Xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết một vài loài nấm lớn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH 664 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP- TỰ DO- HẠNH PHÚC - NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Thắm Số hiệu sinh viên: 0952040399 Khóa: 50 Ngành: Cơng nghệ hóa thực phẩm Tên đề tài: ‘‘Xác định hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết vài lồi nấm lớn” Nội dung nghiên cứu - Lý thuyết chung nấm - Lý thuyết chung hoạt tính chống oxi hóa - Xác định tổng hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn - Xác định hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn Họ tên cán hƣớng dẫn : PGS.TS Nguyễn Hoa Du Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2013 Ngày hoàn thành đồ án : Ngày tháng năm 2013 Ngày tháng năm 2014 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP- TỰ DO- HẠNH PHÚC - BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Thắm Số hiệu sinh viên: 0952040399 Khóa: 50 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hoa Du Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2014 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP- TỰ DO- HẠNH PHÚC - BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Thắm Số hiệu sinh viên: 0952040399 Khóa: 50 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hoa Du Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2014 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) iii LỜI CẢM ƠN Đồ án đƣợc hồn thành phịng Trung tâm phân tích chuyển giao công nghệ Thực phẩm -Môi trƣờng, trƣờng ĐH Vinh Để hoàn thành đƣợc đồ án này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo PGS.TS Nguyễn Hoa Du giao đề tài, hết lòng hƣớng dẫn, bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em suốt q trình hồn thành đồ án Em xin xin bày tỏ lòng biết ơn: - Các kỹ thuật viên Trung tâm, cô Ngô Thị Thủy Hà cô Chu Thị Thanh Lâm giúp đỡ tạo điều kiện sử dụng máy móc thiết bị nghiên cứu - Thầy giáo PGS.TS Trần Đình Thắng, cô giáo – Trịnh Thị Thanh Hà thầy giáo bạn hết lịng tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đồ án Tuy nhiên, đồ án chắn nhiều thiếu sót nên em mong q thầy bạn góp ý để em hồn thiện đồ án học hỏi, rút kinh nghiệm cho công tác nghiên cứu sau Cuối cùng, lần em xin gửi đến tất ngƣời quan tâm, giúp đỡ em hoàn thành đồ án lời cảm ơn chân thành ! Vinh, tháng 01 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Thắm iv TÓM TẮT Mẫu nấm lớn đƣợc lấy vƣờn quốc gia Phong Nha – Kẽ Bàng thuộc huyện Bố Trạch, Minh Hóa, tỉnh Quảng Bình, cách thành phố Đồng Hới khoảng 50 km phía Tây Bắc, cách thủ Hà Nội khoảng 500 km phía nam Hoạt tính chống oxi hóa sử dụng ABTS đƣợc thực theo phƣơng pháp Arnao et al (2001) Hỗn hợp dung dịch chuẩn bao gồm mM ABTS 2.6 mM Kali persulphate, trộn nguyên liệu hai lƣợng cho phép chúng phản ứng 12 nhiệt độ phịng bóng tối Hỗn hợp dung dịch làm việc đƣợc pha loãng cách trộn 1ml ABTS dung dịch chuẩn sử dụng 45 ml methanol, để có đƣợc hấp thụ 1,1 ± 0,02 đơn vị 734 nm Mẫu pha loãng (1ml) đƣợc trộn với 2.850 ml dung dịch ABTS làm việc hỗn hợp đƣợc để nhiệt độ phịng bóng tối Độ hấp thụ sau đƣợc đo bƣớc sóng 734 nm, đƣợc xác định phƣơng pháp quang phổ Kết xác định đƣợc hàm lƣợng hợp chất chống oxi hóa chiết xuất methanol mẫu nấm 03 cao 3,247 mg/g, chiết xuất nƣớc mẫu nấm 03: 2,873 mg/g chiết xuất methanol mẫu nấm 01: 1,332 mg/g; Còn chiết xuất nƣớc mẫu nấm 01 thấp 1,326 mg/g.Tƣơng tự, hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính chống oxi hóa chiết xuất methanol mẫu nấm 03 cao 72,54%, chiết xuất nƣớc mẫu nấm 03: 71,05% chiết xuất methanol mẫu nấm 01: 58,22% chiết xuất nƣớc mẫu nấm 01 thấp với 41,25% Từ kết ta nhận thấy hợp chất chống oxi hóa hịa tan tốt methanol hoạt tính chống oxi hóa tỉ lệ thuận với hàm lƣợng chúng v MỤC LỤC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP i BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ii BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP iii LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT v DANH MỤC HÌNH VẼ viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ix MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát nấm lớn 1.2 Đặc điểm sinh học 1.3 Thành phần hóa học 1.3.1 Chất đạm 1.3.2 Chất béo 1.3.3 Chất xơ 1.3.4 Vitamin khoáng chất 1.4 Giá trị dinh dƣỡng 1.5 Giá trị dƣợc liệu 1.6 Hoạt tính chống oxi hóa [3] 1.6.1 Cơ chế chống oxi hóa 1.6.2 Các gốc tự [3] 1.6.3 Chất chống oxi hóa 10 1.6.4 Một số chất chống oxi hóa 11 1.6.4.1 Các hợp chất phenolic 11 1.6.4.2 Vitamin C 14 1.6.4.3 Vitamin E 15 1.6.4.4 Carotenoid [4] 17 1.6.5 Một số phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 18 1.6.5.1 Phƣơng pháp DPPH [12] 18 1.6.5.2 Phƣơng pháp ABTS [17] 18 Hoạt tính khử gốc tự ABTS(%): 19 vi 1.6.5.3 Phƣơng pháp FRAP [28] 19 1.6.5.4 Phƣơng pháp TRAP 19 1.6.5.5 Phƣơng pháp ORAC 19 1.7 Đánh giá kết phân tích [6] 20 1.7.1 Phƣơng pháp xử lý kết phân tích 20 1.7.2 Phƣơng pháp thống kê xử lý đƣờng chuẩn 21 CHƢƠNG KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 23 2.1 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 23 2.1.1 Dụng cụ, thiết bị 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Pha chế dung dịch 24 2.1.3.1 Thuốc thử ABTS: 7mM 24 2.1.3.2 Kali persulfat ( K2S2O8 ) : 2,6 mM 24 2.1.3.3 Dung dịch chuẩn : BHT ( butylat hydroxytoluen) C15H24O 24 2.1.3.4 Methanol 80% 25 2.1.4 Xử lý mẫu 25 2.1.4.1 Chuẩn bị mẫu 25 2.1.4.2 Chiết 26 2.1.5 Xác định hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Xác định hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm 29 3.1.1 Xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ BHT 29 3.1.1.1 Đƣờng chuẩn methanol 29 3.1.1.2 Đƣờng chuẩn nƣớc 31 3.1.2 Hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn 33 3.1.3 Kết xác định hoạt tính oxi hóa trong dịch chiết nấm lớn phƣơng pháp trắc quang 34 3.1.3.1 Hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết methanol 34 3.1.3.2 Hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nƣớc 38 3.1.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn methanol 42 3.1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn nƣớc 43 3.1.4 Nhận xét kết 43 3.2 So sánh với số kết nghiên cứu hợp chất chống oxi hóa loại dung mơi khác tác giả khác 44 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Một số hợp chất phenolic nấm 12 Hình 1.2: Vitamin C 15 Hình 1.3: Vitamin E 16 Hình 2.1 Máy sấy đơng khơ 25 Hình 2.2 Quá trình chiết với dung môi nƣớc 26 Hình 2.3 Quá trình chiết với dung môi methnol 26 Hình 2.4 Quy trình đo hoạt tính chống oxi hóa phƣơng pháp ABTS 28 Hình 3.1 Phổ UV -ViS mẫu chuẩn BHT methanol nồng độ (mM) 29 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ BHT methanol (l = 1,0cm, λ = 734 nm) 30 Hình 3.3 Phổ UV -ViS mẫu chuẩn BHT nƣớc nồng độ (mM): 31 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ BHT nƣớc (l = 1,0cm, λ = 734 nm) 32 Hình 3.5 Phổ UV -ViS dịch chiết nấm 01 methanol λ= 734 nm 34 Hình 3.6 Phổ UV -ViS dịch chiết nấm 03 methanol λ= 734 nm 36 Hình 3.7 Phổ UV -ViS dịch chiết nấm 01 nƣớctại λ= 734 nm 38 Hình 3.8 Phổ UV -ViS dịch chiết nấm 03 nƣớc λ= 734 nm 40 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Hàm lƣợng đạm số loài nấm [29] Bảng 1.2 Hàm lƣợng acid béo thiết yếu số loài nấm [29] Bảng 1.3 Giá trị phân bố t tƣơng ứng với xác suất p k bậc tự 20 Bảng 3.1 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ BHT methanol (l = 1,0cm, λ = 734 nm) 29 Bảng 3.2.Sự phụ thuộccủa mật độ quang vào nồng độ BHT nƣớc (l = 1,0cm, λ = 734 nm) 32 Bảng 3.3 Kết tính nồng độ chất chống oxi hóa dịch chiết nấm 01 methanol theo phƣơng trình đƣờng chuẩn 34 Bảng 3.4 Kết tính nồng độ chất chống oxi hóa dịch chiết nấm 03 methanol theo