Tuyển chọn vi khuẩn bacillus sp sử dụng làm probiotic cho vật nuôi và khảo sát khả năng không chuyểnnhận gen kháng kháng sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp sử dụng làm probiotic cho vật nuôi khảo sát khả không chuyển/nhận gen kháng kháng sinh NGUYỄN THỊ MINH ĐỨC Duc.ntmcb190025@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ Thực phẩm Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Hồ Phú Hà Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp sử dụng làm probiotic cho vật nuôi khảo sát khả không chuyển/nhận gen kháng kháng sinh NGUYỄN THỊ MINH ĐỨC Duc.ntmcb190025@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ Thực phẩm Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Hồ Phú Hà Viện: Chữ ký GVHD Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2022 CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Nguyễn Thị Minh Đức Đề tài luận văn: Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp sử dụng làm probiotic cho vật nuôi khảo sát khả không chuyển/nhận gen kháng kháng sinh Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số SV: CB190025 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày với nội dung sau: - Chỉnh sửa lỗi tả, lỗi đánh máy, thuật ngữ khoa học, tên vi sinh vật, tài liệu tham khảo - Bỏ dấu chấm cuối tên đề tài - Phần tổng quan cần cô đọng, bám sát nội dung nghiên cứu - Đặt vấn đề làm bật nội dung ý nghĩa luận văn - Bổ sung thêm so sánh kết với nghiên cứu công bố - Chỉnh sửa phần kết luận Ngày tháng năm Giáo viên hướng dẫn Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG NHIỆM VỤ TỐT NGHIỆP Họ tên học viên: Nguyễn Thị Minh Đức Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Khóa: 2019B Viện: Cơng nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm Đề tài nghiên cứu: Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp sử dụng làm probiotic cho vật nuôi khảo sát khả không chuyển/nhận gen kháng kháng sinh Nội dung đề tài: - Tuyển chọn chủng Bacillus tiềm - Đánh giá tính nhạy cảm với số loại kháng sinh - Xác định khả kháng vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa vật ni có vi sinh vật kháng kháng sinh in vitro - Khảo sát khả nhận gen kháng kháng sinh chủng Bacillus lựa chọn Họ tên cán hướng dẫn: PGS.TS Hồ Phú Hà Ngày giao nhiệm vụ: 05/11/2019 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/12/2021 Ngày tháng năm 2022 Học viên Nguyễn Thị Minh Đức LỜI CẢM ƠN Khơng có thành công trải đầy hoa hồng thành cơng mà khơng có giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp từ người xung quanh Trong suốt năm học tập rèn luyện trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, bảo giảng dạy tận tình thầy Viện Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm truyền đạt cho em kiến thức vô quý báu, trang bị cho em kiến thức cần thiết tạo tiền đề cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Hồ Phú Hà, TS Nguyễn Hải Vân – Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Viện Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội ln tận tình bảo, hướng dẫn em suốt q trình thực hồn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Tiến Thành, ThS Lê Thị Lan Chi, thành viên phịng thí nghiệm 305-B1 thành viên trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt trình thực hoàn thành luận văn Con xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ln bên động viên suốt trình học tập, nghiên cứu Trong q trình thực hồn thành luận văn tốt nghiệp, thời gian kiến thức hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đóng góp ý kiến quý thầy cô để luận văn tốt nghiệp em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Tháng năm 2022 Học Viên Nguyễn Thị Minh Đức TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Đề tài: Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp sử dụng làm probiotic cho vật nuôi khảo sát khả không chuyển/nhận gen kháng kháng sinh Tác giả luận văn: Nguyễn Thị Minh Đức Khóa: 2019B Người hướng dẫn: PGS.TS Hồ Phú Hà Từ khóa: Bacillus, probiotic, chuyển/nhận gen kháng