Phân lập, định danh và khảo sát khả năng sinh trưởng của loài nấm có hoạt tính kháng khuẩn pycnoporus sp trên cơ chất rắn

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: Phân lập, định danh và khảo sát khả sinh trƣởng loài nấm có hoạt tính kháng khuẩn Pycnoporus sp chất rắn Số hợp đồng: 2020.01.008 Chủ nhiệm đề tài: Ngô Nguyên Vũ Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: tháng (03/2020 - 9/2020) TP Hồ Chí Minh, ngày 21 tháng năm 2020 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc - Đơn vị chủ trì: Trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: Phân lập, định danh và khảo sát khả sinh trƣởng loài nấm có hoạt tính kháng khuẩn Pycnoporus sp chất rắn Số hợp đồng: 2020.01.008 Chủ nhiệm đề tài: Ngô Nguyên Vũ Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: tháng (03/2020 – 09/2020) Các thành viên phối hợp cộng tác: STT Họ tên Ngô Nguyên Vũ Cơ quan công tác Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Ký tên MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng sinh và vi khuẩn kháng kháng sinh 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn các hợp chất sản xuất t nấm 1.3 Sơ lƣợc các loài nấm thuộc chi Pycnoporus 1.4 Sàng lọc và sản xuất chất có hoạt tính kháng khuẩn t nấm hoại g CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Sàng lọc m u nấm ng xác định h nh thái và th nghiệm sinh hóa quả th 2.2.2 Phân lập d ng thu n tơ nấm t m u quả th tƣơi 2.2.3 Định danh loài nấm ng phƣơng pháp sinh học phân t 2.2.4 Khảo sát nhu c u dinh dƣ ng m u nấm phân lập 10 2.2.5 Th nghiệm nuôi cấy tạo sinh khối nấm chất rắn 10 2.2.6 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chi t sinh khối nấm dung môi h u 11 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12 3.1 Mô tả đ c m h nh thái m u nấm phân lập 12 3.2 Định danh loài nấm ng phƣơng pháp sinh học phân t 14 3.3 Khảo sát tốc độ sinh trƣởng tơ nấm môi trƣờng thạch dinh dƣ ng 16 3.4 Khảo sát tốc độ sinh trƣởng tơ nấm môi trƣờng thạch dinh dƣ ng 19 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn cao chi t sinh khối nấm dung môi h u 19 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 21 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT T n v t tắt Tên ầ ủ IDSA : Industrial Designers Society of America PDA : Potato dextrose agar TSA : Tryptic soy agar WHO : Tổ chức Y t Th giới - World Health Organization iv DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hn Sơ lƣợc lịch s tƣợng kháng kháng sinh các loại vi sinh vật k m với các th hệ kháng sinh xuất theo thời gian (Nguồn: UK Research and Innovation) Hn Một số loài nấm mục g có khả sản xuất hợp chất với hoạt tính kháng khuẩn mạnh đ đƣợc phát và nghiên cứu (1a : Pseudoplectania nigrella (Nguồn: Michael Wood (1 : Clitopilus passeckerianus (Nguồn: Det H ender (1c : Sparassis crispa (Nguồn: Michael Wood Fred Stevens (1d : Coprinus quadrifidus (Nguồn: Jim Frink) Hn Một số loài nấm tiêu i u thuộc chi Pycnoporus 2a: Pycnoporus sanguineus, : Pycnoporus cinna arinus, 2c: Pycnoporus puniceus, 2d: Pycnoporus coccineus (Nguồn: T llez-Téllez M [20]) Hn Một số đ c m h nh thái khác m u nấm Pycnoporus spp (1a : M t cắt ngang quả th (1 : Sợi tơ nấm dƣới kính hi n vi x (1c : ào t nấm dƣới kính hi n vi 40x Hn K t quả sequencing v ng ITS m u nấm phân lập đƣợc thực ởi công ty Macrogen (Hàn Quốc) Hn So sánh Tốc độ phát tri n chủng Pycnoporus sanguineus các loại thạch môi trƣờng khác Hn H nh thái tơ nấm Pycnoporus sanguineus các môi trƣờng dinh dƣ ng khác sau ngày phát tri n : Môi trƣờng Malt extract agar : Môi trƣờng PD ổ sung cao nấm men C: Môi trƣờng Czapez D: Môi trƣờng Sa oraugh E: Môi trƣờng Glucose F: Môi trƣờng PD không cao nấm men Hn 5: So sánh Tốc độ phát tri n chủng Pycnoporus sanguineus các nồng độ đƣờng Glucose khác Hn So sánh Tốc độ phát tri n chủng Pycnoporus sanguineus các t lệ phối trộn chất rắn khác H n 3.7: Nuôi cấy Pycnoporus sanguineus chất thóc đ h nh thành sinh khối có sắc tố v DANH MỤC C C ẢNG I U ảng Các đ c m h nh thái m u nấm thu thập thuộc chi Pycnoporus ảng Tốc độ phát tri n tơ nấm Pycnoporus sanguineus các loại thạch môi trƣờng (đơn vị: mm ảng Tốc độ phát tri n chủng Pycnoporus sanguineus các loại thạch glucose với nồng độ khác Đơn vị: mm ảng 4: K t quả th nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cao chi t nấm Pycnoporus sanguineus ng phƣơng pháp d a giấy kháng sinh loại vi khuẩn vi TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU STT K t quà ạt ƣợc Công việc thực T m và thu thập m u nấm Pycnoporus Thu thập đƣợc m u tai nấm có khả mọc hoang dại khu vực miền Nam cao thuộc chi Pycnoporus với các đ c Việt Nam m h nh thái tr ng khớp với mô tả Phân lập d ng thu n và lƣu tr m u Phân lập và cấy truyền thành công nấm ph ng thí nghiệm t th chủng nấm Pycnoporus điều kiện quả thu đƣợc Chủng nấm đƣợc định ph ng thí nghiệm K t quả định danh danh loài ng phƣơng pháp pcr và ng phƣơng pháp giải tr nh tự v ng giải tr nh tự v ng Internal transcri ed Internal transcribed spacer (ITS) cho thấy m u nấm thuộc loài Pycnoporus spacer (ITS) sanguineus Nuôi cấy chủng nấm giá th rắn Chủng nấm Pycnoporus sanguineus đ phát tri n sinh khối tơ nấm Thu phát tri n rất tốt điều kiện chất sinh khối tơ nấm và ti n hành tách rắn có t lệ Hydrocar on cao và độ ấm chi t các hợp chất kháng khuẩn dung môi h u ng , tạo sinh khối nhanh thời gian ngắn Cao chi t đƣợc chi t t ph n sinh khối nấm có sắc tố đ ng dung môi Methanol và đƣợc cô quay độ C Xác định hoạt tính kháng khuẩn Cao chi t có hoạt tính kháng khuẩn phổ dịch chi t tơ nấm ng phƣơng pháp rộng chủng khuẩn gram dƣơng đ a giấy kháng sinh và MIC ao gồm Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus và Streptococcus pyogenes và các chủng vi khuẩn gram âm Pseudomonas Escherichia coli aeruginosa, và Vibrio parahaemolyticus STT X lý số liệu soạn bản thảo Sản phẩm ạt ƣợc Sản phẩm ã ăng ký Quy tr nh nuôi cấy nấm Pycnoporus Quy tr nh nuôi cấy nấm Pycnoporus trên giá th rắn có sinh chất kháng giá th rắn có sinh chất kháng khuẩn vii khuẩn ài áo đăng Tạp chí khoa ài áo đăng Tạp chí khoa học học cơng nghệ đại học Ngũn Tất Thành Thời gian thực hiện: 03/2020 – 09/2020 Thời gian nộp báo cáo: 21-08-2020 viii công nghệ đại học Nguyễn Tất Thành MỞ ĐẦU Nấm có th đƣợc coi nh ng đối tƣợng đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất giới khoa học v nh ng đ c m phi thƣờng hành vi phức tạp ch ng có th đƣợc tận dụng và khai thác nhiều l nh vực khác Thành tựu lớn nhất ngành công nghệ sinh học nấm là khám phá kháng sinh, và đ đ t móng cho các phƣơng pháp trị liệu chống lại các ệnh nhiễm tr ng vi sinh vật vốn đƣợc coi là hi m ngh o tại thời k đó Tuy nhiên, đời