phƣơng trình đƣờng chuẩn 36 Bảng 3.5 Kết tính nồng độ chất chống oxi hóa dịch chiết nấm 01 nƣớc theo phƣơng trình đƣờng chuẩn 38 Bảng 3.6 Kết tính nồng độ chất chống oxi hóa dịch chiết nấm 03 nƣớc theo phƣơng trình đƣờng chuẩn 41 Bảng 3.7 Hàm lƣợng chất chống oxi hóa (mg BHT/g nấm khơ) thu đƣợc hai dung môi khác 43 Bảng 3.8 Hoạt tính chống oxi hóa (%) thu đƣợc hai dung môi khác 44 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng loại dung môi tổng hàm lƣợng phenolic, tổng số flavonoid tanin ngƣng tụ năm loài nấm 45 Bảng 3.10 Hàm lƣợng phenolic tổng (mg GAEs/g nấm khô) thu đƣợc chiết dung môi khác nhau: Ete dầu hỏa, etyl acetate, methanol nƣớc loại nấm 46 Bảng 3.11 Hoạt động chống oxi hóa số nấm Kashmir Valley 47 ix MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Các gốc tự đƣợc tạo thành xạ, phản ứng hóa học số phản ứng oxi hóa khử hợp chất khác nhau, tham gia vào q trình oxy hóa protein, gây tổn thƣơng DNA, peroxy hóa lipid mơ tế bào sống (Halliwell, 1996; Morrissey & O'Brien, 1998) [22] Sự oxi hóa mạnh mẽ liên quan đến nhiều rối loạn nhƣ bệnh ung thƣ, xơ vữa động mạch, bệnh tiểu đƣờng xơ gan (Halliwell & Gutteridge, 1984; Muramatsu cộng sự, 1995; Steinberg, Parthasarathy, Carew, Khoo, & Witztum, 1989) [22] Nghiên cứu dịch tễ học gần cho tăng mức tiêu thụ ngũ cốc, trái rau có liên quan với nguy giảm bệnh mạn tính (Hu, 2002) Sự kết hợp đƣợc quy với chất chống oxi hóa tự nhiên từ loại thực phẩm thực vật nhƣ vitamin C, tocopherol, carotenoid, flavonoid polyphenolic mà ngăn ngừa gốc tự (Diplock et al., 1998) [22] Vì vậy, trái cây, rau loại thảo mộc đƣợc khuyến cáo nhƣ nguồn tối ƣu thành phần hóa học có hoạt tính chống ơxi hóa, đƣợc bổ sung qua chế độ ăn uống ngƣời với loại thực vật có chứa lƣợng lớn hợp chất có khả khử hoạt tính gốc tự có tác động có lợi (Madsen va Bertelsen, 1995, veliolgu, mazza, Gao Oomah, 1998, Lutomski, 2001) [26] Các loại ngũ cốc nguồn lƣợng quan trọng, protein, chất xơ, khoáng chất, vitamin chất phytochemical nhƣ axit phenolic, phytic axit, lignans kích thích tố nữ (Slavin, Martini, Jacobs, & Marquart, 1999) [22] Các chất chống oxi hóa tự nhiên có rau vơ hiệu gốc tự khiến chúng khơng cịn khả phá hủy đại phân tử sinh học (AND, protein, lipit) gây bệnh cho thể Nấm loài đƣợc ứng dụng rộng rãi đời sống lẫn sản xuất, nhiều lồi nấm đƣợc sử dụng cơng nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn làm dƣợc liệu Nấm nguồn giàu protein, vitamin khoáng chất Chúng đƣợc biết đến có hoạt tính chống oxi hóa (Ohtsuka et al., Năm 1997, Jones Jonardhan, 2008) [16] Nấm tích lũy nhiều chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm hợp chất phenolic, polyketides, tecpen steroid Ngoài ra, hợp chất phenolic nấm đƣợc tìm thấy chất chống oxi hóa tuyệt vời điều phối khơng phải đột biến (Ishikawa, Morimoto, Hamasaki, 1984) [20] Nấm đƣợc phát khả phòng chống bệnh tật số phƣơng pháp điều trị, chẳng hạn nhƣ chống ung thƣ, kháng khuẩn, kháng virus, huyết học miễn f: Là hệ số pha loãng mẫu Vậy hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nấm mẫu 03 methanol là: 2,652 ≤ mantioxidant ≤ 4,002 (mg/g)  Hàm lƣợng trung bình chất chống oxi hóa mẫu 03: Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn: y= -5,7981 x+ 0,5765 Nồng độ trung bình mẫu: Ctb= 0,04466 (mM) m antioxidant mg / g   C antioxidant V M f = 3,247 (mg/g) (2) m.1000 3.1.3.2 Hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nƣớc  Mẫu nấm 01: Quá trình định lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nấm nƣớc phƣơng pháp UV – ViS đƣợc tiến hành nhƣ trình bày thu đƣợc kết nhƣ sau: Hình 3.7 Phổ UV -ViS dịch chiết nấm 01 nướctại λ= 734 nm Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn tuân theo định luật Beer: ∆Ai = - 7,1181 Ci + 0,655 Và kết thực nghiệm, tiến hành xử lý ta thu đƣợc kết nhƣ sau: Bảng 3.5 Kết tính nồng độ chất chống oxi hóa dịch chiết