kháng sinh, cefotaxime Nội dung tóm tắt Lý chọn đề tài Các probiotic coi giải pháp hiệu thay việc sử dụng kháng sinh chăn nuôi nhằm cải thiện sức khỏe vật nuôi, tăng cường hệ miễn dịch, tăng trọng lượng, ngăn chặn tác nhân gây bệnh cho vật ni Trong đó, Bacillus sp coi vi khuẩn tiềm làm probiotic khả chịu điều kiện không thuận lợi thời gian sản xuất đường tiêu hóa vật ni Tuy nhiên, cần xác định khả chuyển/nhận gen kháng kháng sinh chủng Bacillus đường tiêu hóa xảy probiotics vi khuẩn hội gây bệnh Từ kết đó, đánh giá lựa chọn chủng Bacillus thích hợp để sử dụng làm probiotic cho vật ni Mục đích nghiên cứu luận văn Lựa chọn chủng Bacillus sp phù hợp làm probiotic cho vật ni có đặc tính probiotic, khơng có khả nhận gen kháng kháng sinh nhằm giảm thiểu lượng kháng sinh sử dụng Các nội dung nghiên cứu luận văn - Tuyển chọn chủng Bacillus tiềm - Đánh giá tính nhạy cảm với số loại kháng sinh - Xác định khả kháng vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa vật ni có vi sinh vật kháng kháng sinh in vitro - Khảo sát khả nhận gen kháng kháng sinh chủng Bacillus sp lựa chọn Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu sử dụng phương pháp: - Phương pháp bảo quản giống, phương pháp nhuộm Gram xác định mật độ tế bào - Phương pháp xác định hoạt tính catalase, xác định khả chịu axit - Phương pháp xác định khả kháng khuẩn đối kháng trực tiếp - Phương pháp pha loãng liên tục, phương pháp khuếch tán đĩa thạch - Phương pháp thống kê xử lý số liệu phần mềm excel 2019,… Kết luận - Tuyển chọn 52 chủng Bacillus có khả chịu mơi trường axit - Các chủng phân lập nhạy cảm với gentamycin, ciprofloxacin, kanamycin, streptomycin Phần lớn chủng nhạy cảm với chloramphenicol (97,0%), tetracycline (84,8%), amikacin (93,9%) clindamycin (66,7%), kháng với erythromycin (51,5%), ampicillin (90,9%), cefoxitin (75,8%), amoxicillin (72,7%) rifampicin (84,8%) - Năm chủng phân lập chọn gồm: P5QN4, CHL16, P4QN13, P4QN11, CHL15 có tác dụng ức chế vi khuẩn S aureus S21, S aureus ATCC 25923, E aerogenes với đường kính vịng kháng khuẩn dao động từ 0-13,0mm Trong chủng CHL16 có khả kháng S.aureus S21 tốt P4QN11 có khả kháng Staphylococcus aureus ATCC 25923 tốt Tất chủng Bacillus kiểm tra khơng có khả kháng Salmonella Typhimurium, Proteus vulgaris, E.coli Ec457 P.aeruginosa - Chủng CHL16 khơng có khả nhận gen kháng kháng chủng P4QN11 có khả nhận gen kháng kháng sinh từ E.coli Ec 457 với tần số tiếp hợp 2.63 x 10-4 sau nuôi cấy tiếp hợp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG v LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN Giới thiệu probiotic 1.1.Hệ vi sinh vật đường ruột tác động chúng đến sức khỏe vật chủ 1.2 Giới thiệu chung probiotic 1.3 Tiêu chuẩn lựa chọn probiotic chăn nuôi Giới thiệu vi khuẩn Bacillus 2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Bacillus 2.2 Một số đặc điểm probiotic có lợi vi khuẩn Bacillus 10 2.3 Tình hình sử dụng Bacillus chăn nuôi trạng Bacillus kháng sinh chuyển/nhận gen kháng kháng sinh 11 Đặc tính kháng khuẩn chủng Bacillus 16 Một số loại kháng sinh sử dụng 19 Một số chất sử dụng môi trường chọn lọc để nuôi cấy vi sinh vật 22 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1 Chủng vi sinh vật 27 2.1.2 Hóa chất- mơi trường 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phương pháp bảo quản giống 28 2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái xác định mật độ tế bào 29 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 30 2.2.4 Phương pháp xác định khả chịu axit 30 2.2.5 Phương pháp xác định khả kháng khuẩn 30 2.2.6 Phương pháp xác định tính nhạy cảm với kháng sinh 31 i 2.2.7 Phương pháp xác định nồng độ số thành phần môi trường chọn lọc cho E.coli Bacillus sp 34 2.2.8 Phương pháp đánh giá khả ức chế Cefotaxime đến phát triển E.coli Bacillus sp môi trường thạch 35 2.2.9 Phương pháp khảo sát khả chuyển/nhận gen kháng kháng sinh 37 2.2.10 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 38 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Tuyển