kháng sinh đ n ngƣời chủ quan và lạm dụng các phác đồ điều trị ệnh nhiễm tr ng b ng kháng sinh cách khá a i Điều này đ d n đ n hậu quả các d ng vi khuẩn có ch kháng thuốc d n d n xuất hiện, th c đẩy việc t m các loại kháng sinh thay th cho các loại kháng sinh đ và mất tác dụng cho đ n thời m tại ên cạnh kháng sinh sản xuất ởi các loài nấm thuộc các thuộc ngành Zygomycota và chung nấm mốc), nấm thuộc ngành scomycota (thƣờng đƣợc gọi asidiomycota (Nấm Đảm cũng có th sản xuất đƣợc nhiều loại kháng sinh khác Các loài nấm hoại g t ngành asidiomycota có th ứng c viên tiềm việc tìm ki m các loại kháng sinh mới, với nhiều loài số ch ng đ đƣợc phát có khả tổng hợp loạt hợp chất chống vi r t, kháng khuẩn và chống ung thƣ Pycnoporus chi nấm thuộc họ Polyporaceae, ngành scomycota, và thuộc nhóm nấm mục g trắng (white rot fungi Các loài nấm thuộc chi Pycnoporus có th đƣợc t m thấy thân g ho c các ph n g mục tại các khu vực nhiệt đới ẩm nhiều nơi toàn th giới Nhiều nghiên cứu đ chứng minh sắc tố đ các loài nấm Pycnoporus sp có thành ph n chính ao gồm các hợp chất cinna arin, cinna arinic acid và tramesanguin, các hợp chất này th hoạt tính chống oxy hóa, khả tẩy gốc tự do, kháng nấm, kháng ung thƣ, tính điều hòa miễn dịch, kháng khuẩn, hoạt tính chống viêm Hoạt tính kháng khuẩn các loài nấm Pycnoporus đ đƣợc nhiều nghiên cứu ti n hành t m hi u với khả ức ch đƣợc nhiều loại vi khuẩn khác nhau, ao gồm Bacillus subtilis, Burkholderia unamae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus và Streptococcus agalactiae Tuy nhiên cho đ n v n chƣa có nghiên cứu nào thật sâu vào khai thác khả sản xuất kháng sinh các loài nấm này, cũng nhƣ chƣa có đánh giá cụ th tiềm kháng khuẩn ch ng tại Việt Nam Việc đánh giá tiềm kháng khuẩn và khả phát tri n các loài nấm thuộc chi Pycnoporus này điều kiện nuôi cấy nhân tạo có th tạo tiền đề phát tri n các loại kháng sinh sản xuất t loài nấm này tƣơng lai CHƢƠNG 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU s n v k uẩn k k s n Kháng sinh tên gọi chung hợp chất có th ki m sốt, ngăn ch n ho c ức ch hoàn toàn phát tri n, thậm chí tiêu diệt loại vi sinh vật và kí sinh tr ng có hại cho th vật chủ [1] M c d định ngh a đ u tiên hợp chất kháng khuẩn và kháng sinh đ đƣợc s dụng t nh ng năm 164 , việc phát kháng sinh đ u tiên penicillin t nấm mốc Penicillium chrysogenum và ứng dụng nó các phát đồ điều trị nhiễm khuẩn đƣợc coi thành tựu v đại nhất xuyên suốt lịch s ngành công nghệ sinh học nấm [2] K t penicillin đời, th hệ kháng sinh và hợp chất chống nhiễm tr ng th hệ ti p theo đ đƣợc phát tri n cải ti n vài thập kỷ đ đối phó với các loại ệnh gây ởi các loại vi khuẩn khác Sau Alexander Fleming phát Penicillin đ u tiên vào năm 1928, quá tr nh sản xuất penicillin t nấm mốc Penicillium đ đƣợc đẩy mạnh vào nh ng năm 194 và t thời m đó kháng sinh đƣợc phân phối vô c ng rộng r i ệnh viện và các sở y t toàn th giới [3 Thành tựu ti p theo d ng lịch s phát tri n kháng sinh khám phá streptomycin t vi khuẩn Streptomyces đƣợc phân lập t đất Nhiều loại thuốc kháng sinh nối ti p đƣợc sản xuất có nguồn gốc t Streptomyces, bao gồm Streptomycin t Streptomyces griseus, Erythromycin t Streptomyces erythreus, Tetracycline Streptomyces aureofaciens sản xuất, Vancomycin t Streptomyces orientalis sản xuất [4][5][6][7] Các th hệ kháng sinh sau