Nguyên tắc: Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thư tại bước song cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ
Trang 1BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM
BÀI TẬP TIỂU LUẬN MÔN HÓA SINH THỰC PHẨM 1
NHÓM 18
Chủ đề: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA
Lớp học phần: 210543202 GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Trang Năm học: 2015-2016
Trang 2BÀI TẬP TIỂU LUẬN MÔN HÓA SINH THỰC PHẨM 1
NHÓM 18
Chủ đề: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA
Lớp học phần: 210543202 GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Trang Năm học: 2015-2016
I Chất chống Oxi hóa
Trang 31 Khái niệm
- Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác
- Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác
2 Chức năng
- Làm chậm quá trình oxy hóa của một chất hữu cơ, do đó tăng thời gian hữu dụng hoặc thời hạn sử dụng của vật liệu đó
- Làm giảm sự gia tăng các gốc tự do sinh ra từ quá trình chuyển hoá trong cơ thể gây hại cho các tế bào
- Trong chất béo và dầu, chống oxy hóa làm chậm sự khởi đầu của quá trình oxy hóa hoặc làm chậm tốc độ của các phản ứng oxy hóa
- Sử dụng một chất chống oxy hóa như là một phụ gia thực phẩm để duy trì chất lượng của thực phẩm và tăng thời hạn sử dụng nhưng không nâng cao chất lượng của thực phẩm
- Một số thực phẩm giàu chất chống oxy hóa bao gồm:
- Rau: Bắp cải đỏ, rau bina, củ cải đỏ, cải bruxen
- Trái cây: Bưởi, lê, dứa, dưa hấu, nho - đặc biệt là màu đỏ, cam, mận và quả
lựu
- Các loại hạt: Quả óc chó, quả hồ đào, lạc, và quả phỉ
- Các loại đậu: Đậu nành, đậu pinto
- Trái cây khô: Quả chà là, mận và mơ
- Gia vị: Quế, đinh hương và hạt tiêu
- Nguồn thực phẩm thịt: Thịt gà, thịt cừu, cá (cá hồi), gà tây, thịt cua
II Phương pháp xác định hoạt tính chống Oxi hóa
Trang 4Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chừa nhiều chất oxi hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxi hoạt động Các dạng oxi hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi tởn thương cho cơ thể
và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxi hóa mang lạ nhửng tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxi hóa tối ưu va dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu Sau đây là một số phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa đơn giản ổn định và được sử dung rộng rãi trong thực tế
1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH:
DPPH là một gốc tự do có màu tím giống màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ
Ngày nay DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu được dung phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định Nguyên tắc:
Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thư tại bước song cực đại và màu của dung dịch phản ứng
sẽ nhạt dần chuyển từ màu tím sang vàng nhạt
Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxi hóa được minh họa bằng phản ứng dưới đây:
2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO
Trong hệ thống thần kinh trung ương và ngoại biên, vai trò của NO rất quan trọng: Đóng vai trò dẫn truyền thần kinh, mang tín hiệu đến bất cứ nơi nào trong cơ
Trang 5thể, điều khiển cân bằng nội mô mạch não, điều hòa cảm nhận đau, điều khiển quá trình tư duy và trí nhớ 2,33,39 NO được sinh ra từ NOS tổ chức (nNOS và eNOS) sẽ ảnh hưởng lên trương lực cơ bản của mạch não và góp phần điều hòa vận mạch khi bị kích thích Vì vậy, sự rối loạn NO sẽ dẫn đến một số bệnh về não như bệnh:
Alzeimer, thiếu máu não, đột quỵ 22 NO có một vai trò vô cùng quan trọng đối với
cơ thể là tác nhân góp phần điều hòa huyết áp, ngoài ra NO còn là yếu tố gây giãn mạch nội sinh Nếu quá nhiều NO được sinh ra thì sự dãn mạch máu sẽ dẫn đến sự giảm huyết áp, và ngược lại, nếu lượng NO sinh ra ít sẽ dẫn đến hiện tượng tăng huyết
áp 18
Sự rối loạn con đường chuyển hóa L-arginin – NO làm thay đổi nồng độ NO tạo
ra Những sự rối loạn này thường dẫn đến một số bệnh như: chứng tăng huyết áp, tiểu đường, béo phì, suy tim, xơ vữa động mạch, lão hóa, tổn thương mạch máu Ngoài ra, khi lượng NO sản xuất quá nhiều thì chính nó sẽ trở thành chất nội độc tố
và khi đó NO còn phản ứng với các ROS gây hại cho cơ thể, ví dụ gốc tự do ONOO-,
là gốc nitrite gây hại cho cơ thể 2,7,9,18
NO• + •O2- ↔ ONOO- 4NO• + O2 + H2O ↔ NO2- + H+
