Tiểu luận môn hóa sinh thực phẩm các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM BÀI TẬP TIỂU LUẬN MÔN HÓA SINH THỰC PHẨM NHÓM 18 Chủ đề: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA Lớp học phần: 210543202 GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Trang Năm học: 2015-2016 BÀI TẬP TIỂU LUẬN MÔN HÓA SINH THỰC PHẨM NHÓM 18 Chủ đề: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA Lớp học phần: 210543202 GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Trang Năm học: 2015-2016 STT Họ tên Hoàng Thị Linh Kiều Thị Kim Anh Hồ Thị Mỹ Phạm Thị Nga I Chất chống Oxi hóa MSSV 14070611 14070811 14094971 14092671 - - - Khái niệm Chất chống oxi hóa loại hóa chất giúp ngăn chặn làm chậm trình oxi hóa chất khác Chất chống oxi hóa loại hóa chất giúp ngăn chặn làm chậm trình oxi hóa chất khác Chức Làm chậm trình oxy hóa chất hữu cơ, tăng thời gian hữu dụng thời hạn sử dụng vật liệu Làm giảm gia tăng gốc tự sinh từ trình chuyển hoá thể gây hại cho tế bào Trong chất béo dầu, chống oxy hóa làm chậm khởi đầu trình oxy hóa làm chậm tốc độ phản ứng oxy hóa Sử dụng chất chống oxy hóa phụ gia thực phẩm để trì chất lượng thực phẩm tăng thời hạn sử dụng không nâng cao chất lượng thực phẩm Một số thực phẩm giàu chất chống oxy hóa bao gồm: Rau: Bắp cải đỏ, rau bina, củ cải đỏ, cải bruxen Trái cây: Bưởi, lê, dứa, dưa hấu, nho - đặc biệt màu đỏ, cam, mận lựu Các loại hạt: Quả óc chó, hồ đào, lạc, phỉ Các loại đậu: Đậu nành, đậu pinto Trái khô: Quả chà là, mận mơ Gia vị: Quế, đinh hương hạt tiêu Nguồn thực phẩm thịt: Thịt gà, thịt cừu, cá (cá hồi), gà tây, thịt cua II Phương pháp xác định hoạt tính chống Oxi hóa Ngày nay, ảnh hưởng điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng thực phẩm chừa nhiều chất oxi hóa tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau gia tăng dạng oxi hoạt động Các dạng oxi hoạt động gia tăng, gây nhiều phản ứng bất lợi tởn thương cho thể nguyên nhân nhiều bệnh nan y Do cần có nghiên cứu, tìm hiểu chất có khả chống oxi hóa mang lạ nhửng tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe người Bên cạnh đó, cần khảo sát thêm quy trình thử hoạt tính chống oxi hóa tối ưu va dễ thực để phục vụ cho việc nghiên cứu Sau số phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa đơn giản ổn định sử dung rộng rãi thực tế Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH: DPPH gốc tự có màu tím giống màu dung dịch KMnO4, không tan nước, tan dung môi hữu Ngày DPPH sử dụng để khảo sát khả ức chế gốc tự Phương pháp hữu hiệu dung phổ biến đơn giản, nhanh chóng dễ ổn định Nguyên tắc: Các chất có khả kháng oxi hóa trung hòa gốc DPPH cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thư bước song cực đại màu dung dịch phản ứng nhạt dần chuyển từ màu tím sang vàng nhạt Phản ứng trung hòa gốc DPPH chất kháng oxi hóa minh họa phản ứng đây: Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự NO Trong hệ thống thần kinh trung ương ngoại biên, vai trò NO quan trọng: Đóng vai trò dẫn truyền thần kinh, mang tín hiệu đến nơi thể, điều khiển cân nội mô mạch não, điều hòa cảm nhận đau, điều khiển trình tư trí nhớ 2,33,39 NO đƣợc sinh từ NOS tổ chức (nNOS eNOS) ảnh hưởng lên trƣơng lực mạch não góp phần điều hòa vận mạch bị kích thích Vì vậy, rối loạn NO dẫn đến số bệnh não bệnh: Alzeimer, thiếu máu não, đột quỵ 22 NO có vai trò vô quan trọng thể tác nhân góp phần điều hòa huyết áp, NO yếu tố gây giãn mạch nội sinh Nếu nhiều NO đƣợc sinh dãn mạch máu dẫn đến giảm huyết áp, ngược lại, lượng NO sinh dẫn đến tượng tăng huyết áp 18 Sự rối loạn đƣờng chuyển hóa L-arginin – NO làm thay đổi nồng độ NO tạo Những rối loạn thƣờng dẫn đến số bệnh nhƣ: chứng tăng huyết áp, tiểu đường, béo phì, suy tim, xơ vữa động mạch, lão hóa, tổn thƣơng mạch máu Ngoài ra, lƣợng NO sản xuất nhiều trở thành chất nội độc tố NO phản ứng với ROS gây hại cho thể, ví dụ gốc tự ONOO-, gốc nitrite gây hại cho thể 2,7,9,18 NO• + •O2- ↔ ONOO- 4NO• + O2 + H2O ↔ NO2- + H+ Nguyên tắc NO phản ứng với oxi tạo sản phẩm bền vững nitrite nitrate, hoạt chất ức chế