nấm 01 nước theo phương trình đường chuẩn Lần đo Thể tích dung dịch phân tích (ml) ∆Ai Ci 1 0,40526 0,03509 0,40531 0,03508 0,40085 0,03570 38 Để đánh giá độ xác phƣơng pháp, chúng tơi sử dụng hàm phân bố Student để đánh giá kết thu đƣợc xác định hàm lƣợng chất chống oxi hóa mẫu thật Chọn C = 0,03509; C ≈ X ; yi = xi -C n Ta có: Giá trị trung bình: X  C   i 1 - Phƣơng sai: S X  X n 1 i  = 1,261E-7 - Độ lệch chuẩn trung bình: S X   yi = 0,03529 n S2 = 2,0502E-4 n Xác định độ tin cậy kết phân tích Ta có:   t p, k S X = 0,000882 , Với t(0,95;2) = 4.3 Trong t p , k hàm phân bố student ứng với bậc tự k (k= n-1) xác suất p X   a  X  - Khoảng tin cậy: 0,034408 ≤ Cantioxidant ≤ 0,036172 Nếu  nhỏ X gần tới giá trị thực - Hàm phân bố thực nghiệm t tn  X a SX = 0,03529  0,036 2,0502 E  = 3,46307 - So sánh ttn với t p , k ta thấy: ttn = 3,5 < t p , k = 4,3 X ≠a nguyên nhân ngẫu nhiên với p = 0,95 - Sai số tƣơng đối q%   X 100  t p , k S X X 100 = 2,4993% q% = 2,5% < 5% kết nghiên cứu đƣợc chấp nhận áp dụng kết nghiên cứu để xác định hàm lƣợng chất chống oxi hóa số đối tƣợng  Từ bảng ta có mật độ quang trung bình mẫu là: ∆Ai = (0,40526+ 0,40531+ 0,40085)/3 = 0,40381 Mặt khác, từ phƣơng trình đƣờng chuẩn xây dựng mục 3.1.1.1.: Ai = (-7,1181± 0,9333).Ci + (0,65498 ± 0,0371) Chúng tơi tính đƣợc nồng độ chất chống oxi hóa 1ml dung dịch đem phân tích: 0,02659 ≤ Cantioxidant ≤ 0,04661 (mM) Hàm lƣợng chất chống oxi hóa gam mẫu khơ đƣợc tính theo công thức: mantioxidant mg / g   C antioxidant V M f m.1000 Trong đó: 39 V: Là thể tích dung dịch mẫu ban đầu m: Là khối lƣợng mẫu M: Khối lƣợng phân tử BHT f: Là hệ số pha loãng mẫu Vậy hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nấm nƣớc là: 0,999 ≤ mantioxidant ≤ 1,751 (mg/g)  Hàm lƣợng trung bình chất chống oxi hóa mẫu 01: Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn: y= -7,1181 x + 0,655 Nồng độ trung bình mẫu: Ctb= 0,03529 (mM) m antioxidant mg / g   C antioxidant V M f = 1,326 (mg/g) (3) m.1000  Mẫu nấm 03: Q trình định lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nấm nƣớc phƣơng pháp UV – ViS đƣợc tiến hành nhƣ trình bày thu đƣợc kết nhƣ sau: Hình 3.8 Phổ UV -ViS dịch chiết nấm 03 nước λ= 734 nm Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn tuân theo định luật Beer: ∆Ai = - 7,1181 Ci + 0,655 Và kết thực nghiệm, tiến hành xử lý ta thu đƣợc kết nhƣ sau: 40 Bảng 3.6 Kết tính nồng độ chất chống oxi hóa dịch chiết nấm 03 nước theo phương trình đường chuẩn Lần đo Thể tích dung dịch phân tích (ml) ∆Ai Ci 1 0,20452 0,063286 0,20095 0,063788 0,19147 0,065119 Để đánh giá độ xác phƣơng pháp, sử dụng hàm phân bố Student để đánh giá kết thu đƣợc xác định hàm lƣợng chất chống oxi hóa mẫu thật Chọn C = 0,063788; C ≈ X ; yi = xi -C n Ta có: Giá trị trung bình: X  C   i 1 - Phƣơng sai: S X  X n 1 i  = 8,972425E-7 - Độ lệch chuẩn trung bình: S X   yi = 0,064064 n S2 = 5,46883E-4 n Xác định độ tin cậy kết phân tích Ta có:   t p, k S X = 0,0023516 , Với t(0,95;2) = 4.3 Trong t p , k hàm phân bố student ứng với bậc tự k (k= n-1) xác suất p - Khoảng tin cậy: X   a  X  0,0617124 ≤ Cantioxidant ≤ 0,0664156 Nếu  nhỏ X gần tới giá trị thực - Hàm phân bố thực nghiệm t tn  X a SX = 0,064064  0,066 5,46883E  = 3,54006 - So sánh ttn với t p , k ta thấy: ttn = 2,5 < t p , k = 4,3 X ≠a nguyên nhân ngẫu nhiên với p = 0,95 - Sai số tƣơng đối q%   X 100  t p , k S X X 100 = 3,6707 q% = 3,7% < 5% kết nghiên cứu đƣợc chấp nhận áp dụng kết nghiên cứu để xác định hàm lƣợng chất chống oxi hóa số đối tƣợng  Từ bảng ta có mật độ quang trung bình mẫu là: ∆Ai = (0,20452+ 0,20095+ 0,19147)/3 = 0,19898 Mặt khác, từ phƣơng trình đƣờng chuẩn xây dựng mục 3.1.1.1.: 41 Ai = (-7,1181± 0,9333).Ci + (0,65498 ± 0,0371) Chúng tơi tính đƣợc nồng độ chất chống oxi hóa 1ml dung dịch đem phân tích: 0,05203 ≤ Cantioxidant ≤ 0,07973 (mM) Hàm lƣợng chất chống oxi hóa gam mẫu khơ đƣợc tính theo cơng thức: mantioxidant mg / g   C antioxidant V M f m.1000 Trong đó: V: Là thể tích dung dịch mẫu ban đầu m: Là khối lƣợng mẫu M: Khối lƣợng phân tử BHT f: Là hệ số pha loãng mẫu Vậy hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nấm nƣớc là: 2,459 ≤ mantioxidant ≤ 3,768 (mg/g)  Hàm lƣợng trung bình chất chống oxi hóa mẫu 03: Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn: y= - 7,1181.x + 0,655 Nồng độ trung bình mẫu: Ctb= 0,06406 (mM) m antioxidant mg / g   C antioxidant V M f = 2,873 (mg/g) (4) m.1000 3.1.