này đ có tác động tích cực điều trị và giảm thi u đáng k t lệ t vong bệnh nhiễm tr ng vi sinh vật gây [3 Tuy nhiên sau đó kháng sinh đ ị lạm dụng và đƣợc s dụng ất cẩn thời gian dài n các loài vi sinh vật gây ệnh d n d n thích nghi với chúng, sinh th hệ sinh vật kháng thuốc [8] Vấn đề vi sinh vật kháng kháng sinh không phải vấn đề có th giải quy t cách đơn giản, chủng vi sinh vật kháng thuốc thƣờng đ n t nhiều nguồn gốc khác Việc lạm dụng kháng sinh a i ti n hành biện pháp điều trị bệnh nhiễm tr ng đƣợc coi nh ng nguồn làm cho vi sinh vật kháng kháng sinh xuất [8] Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu có b ng chứng chứng minh r ng nƣớc thải công nghiệp cũng có th nguồn cho chủng vi khuẩn kháng thuốc xuất và lan truyền môi trƣờng [9 Do việc s dụng kháng sinh a i, lƣợng lớn thuốc kháng sinh đƣợc thải môi trƣờng theo nhiều đƣờng khác nhau, bao gồm chất thải dƣợc phẩm chất thải chăn nuôi công nghiệp [10] Sự xuất kháng sinh nƣớc thải cũng đẩy nhanh quá tr nh chọn lọc tạo chủng vi sinh vật kháng kháng sinh mới, mang đ n hi m họa bệnh nhiễm tr ng kháng thuốc nguy hi m tƣơng lai định loài nấm này chuộng thành ph n dinh dƣ ng với nguồn car on là tinh ột và cao nấm men có th s dụng nhƣ nguồn nitrogen ổ sung Hoạt t n k k uẩn cao c tsn k nấm ung mô u Đ thu đƣợc sinh khối có hoạt tính kháng khuẩn, m u tơ nấm đƣợc cấy vào các ịch chất phối trộn 5 m n cƣa, độ ẩm thóc và Các ịch chất đƣợc ủ tối ngày cho đ n tơ nấm phủ kín chất, sau đó đƣợc mở miệng ịch và đƣa sáng ngày ti p theo đ th c đẩy phát tri n sinh khối tiền quả th và h nh thành sắc tố Sau tháng, ph n sinh khối nấm đƣợc tách kh i chất và chi t xuất ng dung môi Methanol Ph n cao chiê t đƣợc h a vào DMSO và đƣợc s dụng cho thí nghiệm ki m tra hoạt tính kháng khuẩn K t quả v ng kháng khuẩn t cao chi t sinh khối nấm đƣợc tr nh ày ảng H n ịc c ất nuô cấ Pycnoporus sanguineus s n u n us ảng t t sn n mm n s t n t n s u ng ệm oạt t n k k uẩn cao c p áp a g ấ k s n tr n Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Staphylococcus aureus ATCC 29213 Escherichia coli ATCC 25922 Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ƣớc đ u th nghiệm ts u t n p t n m t tr n tr n t nấm Pycnoporus sanguineus noporus t ng p ƣơng c ủng v k uẩn Gram Đƣờng k n v ng k k uẩn (mm + + + - 16.8 ± 0.74 17.3 ± 2.51 23.5 ± 0.50 10.0 ± 0.00 14.0 ± 1.12 13.3 ± 0.57 ng phƣơng pháp tẩm d a giấy cho thấy cao chi t nấm Pycnoporus sanguineus th hoạt tính kháng khuẩn chống lại cả loài khuẩn s dụng thí nghiệm này Đ c iệt hoạt tính Pycnoporus sanguineus có hiệu quả diệt khuẩn chống lại các chủng vi khuẩn Gram dƣơng tốt vi khuẩn Gram âm, với Staphylococcus aureus nhạy cảm nhất nhóm Gram dƣơng, và Escherichia coli có sức chống chịu cao chi t nấm nhất nhóm Gram âm K t quả th nghiệm hoạt tính kháng khuẩn dịch chi t tơ nấm Pycnoporus sanguineus cho thấy quy tr nh nuôi cấy loài nấm này chất thóc v n ảo tồn khả sinh hoạt chất kháng khuẩn ch ng cho d chƣa đ n thời m h nh thành quả th Do đó có th k t luận hoạt tính kháng khuẩn 34 loài nấm này phụ thuộc rất nhiều vào khả sản xuất sắc tố ch ng, đại diện cho màu đ cam đ c trƣng quả th KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ IV Nh n chung quá tr nh nghiên cứu nấm có hoạt tính kháng khuẩn, phƣơng pháp phổ bi n đ xác định hoạt tính chúng chi t xuất quả th dung