chọn chủng Bacillus 39 3.2 Tính nhạy cảm với kháng sinh chủng Bacillus 40 3.3 Đánh giá khả kháng khuẩn chủng Bacillus 45 3.4 Xác định khả ức chế Cefotaxime đến phát triển E coli Bacillus sp 49 3.4.1 Khảo sát tính nhạy cảm với kháng sinh Cefotaxime chủng vi sinh vật 49 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng Cefotaxime đến phát triển Bacillus sp E.coli môi trường thạch 50 3.5 Xác định nồng độ số thành phần môi trường chọn lọc cho E coli Bacillus sp 54 3.5.1 Ảnh hưởng NaN3 đến phát triển E coli Bacillus sp môi trường thạch 54 3.5.2 Ảnh hưởng LiCl đến phát triển E coli Bacillus sp môi trường thạch 55 3.6 Khảo sát khả nhận gen kháng kháng sinh chủng Bacillus tiềm 58 CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 69 ii Commented [1]: mục lục, danh mục hình, bảng đến viết tắt DANH MỤC VIẾT TẮT AMP Ampicillin AMX Amoxicillin AK ATCC CFU C Amikacin American Type Culture Collection - Hệ thống Chủng chuẩn Mỹ Colony Forming Unit-Đơn vị hình thành khuẩn lạc Chloramphenicol CIP Ciprofloxacin CM Clindamycin CLSI FOX E Clinical and Laboratory Standard Institute - Viện chuẩn thức Lâm sàng Xét nghiệm Cefoxitin Erythromycin ESBL Extended-spectrum beta-lactamases (β-lactamase phổ mở rộng) GEN Gentamicin K Kanamycin I Nhạy cảm tức thời MHA Mueller Hinton agar MIC Nồng độ ức chế tối thiểu NA Nutrient agar NB Nutrient broth OD Optical density- mật độ quang R Đề kháng, ức chế RI Rifampicin S Nhạy cảm S Streptomycin TE Tetracycline WHO World Health Organization - Tổ chức Y tế Thế giới iii Chủng Bacillus sau nuôi cấy tiếp hợp với E.coli Ec457 (chủng cho) đem xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng (mục 2.2.6.b) để xác định tính nhạy cảm chủng Bacillus sau tiếp hợp với kháng sinh Cefotaxime Nồng độ kháng sinh Cefotaxime thử nghiệm 4, 8, 16, 32, 64 µg/ml Kết thể bảng 3.11 Bảng 11: Giá trị MIC chủng Bacillus sau nuôi cấy tiếp hợp Cefotaxime Chủng vi khuẩn Giá trị MIC (µg/ml) CHL16 ≤4 ±0 P4QN11 16 ± Từ kết bảng 3.11 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) CHL16 khơng có thay đổi Cefotaxime sau ni cấy tiếp hợp (≤4 µg/ml) chủng khơng có khả nhận gen kháng Cefotaxime từ chủng cho E.coli Ec457 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chủng tiếp hợp P4QN11 E.coli Ec457 tăng đáng kể (từ ≤4 µg/ml đến 16 µg/ml) Do đó, chủng P4QN11 coi có khả kháng kháng sinh có khả nhận gen kháng kháng sinh Cefotaxime với tần số trung bình 2,63 x10-4 60 CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Tuyển chọn 52 chủng Bacillus có khả chịu môi trường axit - Các chủng Bacillus phân lập nhạy cảm với gentamycin, ciprofloxacin, kanamycin, streptomycin Phần lớn chủng nhạy cảm với chloramphenicol (97,0%), tetracycline (84,8%), amikacin (93,9%) clindamycin (66,7%); kháng với erythromycin (51,5%), ampicillin (90,9%), cefoxitin (75,8%), amoxicillin (72,7%) rifampicin (84,8%) - Năm chủng phân lập chọn gồm: P5QN4, CHL16, P4QN13, P4QN11, CHL15 có tác dụng ức chế vi khuẩn S aureus S21, S aureus ATCC 25923, E aerogenes với đường kính vịng kháng khuẩn dao động từ 0-13,0mm Trong chủng CHL16 có khả kháng S aureus S21 tốt P4QN11 có khả kháng S aureus ATCC 25923 tốt Tất chủng Bacillus kiểm tra khơng có khả kháng Salmonella Typhimurium, Proteus vulgaris, E.coli Ec457 P.aeruginosa - Chủng CHL16 khơng có khả nhận gen kháng kháng sinh chủng P4QN11 có khả nhận gen kháng kháng sinh từ E.coli Ec457 sau nuôi cấy tiếp hợp với tần số tiếp hợp 2.63 x 10-4 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu phân tích sinh học phân tử chủng P4QN11 CHL16 để xác định rõ có mặt/khơng có mặt gen kháng kháng sinh Cefotaxime tế bào 61 Commented [23]: ghi rõ tên chủng TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Donaldson, R M, "Normal bacterial populations of the intestine and their relation to intestinal function," New England Journal of Medicine, pp 270(20), 1050-1056, 1964 [2] Fefana asbl, "Probiotics in animal nutrition," https://healthdocbox.com/73247954-Nutrition/Probiotics-in-animalnutrition.html, 2005 [3] Kingsley C Anukam, MHPM Gregor Reid, "Probiotics: 100 years (19072007) after Elie Metchnikoff’s observation," Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, p 466 – 474, 2007 [4] Đậu Ngọc Hào, "Sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi sức khỏe cộng đồng," Khoa học kỹ thuật thú ý, pp tập XXIII số 3-2016, 2016 [5] Patterson J.A and Burkholder K.M.,, "Application of prebiotics and probiotics in poultry production," J Animal Science, pp 82, pp 627-631., 2003 [6] Department of Animal Health and Production, Faculty of Veterinary Medicine, University of Nigeria, Nsukka, Nigeria, "Probiotics in animal production: A review.," Journal of Veterinary Medicine and Animal Health., pp Vol 5(11), pp 308-316,, 2013 [7] Yirga, H., "The use of probiotics in animal nutrition.," Journal of Probiotics & Health, p 03(02)., 2015 [8] Yu, H., Braun, P., Yildirim, M A., Lemmens, I., Venkatesan, K., Sahalie, J., … Vidal, M., "High-quality binary protein interaction map of the yeast interactome network," Science, pp 322(5898), 104–110., 2008 [9] Cho JH, Zhao PY, Kim IH, "Probiotics as a dietary additive for pigs," Journal of Animal and Veterinary Advances, pp 10: 2127-2134., 2011 [10] Steiner, T, "Probiotics in poultry and pig nutrition: basics and benefits.," 2009 [Online] [11] Cebra., J J., "Influences of microbiota on intestinal immune system development," American Journal of Clinical Nutrition, pp 69, pp 1046S1051S, 1999 [12] Dugas B., Mercenier A., Lenoir – Wijnkoop I., Arnaud C., Dugas N and Postaire E., "Immunity and prebiotics," Immunology Today, pp 20, pp 387390, 1999 62 [13] Fuller.R., "Probiotics in man and animals," J Appl Bacteriol, pp 66, pp 65– 78, 1989 [14] Phương Thị Hương, Vũ Văn Hạnh, "Lựa chọn điều kiện lên men cho sinh trưởng chủng Bacillus subtilis bsvn15 ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic chăn ni.," Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, pp 16(1): 167-172, 2017 [15] "Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance," EFSA Journal, 2012 [16] Elshaghabee FMF, Rokana N, Gulhane RD, Sharma C, Panwar H., "Bacillus as potential probiotics: status, concerns, and future perspectives," Front Microbiol, p 10;8:1490, 2017 Aug [17] Trịnh Thành Trung, Phan Lạc Dũng, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương, "Đặc điểm sinh học tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum sp 1901 phân lập Rừng Quốc gia Hoàng Liên.," Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ,, pp Tập 29, Số (2013) 59-70, 2013 [18] F Cadoret, M.T Alou, P Afouda, I.S Traore, L Bréchard, C Michelle, F Di Pinto, C Andrieu, J Delerce, A Levasseur, P.-E Fournier, D Raoult, "Noncontiguous finished genome sequences and description of Bacillus massiliglaciei, Bacillus mediterraneensis, Bacillus massilinigeriensis, Bacillus phocaeensis and Bacillus tuaregi, five new species identified by culturomics," New Microbes New Infect, p 19: 45–59, 2017 Sep [19] Sertac Argun Kvanỗ, Murat Takm, Merih Kvanỗ, and Gỹlay Güllülü, "Bacillus Spp isolated from the conjunctiva and their potential antimicrobial activity against other eye pathogens.," Afr Health Sci, p 14(2): 364–371, 2014 Jun; [20] Miguel Gueimonde, Borja Sánchez, Clara G de los Reyes-Gavilán, Abelardo Margolles., "Antibiotic resistance in probiotic bacteria," Front Microbiol, p 4, 2013 [21] Mingmongkolchai, S., & Panbangred, W., "Bacillus probiotics: an alternative to antibiotics for livestock production," Journal of Applied Microbiology, pp 124(6), 1334–1346, 2018 [22] FAO, "Probiotics in animal nutrition – Production, impact and regulation," 2016 [23] "Scientific opinion on the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally added to food and feed (2013 update)," EFSA Journal, p 11(11):3449, 2013 63 [24] Nguyễn Văn Phúc, Phan Thị Phượng Trang, "Phân lập, định danh xác định đặc tính có lợi chủng Bacillus spp từ ao nuôi tôm tỉnh Bến Tre.," Tạp chí khoa học DHSP TPHCM, vol số 64, 2014 [25] Lê Thị Hải Yến, Nguyễn