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn methanol Khả thu nhặt gốc tự ABTS đƣợc tính cơng thức sau : I% = (A blank – Asample/A blank) x 100 Trong đó: Ablank độ hấp thụ dung dịch có chứa tất hợp chất phản ứng ngoại trừ dung dịch trích Asample độ hấp thụ dung dịch có chứa dịch trích  Mẫu nấm 01: I% = (A blank – Asample/A blank) x 100 Với: A blank = 0,74783 AMẫu 01= 0,48278 (17) AMẫu 01= 0,3124 (f=11)  I% = (0,74783– 0,3124/0,74783) x 100 = 58,22% (5)  Mẫu nấm 03: I% = (A blank – Asample/A blank) x 100 Với: A blank= 0,74783 AMẫu 03= 0,31755 (f=17) 42 AMẫu 03= 0,20536 (f=11)  I% = (0,74783– 0,23287/0,74783) x 100 = 72,54% (6) 3.1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn nƣớc Khả thu nhặt gốc tự ABTS đƣợc tính cơng thức sau : I% = (A blank – Asample/A blank) x 100 Trong đó: Ablank độ hấp thụ dung dịch có chứa tất hợp chất phản ứng ngoại trừ dung dịch trích Asample độ hấp thụ dung dịch có chứa dịch trích  Mẫu nấm 01: I% = (A blank – Asample/A blank) x 100 Với: A blank = 0,68735 AMẫu 01= 0,40381 (f=11)  I% = (0,68735– 0,40381/0,68735) x 100 = 41,25% (7)  Mẫu nấm 03: I% = (A blank – Asample/A blank) x 100 Với: A blank = 0,68735 AMẫu 03= 0,19898 (f=11)  I% = (0,68735– 0,19898/0,68735) x 100 = 71,05% (8) 3.1.4 Nhận xét kết Từ (1); (2); (3); (4) ta có hàm lƣợng chất chống oxi hóa đƣợc thể nhƣ mg BHT /g nấm khô, đƣợc thể nhƣ Bảng 3.7 Bảng 3.7 Hàm lượng chất chống oxi hóa (mg BHT/g nấm khơ) thu hai dung môi khác Methanol Nƣớc Mẫu nấm 01 1,332 1,326 Mẫu nấm 03 3,247 2,873 Từ (5); (6); (7); (8) ta có hoạt tính chống oxi hóa tính % hoạt tính khử gốc tự ABTS, đƣợc thể nhƣ Bảng 3.8 43 Bảng 3.8 Hoạt tính chống oxi hóa (%) thu hai dung mơi khác Mẫu nấm 01 Mẫu nấm 03 Methanol Nƣớc 0,0460 mM 0,0353 mM 58,22% 41,25% 0,0641 mM 0,0640 mM 72,54% 71,05% Từ Bảng 3.7 Bảng 3.8 ta nhận thấy rằng: - Hàm lƣợng chất chống oxi hóa hai mẫu nấm dịch chiết nấm methanol lớn dịch chiết nấm nƣớc - Hàm lƣợng chất chống oxi hóa mẫu 03 lớn hàm lƣợng chất chống oxi hóa mẫu 01 - Hoạt tính chống oxi hóa hai mẫu dịch chiết nƣớc bé dịch chiết methanol - Hoạt tính chống oxi hóa mẫu 01 bé hoạt tính chống oxi hóa mẫu 03 hai dịch chiết methanol nƣớc 3.2 So sánh với số kết nghiên cứu hợp chất chống oxi hóa loại dung mơi khác tác giả khác Dƣới dẫn số số liệu hàm lƣợng chất chống oxi hóa hoạt tính chống oxi hóa chúng số loại nấm thực vật khác đƣợc nghiên cứu giới để có so sánh với kết mà thu đƣợc chất chống oxi hóa dung mơi chiết khác mối quan hệ giửa hàm lƣợng chất chống oxi hóa với hoạt tính chúng Tác giả A Serteser cộng [27] nghiên cứu ảnh hƣởng loại dung môi tổng hàm lƣợng phenolic, tổng số flavonoid tanin ngƣng tụ năm loài nấm, thu đƣợc kết nêu Bảng 3.9 44 Bảng 3.9 Ảnh hưởng loại dung môi tổng hàm lượng phenolic, tổng số flavonoid tanin ngưng tụ năm loài nấm TP (mg GAE/100g) TF (mg CE/100g) CT (mg CE/100g) Methanol (60%,v/v) 388,62 ± 2,97 20,44 ± 1,64 34,33 ± 3,03 Ethanol (60%,v/v) 401.58 ± 3,91 32,67 ± 1,80 39,33 ± 2,58 Acetone (60%v/v) 324,14 ± 5,22 15,95 ± 1,32 51,00 ± 3,87 Nƣớc 641,65 ± 11,73 37,71 ± 0,48 118,92 ± 5,39 Hexan ND ND ND Methanol (60%,v/v) 170,66 ± 6,18 19,06 ± 1,10 28,08 ± 2,46 Ethanol (60%,v/v) 175,71 ± 3,82 21,69 ± 1,11 28,50 ± 2,46 Acetone (60%v/v) 163,50 ± 5,48 19,19 ± 0,34 34,75 ± 2,62 Nƣớc 461,65 ± 40,50 73,73 ± 1,84 115,58 ± 6,00 Hexan ND ND ND Methanol (60%,v/v) 215,94 ± 2,42 36,79 ± 0,92 25,17 ± 1,44 Ethanol (60%,v/v) 226,97 ± 2,47 42,67 ± 2,55 46,83 ± 3,82 Acetone (60%v/v) 206,60 ± 2,67 47,48 ± 1,12 73,50 ± 5,00 Nƣớc 311,23 ± 1,29 87,30 ± 1,97 130,17 ± 3,82 Hexan ND ND ND Methanol (60%,v/v) 603,10 ± 6,72 75,68 ± 2,80 107,67 ± 5,16 Ethanol (60%,v/v) 578,18 ± 4,33 72,21 ± 4,97 113,92 ± 2,92 Acetone (60%v/v) 547,14 ± 12,82 57,11 ± 4,09 126,83 ± 7,85 Nƣớc 901,75 ± 2,27 184,80 ± 1,47 224,75 ± 6,47 Hexan ND ND ND Methanol (60%,v/v) 506,30 ± 5,76 10,35 ± 0,49 32,67 ± 2,58 Ethanol (60%,v/v) 549,06 ± 4,58 15,40 ± 0,77 52,25 ± 2,09 Acetone (60%v/v) 493,50 ± 12,48 5,35 ± 0,42 55,58 ± 5,34 Nƣớc 723,30 ± 4,12 43,22 ± 0,93 144,33 ± 13,57 Hexan ND ND ND L ciliatus S commune H conia P leurotus sp P ostreatus 45 TP: Phenolic tổng số; TF: Tổng flavonoid; CT: Tanin ngưng tụ; ND: Không phát Từ Bảng 3.9 ta thấy hàm lƣợng phenolic tổng số loại nấm chiết loại dung môi khác nhau: Methanol, ethanol, acetone, nƣớc, n-hexan nhƣ sau: L.ciliatus S commune H conia Pleurotus sp P ostreatus Methanol (60%, v/v) (3) (3) (3) (2) (3) Ethanol (60%, v/v) (2) (2) (2) (3) (2) Acetone (60%, v/v) (4) (4) (4) (4) (4) Nƣớc (1) (1) (1) (1) (1) n-Hexan ND ND ND ND ND Trong đó: (1) - Hàm lƣợng phenolic cao Tƣơng tự (2), (3), (4) - Hàm lƣợng phenolic cao thứ 2, thứ 3, thứ ND: Không phát Ta thấy loại nấm L ciliatus, S commune, H conia P ostreatus : Hàm lƣợng phenolic tống chiết dung môi nƣớc cao so với chiết xuất dung môi khác, ethanol (60%, v/v) đứng thứ hai, Methanol (60%, v/v) đứng thứ ba, Acetone (60%, v/v) đứng thứ n-Hexan khơng phát Cịn loại nấm Pleurotus sp thì: Hàm lƣợng phenolic tống chiết dung môi nƣớc cao nhất, tiếp đến Methanol (60%, v/v) đứng thứ 2, sau đến Ethanol (60%, v/v) đứng thứ 3, Acetone (60%, v/v) cao thứ cịn n-Hexan khơng phát Tác giả L.M Cheung, Peter C.K Cheung CS [20] nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa tổng phenolic dịch chiết nấm ăn Hồng Kông, thu đƣợc kết nêu Bảng 3.10 nhƣ sau: Bảng 3.10 Hàm lượng phenolic tổng (mg GAEs/g nấm khô) thu chiết dung môi khác nhau: Ete dầu hỏa, etyl acetate, methanol nước loại nấm Ete dầu hỏa Etyl acetate Methanol Nƣớc L edodes 0,44 ± 0,07 0,03 ± 0,01 4,79 ± 1,20 1,33 ± 0,04 V volvacea 0,47 ± 0,05 0,21 ± 0,08 15,0 ± 1,91 1,34 ± 0,07 46 => Tổng hàm lƣợng hợp chất phenolic chiết xuất từ methanol cao (4,79-15,0 mg GAEs/g nấm khô), chất chiết xuất từ nƣớc (1,33-1,34 mg GAEs/g nấm khô), petroleum ether (0,44-0,47 mg GAEs/g nấm khô) ethyl acetate (0,03-0,21 mg GAEs/g nấm khơ) có hàm lƣợng tƣơng đối nhỏ Hàm lƣợng hợp chất phenolic thu đƣợc tăng dần với gia tăng độ phân cực dung môi So sánh với kết thu đƣợc từ Bảng 3.7, tổng hàm lƣợng hợp chất chống oxy hóa lần lƣợt mẫu nấm 01 03 thu đƣợc dịch chiết methanol 1,332 mg BHT/g nấm khô; 3,247 mg BHT/g nấm khô, thu đƣợc dịch chiết nƣớc 1,326 mg BHT/g nấm khô; 2,873 mg BHT/g nấm khơ, điều cho thấy hàm lƣợng chiết đƣợc dung môi methanol cao so với chiết nƣớc, kết thực nghiệm thu đƣợc hai mẫu nấm 01 03 chấp nhận đƣợc Tác giả Abdul Hamid Wani CS [16] nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa số nấm vùng thung lũng Kashmir thu đƣợc kết nêu bảng sau: Bảng 3.11 Hoạt tính chống oxi hóa số nấm Kashmir Valley Hoạt tính chống oxi hóa (%) nồng độ khác dịch xuất nấm Loài nấm Bovista plumbea Cantharellu s cibarius Sarcosypha coccinea Coprinus comatus 200μg/ml 300μg/ml 400μg/ml 500μg/ml 600μg/ml 62.22±0.203 67.24±0.832 76.36±0.128 78.59±0.234 82.59±0.485 61.30±0.114 75.58±0.097 82.27±0.096 89.38±0.025 86.23±0.099 51.91±0.086 79.38±0.025 85.85±0.128 88.47±0.592 89.90±0.101 13.46±1.118 22.25±0.239 35.24±0.824 56.06±1.294 58.50±0.707 => Ở nồng độ khác chiết xuất nấm cho thấy khả chống oxy hóa Thơng thƣờng, nồng độ cao hoạt động chống oxy hóa cao, khả ức chế gốc tự dao động từ 13,46% đến 