NO phản ứng cạnh tranh với oxy, kết làm giảm sản phẩm nitrit tạo thành dung dịch nước nồng độ nitrite dung dịch nước xác định phƣơng pháp trắc quang sử dụng thuốc thử Greiss Trong đó, nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo bền vững có bƣớc sóng hấp thu cực đại 540 nm Dựa giảm nồng độ nitrite tạo thành, ta tín khả ngăn chặn gốc tự NO hoạt chất (tính % ức chế) Thuốc thử Greiss hỗn hợp hai dung dịch: N-1-napthylethylene diamine dihydrochloride (NED) sulfanilamide môi trường H3PO4 Cơ chế phản ứng tạo sản phẩm màu diazo hóa nhƣ Phương pháp xác định hàm lượng MDA MDA (Malonyl dialdehyde) sản phẩm cuối trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên áp dụng rộng rãi thực tế để nghiên cứu trình peroxy hóa lipid màng tế bào Nguyên tắc MDA đƣợc sinh trình peroxy hóa lipid màng tế bào, cho phản ứng với acid thiobarbituric, phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại bước sóng 532 nm, phản ứng thực môi trường pH 2-3, nhiệt độ 90-100oC thời gian từ 10 đến 15 phút Dựa giảm cường độ hấp thu phức ta tính khả kháng oxy hóa chất cần nghiên cứu 3,5 Phản ứng tạo phức MDA acid thiobarbituric biểu diễn sau: Phương pháp đánh giá khả kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) Nguyên tắc: Ion sắt hay đồng trạng thái tự dễ dàng xúc tác sinh gốc tự Khi cho ion Fe2+ tác dụng với thuốc thử Ferrozin sinh phức màu có cực đại hấp thu bƣớc sóng f = 562nm 5,7,28 Mẫu thử khóa kim loại vào dạng phức, không cho kim loại tồn dạng tự nên làm khả xúc tác kim loại Hoạt tính chống oxy hóa mẫu thử thể qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu ion Fe2+ với thuốc thử Ferrozin Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) Giới thiệu Xanthine oxidase (XO) loại enzyme giữ vai trò quan trọng trongquá trình thoái hóa purine, đóng vai trò chất xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành xanthine sau tiếp tục xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine thành acid uric 5,7,38,51 2.4.5.2 Cấu tạo Enzyme XO protein dimer đồng (homodimeric protein) có phân tử lƣợng 300000 Da, monomer protein tổ chức gồm phần (domain) chính: phần chứa tâm Fe2S2, phần chứa tâm molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi molybdopterin, phần flavin adenine dinucleotide (FAD) Trong phần chứa Mo phần lớn trung tâm hoạt tính xúc tác enzyme, tâm Fe2S2 FAD đóng vai trò chất vận chuyển điện tử trình oxy hóa đƣợc xúc tác enzyme 21 Cơ chế hoạt động enzyme XO Enzyme XO ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase) Enzyme XO xúc tác cho hydroxyl hóa chất khác theo phản ứng tổng quát RH + H2O ROH + 2H+ + 2e─ Phản ứng xảy tâm Mo, Mo bị khử từ Mo (VI) xuống Mo (IV), trình phản ứng, electron tạo thành đƣợc chuyển tới tâm nhận electron enzyme 21 Với chất xanthine, chế phản ứng hydroxygen hóa dƣới diện XO đƣợc nhà khoa học đề nghị nhƣ sau 21: Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO Xanthine oxidase enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự O2● Acid uric có bước sóng cực đại hấp thu 290 nm Nếu mẫu thử có khả kháng enzyme XO cao hạn chế hình thành acid uric, làm giảm giá trị mật độ quang Các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa ngày sử dụng nhiều nhằm tìm hợp chất có khả ức chế gốc tự kháng trình sinh nó, hợp chất đƣợc gọi chất kháng oxy hóa Chúng sinh từ thể hệ thống kháng oxy hóa có chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò thiết yếu nhằm chống lại gốc tự độc hại sản sinh liên tục thể, chất kháng oxy hóa có phân tử lƣợng thấp glutathinon, vitamin E, vitamin C hợp chất có thực phẩm, rau hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9 Giới thiệu phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào 3.1 Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào ung thư ruột kết người DLD-1 thu từ sưu tập tế bào American Type nuôi cấy môi trường McCoy’5A có bổ sung thành phần dinh dƣỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, ủ môi trƣờng CO2 5% 37oC Tế bào phục vụ cho thí nghiệm đƣợc rửa PBS tách khỏi chai nuôi cấy tế bào dung dịch trypsin 2%