cellulase Amylase 1,8 ± 0,08 3,19 ± 0,14 1,24 ± 0,12 2,88 ± 0,08
Hình 3.15. Khả năng sinh enzyme của B. amyloliquefaciens DV20208
(A: Chitinase; B: Protease; C: Cellulase; D: Amylase)
Từ kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.15 cho thấy chủng B. amyloliquefaciens DV20208 có khả năng phân giải chitin, cellulose, protein, tinh bột. Như vậy, B. amyloliquefaciens
DV20208 có khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào tương ứng: chitinase, protease, cellulae, amylase.Trong đó, khả năng sinh enzyme protease là cao nhất, đường kính vòng phân giải đạt 3,19 ± 0,14 cm. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó của (Trịnh Thành Trung et al., 2013) về khả năng sinh enzyme ngoại bào từ B. amyloliquefaciens phân lập tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên.
3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của B. amyloliquefaciens DV20208 với các chủng vi sinh vật gây hại
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của B. amyloliquefaciens DV20208 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.16.
Hình 3.16. Khả năng đối kháng của B. amyloliquefaciens với các chủng gây bệnh
(A: E.coli; B: Ralstonia; C: B.cereus)
B. amyloliquefaciens DV20208 có khả năng đối kháng với E.coli, Ralstonia và B.cereus (Hình 3.16) với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 1,3 ± 0,2 cm; 1,08 ±
0,4 cm; 1,42 ± 0,2 cm. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cs (2012) về khả năng tạo biofilm và khả năng đối kháng với E.coli của B.subtilis UI.3 và khả năng đối kháng với mạnh với Samonella và Ralstonia của Bacillus velezensis U3.7 (Nguyễn Quang Huy and Trần Thúy Hằng, 2012). Hay công trình nghiên cứu về chủng Bacillus subtilis RB14 có khả năng kháng Rhizoctonia solani gây bệnh cây cà chua, tuy nhiên, với các chủng
vi khuẩn gây hại khác hiện chưa có nhiều kết quả nghiên cứu tương tự (Asaka and Shoda, 1996).
Bacillus amyloliquefaciens DV20208 có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao như
protease, chitinase, amylase, cellulase và có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh như:
E.coli, Ralstonia, B.cereus nên chủng vi khuẩn này có tiềm năng xử lý nguồn bùn thải của
nhà máy chế biến tôm và có khả năng kiểm soát mầm bệnh trong bùn thải.
3.4. Thử nghiệm ứng dụng B. amyloliquefaciens DV20208 xử lý bùn thải nhà máy chế
biến tôm
3.4.1. Nhân nhanh sinh khối chủng B. amyloliquefaciens DV20208
Dựa vào các kết quả nghiên cứu trong phần 2.2.6, tiến hành nuôi cấy lắc B. amyloliquefaciens DV20208 trong môi trường LB, pH = 7, ở nhiệt độ 35oC, tỉ lệ tiếp giống 5%. Sau 18 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt 12,09 LogCFU/ml. Tiến hành thu sinh khối B.
amyloliquefaciens DV20208 để thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm.
3.4.2. Thử nghiệm xử lý bùn thải nhà máy chế biến tôm
Bùn thải của nhà máy chế biến tôm được xử lý sơ bộ sẽ có kích thước hạt từ 3 - 4cm, độ ẩm của bùn thải đạt 30 - 40%, pH = 7,14; nhiệt độ ban đầu của bùn thải bằng với nhiệt độ của môi trường. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy chất hữu cơ do vi sinh vật, trong đó tỉ lệ C/N là thông số dinh dưỡng quan trọng nhất. C/N là thông số quan trọng nhất về các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật. Cacbon trong các chất thải hữu cơ được vi sinh vật đồng hóa để tạo nên tế bào mới chiếm khoảng 20 - 40%, phần còn lại được biến đổi thành CO2 và quá trình sinh năng lượng. Các tế bào vi khuẩn chứa 50%C và 5%N, do đó lượng đạm cần thiết trong khối ủ phải chiếm từ 2 - 4%. Quá nhiều cacbon sẽ làm chậm quá trình phân hủy, còn lượng đạm cao sẽ gây mùi hôi thối (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998). Tỉ lệ C/N tối ưu cho quá trình ủ phân khoảng 25/1-30/1. Ở mức tỷ lệ thấp hơn, nitơ sẽ thừa và sinh ra NH3, gây mùi khai. Ở mức tỉ lệ cao hơn, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật do thiếu N. Chúng phải trải qua nhiều chu kỳ chuyển hóa, oxy hóa các
cacbon dư cho đến khi đạt tỉ lệ C/N thích hợp. Do đó, thời gian cần thiết cho quá trình phân hủy bị kéo dài hơn và sản phẩm thu được chứa ít mùn hơn.
Thử nghiệm ứng dụng B. amyloliquefaciens DV20208 để xử lý bùn thải của nhà máy chế biến tôm theo 4 công thức, được thể hiện trong bảng 2.1. Sau khi nguyên liệu đã được xử lý sơ bộ tiến hành ủ và theo dõi quá trình ủ về nhiệt độ, độ ẩm và độ sụt giảm thể tích.
Theo dõi 4 công thức ủ, và thu thập số liệu theo chu kì 5 ngày. Số liệu mỗi lần đo được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, độ sụt giảm thể tích, mật độ VSV được thể hiện lần lượt ở bảng 3.4, bảng 3.5,bảng 3.6. bảng 3.7
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của cơ chất đến nhiệt độ trong quá trình ủ
Thời gian (ngày) CT1 CT2 CT3 CT4
0 26oC 27oC 27oC 27,5oC
5 37oC 42,5oC 40oC 40,5oC
10 39oC 48,5oC 46,5oC 46,5oC
15 37oC 47oC 43,5oC 46,5oC
20 37oC 45oC 43oC 43oC
Qua bảng thống kê số liệu về sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình ủ cho thấy:
Ở 5 ngày sau ủ, ở 3 CT phối trộn có bổ sung chế phẩm B. amyloliquefaciens DV20208 nhiệt độ tăng mạnh so với công thức đối chứng (CT1). Nguyên nhân là do sự phát nhiệt và sự lưu giữ nhiệt của chính các CT ủ. Nhiệt độ tăng cao chứng tỏ các vi sinh vật trong đống ủ hoạt động mạnh thúc đẩy quá trình phân hủy các chất hữu cơ. Sự phát nhiệt do sự oxy hoá của các hợp chất hữu cơ và khi hoá năng chuyển thành nhiệt năng trong hoạt động trao đổi chất và phân huỷ hữu cơ của vi sinh vật.
Giai đoạn từ 5-10 ngày, các công thức CT2, CT3, CT4 có nhiệt độ ủ cao hơn 45°C. Kết quả này tương tự như nghiên cứu của Lý Thị Phương Hồng (2012) với nguyên liệu là