Đức Hiền, "Khảo sát đặc tính probiotic chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tỉnh đồng sông cửu long," Tạp chı́ Khoa hoc Trường Đai học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp, pp (2): 26-32, 2016 [26] Barbosa, Teresa M., Serra, Cláudia R., La Ragione, Roberto M., Woodward, Martin J Henriques, Adriano O., "Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract," Applied and Environmental Microbiology,, pp 71(2), 968-978, 2005 [27] Alexopoulos, C., Georgoulakis, I E., Tzivara, A., Kyriakis, C S., Govaris, A., & Kyriakis, S C., "Field evaluation of the effect of a probiotic‐containing Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis spores on the health status, performance, and carcass quality of grower and finisher pigs," Journal of Veterinary Medicine Series A, pp 51(6), 306-312, 2004 [28] Hong, H A., Duc, L H., & Cutting, S M., "The use of bacterial spore formers as probiotics," FEMS Microbiology Reviews, pp 29(4), 813–835, 2005 [29] Zhu, K., Hölzel, C S., Cui, Y., Mayer, R., Wang, Y., Dietrich, R., … Ding, S., "Probiotic Bacillus cereus strains, a potential risk for public health in China," Frontiers in Microbiology, p 7, 2016 [30] Joachim Frey , "Antimicrobial resistance in Bacilli, transfer and detection.," Research field: Molecular biology [31] Monod, M., Denoya, C., and Dubnau, D., "Sequence and properties of pIM13, a macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance plasmid from Bacillus subtilis," J Bacteriol, pp 167, 138–147, 1986 [32] Ali Sevim, Elif Sevim., "Plasmid mediated antibiotic and heavy metal resistance in Bacillus strains isolated from soils in Rize, Turkey," Journal of Natural and Applied Science, pp 19(2), 133-141, 2015 [33] Noor Uddin, G M., Larsen, M H., Christensen, H., Aarestrup, F M., Phu, T M., & Dalsgaard, A., "Identification and antimicrobial resistance of bacteria isolated from probiotic products used in shrimp culture," PLOS ONE, p 10(7), 2015 [34] Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Thị Thu Hường, Trịnh Thị Thùy Linh,, "Khảo sát thành phần vi sinh đặc tính probiotic," Tạp chí Khoa học Phát triển, pp tập 12, số 1: 65-72, 2014 64 [35] Agersø, Y., Bjerre, K., Brockmann, E., Johansen, E., Nielsen, B., Siezen, R., … Zeidan, A A., "Putative antibiotic resistance genes present in extant Bacillus licheniformis and Bacillus paralicheniformis strains are probably intrinsic and part of the ancient resistome.," PLOS ONE, p 14(1), 2019 [36] C Reygaert, W., "An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria," AIMS Microbiology, pp 4(3), 482–501, 2018 [37] Roxana-Mădălina Stoica, Mișu Moscovici , Caterina Tomulescu, Angela Cășărică, Narcisa Băbeanu, Ovidiu Popa, Hatice Ahu Kahraman, "Antimicrobial compounds of the genus Bacillus: A review," Rom Biotechnol Lett, pp 24(6): 1111-1119, 2019 [38] Fuchs, S W., Jaskolla, T W., Bochmann, S., Kötter, P., Wichelhaus, T., Karas, M., … Entian, K.-D., "Entianin, a Novel Subtilin-Like Lantibiotic from Bacillus subtilis subsp.spizizeniiDSM 15029T with High Antimicrobial Activity," Applied and Enviromental Microbiology, pp 77(5), 1698-1707, 2011 [39] Nwagu, T N., Ugwuodo, C J., Onwosi, C O., Inyima, O., Uchendu, O C., & Akpuru, C , "Evaluation of the probiotic attributes of Bacillus strains isolated from traditional fermented African locust bean seeds (Parkia biglobosa), “daddawa.”," Annals of Microbiology , p 70(1), 2020 [40] "Quyết định :Ban hành “kế hoạch hành động quốc gia quản lý sử dụng kháng sinh phòng chống kháng kháng sinh sản xuất chăn nuôi nuôi trồng thủy sản giai đoạn 2017-2020” BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THƠN Số: 2625/QĐ-BNN-TY" [41] Trần Thị Bích Ngọc, Phạm Kim Đăng, Giải pháp thay kháng sinh thức ăn chăn nuôi, NXB Học viện Nông nghiệp , 2021 [42] PGS.TS Nguyễn Thị Xuyên, PGS TS Lương Ngọc Khuê,GS TS Trần Quỵ,GS.TS Hoàng Thị Kim Huyền, Hướng dẫn sử dụng kháng sinh, NXB Y học Hà Nội, 2015 [43] Bonnet, M., Lagier, J C., Raoult, D., & Khelaifia, S., "Bacterial