mơi thích hợp đ thu cao chi t tổng Trong số trƣờng hợp, phƣơng pháp này không th thực đƣợc, đ c iệt các nghiên cứu nh ng loài nấm hoang dại tự nhiên chƣa có nhiều thông tin ch ng Nguyên nhân chủ y u đ n t việc quả th nấm thu thập t môi trƣờng sống tự nhiên có kích thƣớc trọng lƣợng tƣơng đối nh Lƣợng m u thu đƣợc có th khơng đủ cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dài hạn Vấn đề có th đƣợc giải quy t b ng cách phân lập m u nấm nuôi cấy sở nghiên cứu Tuy nhiên, nhiều loài nấm hoại g có tốc độ phát tri n chậm thời gian hình thành quả th tƣơng đối lâu Tồn quy trình t ƣớc đ u tiên lấy m u nấm đ nuôi cấy sợi nấm cho đ n quả th hình thành hồn ch nh tốn rất nhiều thời gian công sức, khả sản sinh chất kháng khuẩn loại nấm đó v n chƣa đƣợc bi t rõ Loài nấm Pycnoporus sanguineus chủng nấm có hoạt tính phổ rộng, với khả ức ch cả loài vi khuẩn Gram dƣơng và loài Gram âm thực đề tài này Loài nấm Pycnoporus sanguineus đ đƣợc nghiên cứu có khả sản xuất nhiều hợp chất hoạt tính khác với nhiều ứng dụng tiềm nhƣ men laccase, các hợp chất chống oxy hóa, Cinnabarine có hoạt tính kháng kh̉n và thậm chí là kháng viêm [4, 5] Nghiên cứu đƣợc thực Smânia năm 1995 đ có ng chứng chi t xuất cao nấm Pycnoporus sanguineus có chứa các hợp chất kháng khuẩn với khả ức ch E coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, vi khuẩn thuộc nhóm Streptococci, tƣơng tự với d liệu thu đƣợc t đề tài này Nghiên cứu này đ thành công việc phân lập, định danh, nuôi cấy và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn loài nâ m này, tạo tiền đề đ ti n hành các nghiên cứu sâu tiềm sản xuất kháng sinh t Pycnoporus sanguineus tƣơng lai TÀI LIỆU TH M KHẢO: Téllez-Téllez M, Villegas E3, Rodríguez A, Acosta-Urdapilleta ML, O’Donovan , Díaz-Godínez G (2016) Mycosphere Essay 11: Fungi of Pycnoporus: Morphological and molecular identification, worldwide distribution and biotechnological potential Mycosphera 7.10.5943 Matuschek E, Brown DF, Kahlmeter G (2014) Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories Clin Microbiol Infect 2014 Apr;20(4):O255-66 Suay I, Arenal F, Asensio FJ, Basilio A, Cabello MA, Díez MT, García JB, del Val AG, Gorrochategui J, Hernández P, Peláez F, Vicente MF 2000 Screening of basidiomycetes for antimicrobial activities Antonie Van Leeuwenhoek 2000 Aug;78(2):129-39 Smânia EF, Smaünia A, Loguercio-Leite C (1997) Optimal parameters for cinnabarin synthesis by Pycnoporus sanguineus Journal of Chemical Technology & Biotechnology 70, 57–59 Kuang LM, Lin HO, Hsu FL, Lin YL (2010) Anti-inflammatory principles of cultivated Pycnoporus sanguineus Journal Chinese Medical 21, 75–83 35 PHỤ LỤC 4: (hợp ồng, thuy t m n 36 cƣơng 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 ... vi sinh vật gây ệnh d n d n thích nghi với chúng, sinh th hệ sinh vật kháng thuốc [8] Vấn đề vi sinh vật kháng kháng sinh không phải vấn đề có th giải quy t cách đơn giản, chủng vi sinh. .. vật kháng thuốc thƣờng đ n t nhiều nguồn gốc khác Việc lạm dụng kháng sinh a i ti n hành biện pháp điều trị bệnh nhiễm tr ng đƣợc coi nh ng nguồn làm cho vi sinh vật kháng kháng sinh xuất... CHƢƠNG ẾT LUẬN VÀ Nh n chung, loài nấm đ IẾN NGHỊ i t có khả sản sinh hợp chất kháng khuẩn, phƣơng pháp phổ bi n đ xác định hoạt tính chúng chi t xuất quả th ho c các phân đoạn mô