89,9% So sánh với kết từ Bảng 3.8, khả khử gốc tự ABTS có giá trị lần lƣợt hai dung môi methanol nƣớc 58,22%, 41,25% mẫu nấm 01; 72,54% 71,05% mẫu nấm 03 cho thấy kết thực nghiệm thu đƣợc hai mẫu nấm 01 mẫu nấm 03 chấp nhận đƣợc 47 Từ kết nghiên cứu ta thấy, nhìn chung hợp chất chống oxi hóa tan nhiều trong dung mơi phân cực nhƣ: nƣớc, methanol, etyl acetate tan trong dung môi không phân cực nhƣ: ete dầu hỏa, n-hexan, chloroform Đối với mẫu nấm nghiên cứu mẫu nấm đƣợc lấy vƣờn quốc gia Phong Nha-Kẻ Bàng hàm lƣợng hợp chất chống oxi hóa dịch chiết methanol mẫu nấm 03 cao 3,247 mg/g, dịch chiết nƣớc mẫu 03: 2,873 mg/g chiết xuất methanol mẫu nấm 01: 1,332 mg/g; dịch chiết nƣớc mẫu nấm 01 có hàm lƣợng chất chống oxi hóa tƣơng đối nhỏ 1,326 mg/g Hoạt tính chống oxi hóa tỉ lệ thuận với nồng độ chúng 48 KẾT LUẬN Căn vào nhiệm vụ đề tài, dựa kết nghiên cứu, rút kết luận sau: Đã nghiên cứu đƣợc khả hòa tan hợp chất chống oxi hóa hai mẫu nấm đƣợc lấy vƣờn quốc gia Phong Nha – Kẻ Bàng Các hợp chất chống oxi hóa hịa tan tốt hai dung môi phân cực nƣớc methanol Tuy nhiên khả hòa tan hợp chất dung môi methanol lớn dung môi nƣớc Đã xây dựng đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ hợp chất chống oxi hóa, theo chất chuẩn BHT (Butylated Hydroxy Toluene), dùng thuốc thử ABTS (2,2'-azino-bis (3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) Đã xác định đƣợc hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nấm nấm lớn đƣợc chiết xuất dung môi:  Mẫu 01: -Dịch chiết nƣớc : 1,326 mg BHT/g nấm khô -Dịch chiết methanol : 1,332 mg BHT/g nấm khô  Mẫu 03: -Dịch chiết nƣớc : 2,873 mg BHT/g nấm khô -Dịch chiết methanol : 3,247 mg BHT/g nấm khơ Đã xác định đƣợc hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm dung môi:  Mẫu 01: -Dịch chiết nƣớc nồng độ 0,0353 mM: 41,25% -Dịch chiết methanol nồng độ 0,0460 mM: 58,22%  Mẫu 03: -Dịch chiết nƣớc nồng độ 0,0640 mM: 71,05% -Dịch chiết methanol nồng độ 0,0641 mM: 72,54% Đã đánh giá đƣợc đƣợc tính khả thi phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa theo phƣơng pháp Arnao et al (2001) Kết cho phép áp dụng phƣơng pháp để xác dịnh hoạt tính chống oxi hóa mẫu nấm với độ xác cao 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Giang Trung Khoa1, Nguyễn Thị Miền1, Phạm Văn Hiển1, Phạm Thị Hồng Diệu1, P Duez2 (2011) Ảnh hưởng chất lượng nguyên liệu đến hàm lượng Polyphenol hoạt tính kháng khuẩn giống chè PH1 Tạp chí Khoa học Phát triển: Tập 9, số 2: 258 - 264 Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội [2] Hồ Viết Q (2002) Cơ sở hóa học phân tích đại - tập II – Các phương pháp phân tích lý – hóa, NXBĐHSP [3] Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thƣ (2009) Stress oxi hóa chất chống oxi hóa tự nhiên Tạp chí Khoa học Phát triển: Tập 7, số 5: 667 – 677 [4] Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lƣu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cần (2001) Hóa thực Phẩm, NXBKHKT [5] Lê Văn Trọng (2012) Hoạt tính sinh học flavonoid, Hội thảo khoa học cấp khoa, Trƣờng đại học Hồng Đức [6] Nguyễn Khắc Nghĩa, Áp dụng toán học thống kê để xử lý số liệu, (1997) [7] Nguyễn Huy Phiêu, Phùng Ngọc Bộ Nghiên cứu cấu tạo lignin bồ đề tre nứa Tạp chí Hoá học Ứng dụng số 3-2002 tr.17 [8] Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2011) Phân lập hợp chất phenolic từ số thực vật Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ, Trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội TIẾNG ANH [9] Ferreira IC, Barros L, Abreu RM (2009) Antioxidants in wild mushrooms Curr Med Chem 16(12): 1543-60 [10] Isabel C.F.R Ferreira, Paula Baptista, Miguel Vilas-Boas, Lillian Barros (2007) Free-radical scavenging capacity and reducing power of wild edible mushrooms from northeast Portugal: Individual cap and stipe activity Food Chemistry 100: 1511–1516 [11] L.M Cheung, Peter