culture through selective and non-selective conditions: the evolution of culture media in clinical microbiology," New Microbes and New Infections, p 100622, 2019 [44] Herman C Lichstein and Malcolm H Soule, , "Studies Of The Effect Of Sodium Azide On Microbic Growth And Respiration.," Received for publication June 19, 1943 65 [45] Luginbühl, M., Weinmann, W., & Al-Ahmad, A., "Introduction of sample tubes with sodium azide as a preservative for ethyl glucuronide in urine," International Journal of Legal Medicine, pp 131(5), 1283–1289, 2017 [46] Inderbir S Padda, Shivaraj Nagalli, "Cefotaxime," Treasure Island (FL):StatPearls, In: StatPearls [Internet], 2021 Jan 2021 Jul [47] LeFrock, J L., Prince, R A., & Left, R D., "Mechanism of action, antimicrobial activity, pharmacology, adverse effects, and clinical efficacy of cefotaxime.," Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy, pp 2(4), 174–184, 1982 [48] Silva, J.R Anacona and Gladys Da, "Synthesis and antibacterial activity of cefotaxime metal complexes," Journal of the Chilean Chemical Society, pp 447-450, 2005 [49] Mir, R A., Weppelmann, T A., Johnson, J A., Archer, D., Morris, J G., & Jeong, K C., "Identification and characterization of cefotaxime resistant bacteria in beef cattle," PLOS ONE, p 11(9), 2016 [50] Vinueza-Burgos, C., Ortega-Paredes, D., Narváez, C., De Zutter, L., & Zurita, J., "Characterization of cefotaxime resistant Escherichia coli isolated from broiler farms in Ecuador," PLOS ONE, p 14(4), 2019 [51] Adegoke, A A., Madu, C E., Aiyegoro, O A., Stenström, T A., & Okoh, A I., "Antibiogram and beta-lactamase genes among cefotaxime resistant E coli from wastewater treatment plant," Antimicrobial Resistance & Infection Control, p 9(1), 2020 [52] Dang, S T T., Bortolaia, V., Tran, N T., Le, H Q., & Dalsgaard, A., "Cephalosporin-resistant Escherichia coli isolated from farm workers and pigs in northern Vietnam," Tropical Medicine & International Health, pp 23(4), 415–424, 2018 [53] Duong Thi Quy Truong, Yaovi Mahuton Gildas Hounmanou , Son Thi Thanh Dang , John Elmerdahl Olsen , Giang Thi Huong Truong , Nhat Thi Tran , Flemming Scheutz , and Anders Dalsgaard, "Genetic comparison of ESBLproducing Escherichia coli from workers and pigs at Vietnamese pig farms," Antibiotics (Basel), p 10(10): 1165., 2021 Oct [54] Nguyễn Lân Dũng, Giáo trình vinh sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam, 2010 [55] "TCVN 8736:2011 Thuốc thú y – phương pháp định lượng tổng số bào tử Bacillus" [56] Patel, A K., Ahire, J J., Pawar, S P., Chaudhari, B L., & Chincholkar, S B., "Comparative accounts of probiotic characteristics of Bacillus spp 66 isolated from food wastes," Food Research International, pp 42(4), 505– 510, 2009 [57] "CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement (2011)." [58] "Clinical and Laboratory Standards Institude – CLSI,Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 9th ed Approved Standard M7-A9.Vol.32 No.2," 2012 [59] L.McKillip, John, "Selective medium for gram-positive bacteria," Pub No.: US 2002/0192741 A1, 2002 [60] Trần Nhật Phương, Trần Linh Thước, Phạm Hùng Vân, "Khảo sát chuyển gen đề kháng carbapenem từ Klebsiella pneumoniae sang Escherichia coli J53 đường tiếp hợp in vitro," Science & Technology Development, vol 19, pp No.T1-2016, 2016 [61] Leungtongkam, U., Thummeepak, R., Tasanapak, K., & Sitthisak, S., "Acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in association with conjugative plasmid or class integrons of Acinetobacter baumannii," PLOS ONE, p 13(12), 2018 [62] Mingmongkolchai S and Panbangred W., "In vitro evaluation of candidate Bacillus spp for animal feed," J Gen Appl Microbiol, pp 63 (2), 147-156, 2017 [63] Agwa O K., Uzoigwe C I and Wokoma E C., "Incidence and antibiotic sensitivity of Bacillus cereus isolated from ready to eat foods sold in some markets in Portharcourt, Rivers state, Nigeria," Asian Jr of Microbiol Biotech Env Sci, p 14 (1), 2012 [64] Bautista