Nguyên tắc NO phản ứng với oxi tạo ra sản phẩm bền vững là nitrite và nitrate, hoạt chất ức chế NO sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả là làm giảm sản phẩm nitrit tạo thành trong dung dịch nước và nồng độ nitrite trong dung dịch nước được xác định bằng phương pháp trắc quang sử dụng thuốc thử Greiss Trong đó, nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo bền vững và có bước sóng hấp thu cực đại ở 540 nm Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo thành, ta tín được khả năng ngăn chặn gốc tự do NO của hoạt chất (tính trên % ức chế)
Trang 6Thuốc thử Greiss là hỗn hợp của hai dung dịch: N-1-napthylethylene diamine dihydrochloride (NED) và sulfanilamide trong môi trường H3PO4 Cơ chế của phản ứng tạo sản phẩm màu diazo hóa như trên
3 Phương pháp xác định hàm lượng MDA
MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào Nguyên tắc MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại
ở bước sóng 532 nm, phản ứng được thực hiện ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100oC trong thời gian từ 10 đến 15 phút Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức ta tính được khả năng kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu 3,5 Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric được biểu diễn như sau:
4 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) Nguyên tắc: Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do Khi cho ion Fe2+ tác dụng với thuốc thử Ferrozin sẽ sinh ra phức màu có cực đại hấp thu tại bước sóng f = 562nm 5,7,28 Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào dạng phức, không cho kim loại tồn tại ở dạng tự do nên làm mất khả năng xúc tác của kim loại Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử sẽ được thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe2+ với thuốc thử Ferrozin
5 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO)
Giới thiệu Xanthine oxidase (XO) là một loại enzyme giữ vai trò quan trọng trongquá trình thoái hóa của purine, nó đóng vai trò là chất xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và sau đó tiếp tục xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine thành acid uric 5,7,38,51 2.4.5.2 Cấu tạo Enzyme XO là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có phân tử lượng là 300000 Da, trong đó mỗi
Trang 7monomer của protein tổ chức gồm 3 phần (domain) chính: một phần chứa 2 tâm Fe2S2, một phần chứa tâm molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi là
molybdopterin, một phần là flavin adenine dinucleotide (FAD) Trong đó phần chứa
Mo là phần lớn nhất và là trung tâm hoạt tính xúc tác của enzyme, tâm Fe2S2 và FAD đóng vai trò là những chất vận chuyển điện tử trong quá trình oxy hóa được xúc tác bởi enzyme 21
Cơ chế hoạt động của enzyme XO Enzyme XO là một trong ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác là molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase) Enzyme XO xúc tác cho sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát
RH + H2O ROH + 2H+ + 2e─ Phản ứng xảy ra tại tâm Mo, Mo bị khử từ
Mo (VI) xuống Mo (IV), và trong quá trình phản ứng, các electron tạo thành được chuyển tới các tâm nhận electron trong enzyme 21 Với chất nền là xanthine, cơ chế phản ứng hydroxygen hóa dưới sự hiện diện của XO được các nhà khoa học đề nghị như sau 21:
Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O2● Acid uric có bước sóng cực đại hấp thu tại 290
Trang 8nm Nếu mẫu thử có khả năng kháng enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm giá trị mật độ quang
Các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng được sử dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng như kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này được gọi là các chất kháng oxy hóa Chúng có thể được sinh ra từ cơ thể như hệ thống kháng oxy hóa có bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự
do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và những chất kháng oxy hóa có phân tử lượng thấp như glutathinon, vitamin E, vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất
có trong thực phẩm, rau quả như các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9 3 Giới thiệu phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào 3.1 Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào ung thư ruột kết người DLD-1 được thu từ bộ sưu tập tế bào American Type và được nuôi cấy trong môi trường McCoy’5A có bổ sung các thành phần dinh dưỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, và ủ trong môi trường CO2 5% tại 37oC Tế bào phục vụ cho thí nghiệm được rửa bằng PBS và tách khỏi chai nuôi cấy
tế bào bằng dung dịch trypsin 2%