C.K Cheung (2005) Mushroom extracts with antioxidant activity against lipid peroxidation Food Chemistry 89: 403–409 [12] L.M Cheung, Peter C.K Cheung, Vincent E.C Ooi (2003) Mushroom extracts with antioxidant activity against lipid peroxidation Food Chemistry 81: 249–255 [13] Silvia Martinsa, Solange I Mussattoa, Guillermo Martínez-Avilab, Julio MontezSaenzc, Cristóbal N Aguilarb, Jose A Teixeiraa (2011) Bioactive phenolic 50 compounds: Production and extraction by solid-state fermentation A review Biotechnology Advances 29: 365–373 [14] Wilfred Vermerris, Ralph Nicholson Phenolic Compound Biochemistry Springer Pages 1,2; [15] Whettena R and Sederoffa R (1995), Lignin Biosynthesis The Plant Cell 7: 10011013 [16] Abdul Hamid Wani, R H Boda, Taskeen-un-Nisa and Latif A Peer (2010) Potential antioxidant activity of some mushrooms growing in Kashmir Valley Mycopath 8(2): 71-75 [17] Loganathan K Jagadish, M Hemalatha, D Gunasundari, R Shenbhagaraman and V Kaviyarasan (2011) Antioxidant activity of hot water soluble fraction from Agaricus heterocystisand its effect on apple browning Emir J Food Agric 23 (4): 381-386 [18] Ali Kele, lkay Kocaand Hỹseyin Genỗcelep (2011) Antioxidant Properties of Wild Edible Mushrooms Keles et al., J Food Process Technol 2:6 [19] Gan, C H., Nurul Amira, B and Asmah, R (2013) Antioxidant analysis of different types of edible mushrooms (Agaricus bisporous and Agaricus brasiliensis) International Food Research Journal 20(3): 1095-1102 [20] L.M Cheung, Peter C.K Cheung, Vincent E.C Ooi (2003) Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts Food Chemistry 81: 249–255 [21] L.M Cheung, Peter C.K Cheung (2005) Mushroom extracts with antioxidant activity against lipid peroxidation Food Chemistry 89: 403–409 [22] Youngmin Choi, Heon-Sang Jeong, Junsoo Lee (2007) Antioxidant activity of methanolic extracts from some grains consumed in Korea Food Chemistry 103: 130–138 [23] Il-Suk Kim, Mira Yang, Ok-Hwan Lee, Suk-Nam Kang (2011) The antioxidant activity and the bioactive compound content of Stevia rebaudiana water extracts LWT - Food Science and Technology 44: 1328-1332 [24] Shruti Shukla, Archana Mehta, Pradeep Mehta, Vivek K Bajpai (2012) Antioxidant ability and total phenolic content of aqueous leaf extract ofStevia rebaudianaBert Experimental and Toxicologic Pathology 64: 807–811 [25] Sandra C Gouveia, Paula C Castilho (2012) Validation of a HPLC-DAD– n ESI/MS method for caffeoylquinic acids separation,quantification and identification 51 in medicinal Helichrysum species from Macaronesia Food Research Internation 45: 362 – 368 [26] A Serteser, M Kargıo, V Gök, Y Ba, M Musa Özcan and D Arslan (2009) Antioxidant properties of some plants growing wild in Turkey Grass Y Aceites, 60 (2), ABJL_JUNIO, 147-154 [27] A Serteser, M Kargıo, V Gưk, Y Ba, M Musa Ưzcan and D Arslan (2009) Antioxidant properties of some plants growing wild in Turkey Grass Y Aceites, 60 (2), ABJL_JUNIO, 147-154 [28] Haisha Yang, Yuqiong Dong, Huijing Du, Haiming Shi, Yunhua Peng and Xiaobo Li (2011) Antioxidant Compounds from Propolis Collected in Anhui, China Molecules 16: 3444-3455 WEBSITES [29] http://vi.wikipedia.org/wiki/Wikipedia 52 ... chung nấm - Lý thuyết hoạt tính chống oxi hóa - Xác định hàm lƣợng chất chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn - Xác định hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nấm lớn đƣợc... tài: ? ?Xác định hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết vài loài nấm lớn? ?? làm đồ án tốt nghiệp nhằm phân tích hàm lƣợng chất chống oxi hóa đánh giá hoạt tính chống oxi hóa mẫu nấm lớn Với nguồn nấm lớn. .. 3.1.2 Hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết nấm lớn 33 3.1.3 Kết xác định hoạt tính oxi hóa trong dịch chiết nấm lớn phƣơng pháp trắc quang 34 3.1.3.1 Hàm lƣợng chất chống oxi hóa