J R., and Teves F G., "Antibiotic susceptibility testing of isolated Bacillus thuringiensis from three soil types around Iligan City, Philippines," Afr J Microbiol Res, pp (8), 678-682, 2013 [65] Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Hữu Tâm, Trần Cát Đông, "Nghiên cứu đặc tính probiotic Bacillus Subtilis Bs02," Tạp chí y học thực hành, pp 21-25., 2014 [66] Marahier, M A., Nakano, M M., & Zuber, P., "Regulation of peptide antibiotic production in Bacillus," Molecular Microbiology, pp 7(5), 631– 636, 1993 [67] B Aslim, N Saglam, Y Beyatli., "Determination of some properties of Bacillus isolated from soil Turk," J Biol., pp 26, pp 41-48, 2002 67 [68] Toomey, N., Monaghan, A., Fanning, S., & Bolton, D., "Transfer of antibiotic resistance marker genes between lactic acid bacteria in model rumen and plant environments," Applied and Environmental Microbiology, pp 75(10), 3146–3152, 2009 68 PHỤ LỤC Bảng 5.1 Các chủng Bacillus có khả chịu axit STT Chủng Nguồn gốc phân lập phân lập CTY4 Phân gà Tiên Yên - Quảng Ninh Commented [24]: chỗ nên ghi rõ phân gà, CTY5 Phân gà Tiên Yên - Quảng Ninh Commented [25]: chỗ nên ghi rõ phân gà, CTY6 Phân gà Tiên Yên - Quảng Ninh Commented [26]: chỗ nên ghi rõ phân gà, CTY7 Phân gà Tiên Yên - Quảng Ninh Commented [27]: chỗ nên ghi rõ phân gà, CTY14 Phân gà Tiên Yên - Quảng Ninh Commented [28]: chỗ nên ghi rõ phân gà, CTY16 Phân gà Tiên Yên - Quảng Ninh Commented [29]: chỗ nên ghi rõ phân gà, CTY18 Phân gà Tiên Yên - Quảng Ninh Commented [30]: chỗ nên ghi rõ phân gà, CTY28 Phân gà Tiên Yên - Quảng Ninh Commented [31]: chỗ nên ghi rõ phân gà, CHL2 Phân gà Hồ Lai - Quảng Ninh 10 CHL6 Phân gà Hồ Lai - Quảng Ninh 11 CHL9 Phân gà Hồ Lai - Quảng Ninh 12 CHL13 Phân gà Hồ Lai - Quảng Ninh 13 CHL14 Phân gà Hồ Lai - Quảng Ninh 14 CHL15 Phân gà Hồ Lai - Quảng Ninh 15 CHL16 Phân gà Hồ Lai - Quảng Ninh 16 CQN2 Phân gà hộ chăn nuôi nông bộ-Gà Bắc Giang thả vườn-Quảng Ninh 17 CQN5 Phân gà hộ chăn nuôi nông bộ-Gà Bắc Giang thả vườn-Quảng Ninh 18 CQN6 Phân gà hộ chăn nuôi nông bộ-Gà Bắc Giang thả vườn-Quảng Ninh 19 CQN9 Phân gà hộ chăn nuôi nông bộ-Gà Bắc Giang thả vườn-Quảng Ninh 20 CQN10 Phân gà hộ chăn nuôi nông bộ-Gà Bắc Giang thả vườn-Quảng Ninh 69 21 CQN12 Phân gà hộ chăn nuôi nông bộ-Gà Bắc Giang thả vườn-Quảng Ninh 22 P1QN1 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 10kg/con-Quảng Ninh 23 P1QN3 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 10kg/con-Quảng Ninh 24 P1QN5 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 10kg/con-Quảng Ninh 25 P1QN8 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 10kg/con-Quảng Ninh 26 P1QN11 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 10kg/con-Quảng Ninh 27 P2QN1 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 50kg/con-Quảng Ninh 28 P2QN7 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 50kg/con-Quảng Ninh 29 P2QN9 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 50kg/con-Quảng Ninh 30 P2QN11 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 50kg/con-Quảng Ninh 31 P3QN2 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 90kg/con-Quảng Ninh 32 P3QN4 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 90kg/con-Quảng Ninh 33 P3QN6 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 90kg/con-Quảng Ninh 34 P3QN10 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 90kg/con-Quảng Ninh 35 P3QN12 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 90kg/con-Quảng Ninh 36 P3QN14 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-giống lợn lai 90kg/con-Quảng Ninh 70 37 P4QN2 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-1.5 tháng 20kg -Quảng Ninh 38 P4QN4 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-1.5 tháng 20kg -Quảng Ninh 39 P4QN5 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-1.5 tháng 20kg -Quảng Ninh 40 P4QN11 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-1.5 tháng 20kg -Quảng Ninh 41 P4QN13 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-1.5 tháng 20kg -Quảng Ninh 42 P5QN4 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-3 tháng 60kg -Quảng Ninh 43 P5QN6 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-3 tháng 60kg -Quảng Ninh 44 P5QN7 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-3 tháng 60kg -Quảng Ninh 45 P5QN10 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-3 tháng 60kg -Quảng Ninh 46 P5QN11 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-3 tháng 60kg -Quảng Ninh 47 P5QN12 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-3 tháng 60kg -Quảng Ninh 48 P5QN13 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-3 tháng 60kg -Quảng Ninh 49 P6QN2 Phân lợn trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ)-1 năm 130kg -Quảng Ninh 50 PHN2 Phân lợn hộ chăn ni nơng hộ-Sử dụng chế phẩm phịng CN lên men-Lợn trại Anh Hà - Cầu Rau, thôn Xã Phú Cát Huyện Quốc Oai Hà Nội 51 PHN3 Phân lợn hộ chăn nuôi nông hộ-Sử dụng chế phẩm phòng CN lên men-Lợn trại Anh Hà - Cầu Rau, thôn Xã Phú Cát Huyện Quốc Oai Hà Nội 71 52 Phân lợn hộ chăn nuôi nơng hộ-Sử dụng chế phẩm PHN4 phịng CN lên men-Lợn trại Anh Hà - Cầu Rau, thôn Xã Phú Cát Huyện Quốc Oai Hà Nội Bảng 5.2 Kết trung bình đo đường kính vịng vơ khuẩn (mm) kháng sinh Bacillus sp No Species GE N TE K RI E CM AMX AMP CIP S C FO X AK CTY6 21,0 21,7 17,7 17,0 23,0 21,0 12,3 9,3 26,7 20,0 22,5 10,0 21,0 CTY7 27,3 20,0 30,7 25,3 24,7 27,0 29,0 27,7 36,7 28,7 29,0 26,0 26,3 CTY14 22,0 19,3 19,7 18,0 21,0 20,0 10,7 13,0 26,3 19,7 20,7 9,7 23,0 CTY16 21,5 21,3 17,7 15,7 20,3 17,7 10,3 8,5 24,3 18,0 20,0 9,0 19,7 CTY18 19,0 20,7 20,0 17,3 20,3 17,7 11,0 10,7 23,3 23,0 21,0 9,7 15,7 CTY28 25,7 28,5 21,5 19,7 25,0 18,5 9,7 13,7 24,5 18,0 23,7 11,0 26,0 CHL2 20,5 22,7 19,5 20,3 27,0 23,7 17,0 17,0 28,0 19,0 21,0 14,7 18,7 CHL6 22,0 23,7 20,0 17,0 25,3 23,3 13,0 11,0 30,7 20,0 22,7 12,3 24,0 CHL14 20,3 22,0 20,0 17,0 20,3 20,3 10,3 9,0 26,3 18,0 20,3 8,7 20,7 10 CHL15 19,7 20,5 19,0 17,7 22,3 19,0 11,3 10,0 27,0 20,3 20,0 10,0 20,7 11 CHL16 27,3 16,7 26,0 20,3 22,7 20,0 23,3 24,0 32,0 21,0 24,0 26,3 27,7 12 CQN5 24,0 22,0 21,7 17,0 19,7 21,0 12,7 10,0 25,7 20,0 24,0 12,3 23,7 13 CQN6 31,3 26,7 34,7 25,7 31,0 28,0 27,0 29,0 39,7 27,3 32,0 18,7 28,7 14 CQN10 23,0 22,3 22,0 18,7 23,0 22,3 13,3 11,0 29,3 20,7 24,0 11,0 15,3 15 P1QN3 24,3 20,0 22,0 22,3 22,7 20,7 17,3 16,7 31,0 27,7 24,0 15,3 24,7 16 P2QN1 21,3 21,5 19,7 17,0 20,7 22,3 12,0 10,5 28,0 18,7 21,3 9,3 21,3 17 P2QN7 19,0 20,0 19,3 16,3 20,3 19,0 11,7 8,3 24,3 20,7 20,7 11,3 20,7 18 P3QN6 20,3 22,3 19,7 18,0 22,0 22,0 12,0 8,3 26,7 19,7 20,0 9,3 20,7 19 P3QN4 20,7 22,3 19,0 17,0 18,3 21,7 10,5 10,0 24,7 19,0 20,0 9,0 21,3 20 P3QN10 23,7 22,0 19,3 15,7 25,7 23,7 12,0 10,0 26,0 19,7 19,7 10,7 15,7 21 P3QN12 22,5 21,0 19,0 16,7 19,3 19,0 11,0 10,5 27,7 18,7 17,0 9,3 18,7 22 P4QN2 23,3 18,7 26,7 25,3 27,7 23,7 25,0 27,7 32,3 28,3 28,3 23,0 30,7 23 P4QN5 22,0 21,3 19,3 19,0 21,3 20,7 11,0 9,3 26,7 25,3 22,3 11,7 19,7 24 P4QN11 22,0 21,5 22,5 23,0 23,3 20,3 16,3 14,3 28,0 20,0 24,3 15,7 21,7 25 P4QN13 28,0 21,7 28,0 27,3 30,0 23,0 28,0 28,3 36,0 28,3 28,3 26,0 27,0 26 P5QN4 37,3 21,5 38,3 21,3 28,7 20,7 24,3 29,3 41,3 21,3 27,7 26,7 21,7 27 P5QN6 29,0 16,5 30,0 23,3 27,3 22,0 26,3 27,3 36,7 28,3 28,3 22,0 27,7 28 P5QN7 24,7 21,7 21,5 18,7 26,3 24,0 12,0 16,3 31,7 21,3 23,0 16,3 26,7 29 P5QN11 22,7 21,3 26,0 21,3 22,0 19,0 13,7 11,0 26,3 26,7 26,0 15,3 22,7 30 P5QN12 27,3 23,3 21,0 16,3 15,3 22,0 10,7 11,3 28,7 31,3 24,0 14,3 27,3 31 P5QN13 29,0 15,7 31,0 22,0 24,3 20,0 26,0 25,3 33,5 28,0 20,0 21,7 28,7 32 P6QN2 31,0 17,3 28,3 23,7 27,7 21,3 29,7 28,0 35,0 30,0 28,7 23,3 27,3 33 PHN4 22,5 21,3 18,7 17,0 20,7 20,7 10,3 9,3 27,3 14,7 19,3 8,7 15,0 Với GEN: Gentamicin, TE: Tetracycline, K: Kanamycin, RI: Rifampicin, E: Erythromycin, CM: Clindamycin, AMX: Amoxicillin, AMP: Ampicillin, 72 CIP: Ciprofloxacin, S: Streptomycin, C: Chloramphenicol, FOX: Cefoxitin, AK: Amikacin (Đường kính vịng vơ khuẩn bao gồm đường kính đĩa kháng sinh (6mm)) (P