Tiểu luận môn hóa sinh thực phẩm phương pháp thu nhận tách chiết xác định hoạt hóa và ứng dụng enzyme amylase trong ngành công nghệ thực phẩm

ENZYME: Enzyme hay còn gọi là men là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein, không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai t

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN, TÁCH CHIẾT, XÁC ĐỊNH HOẠT HÓA

VẢ ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG NGÀNH CÔNG

NGHỆ THỰC PHẨM

NHÓM SINH VIÊN THỰC HIỆN: NHÓM 1

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : NGUYỄN THỊ TRANG

MÃ HP: 210543202

LỜI CẢM ƠN

Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể Quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh và thư viện trường đã tạo điều kiện, giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập

và nghiên cứu.

Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Trang, người đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp những thắc mắc cho chúng em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành bài tiểu luận này.

Tập thể nhóm 1

MỤC LỤC

1 GIỚI THIỆU, TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE:

1.1 ENZYME:

Enzyme hay còn gọi là men là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là

protein, không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹthuật phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường

Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với một hiệu suất rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH Sở dĩ như vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzym

Như vậy, enzym là các protein xúc tác các phản ứng hóa học Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất, enzym sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzym Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose,…

1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đường Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu

1862: Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp thụ chọn lọc

1949: Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000

1950: Englard và Singer cho biết số chu chuyển của b-Amylase là 250000

1952: người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4 Enzyme α-Amylase

1971: Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đã xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và glucoamylase trong canh

trường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt lực dextrinase và

transglucosilase

2 PHÂN LOẠI:

Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm:

 Endoamylase ( Enzyme nội bào )

 Exoamylase ( Enzyme ngoại bào )

2.1 ENDOAMYLASE (Nội bào):

Gồm có

- α-Amylase (EC 3.2.1.1)

+ Nhóm Enzyme khử nhánh Nhóm này được chia thành hai loại:

 Khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41);

 Khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Các Enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

2.1.1 α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)Amylase (α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)1,4-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)

Amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột còn nguyên vẹn

2.1.1.1 Cấu tạo Enzyme α-Amylase:Amylase:

Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến nay người ta đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-

Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acidamin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau

2.1.1.2 Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase:Amylase:

+ Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:

Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide

Amylase oligosacharide poliglucose

Maltose maltotriose maltotetrose

2.1.1.3 Đặc tính α-Amylase:Amylase:

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-Amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme:

 α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

 Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 )

 Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

 Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

2.1.2 Nhóm Enzyme khử nhánh

2.1.2.1 Khử trực tiếp:

α-dextrin 6-glucanohydrolase (EC 3.2.1.41)

Enzyme này có thể thuỷ phân các liên

kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và

các dextrin tới hạn Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của Enzyme Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân cắt liên kết này

Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4 Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside Tác dụng hiệp đồng của α-Amylase

và pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn

2.1.2.2 Khử gián tiếp:

Oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.20)

Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này Giống như glucomylase, nó thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột Maltase và glucozyltranferase là một Enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các

glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu

Amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10)

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose , panose

và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có ở VSV nhưng đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm ( đại mạch, thóc nảy mầm ) Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc , hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–

glucosidase hay R–Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase và β-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn

2.2 EXOAMYLASE( Ngoại bào):

Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi

polysaccharide Nhóm này gồm có:

 β-Amylase (EC 3.2.1.2)

 Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3)

2.2.1 β-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)Amylase (EC 3.2.1.2):

2.2.1.1 Cấu tạo β-Amylase:Amylase:

β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm Ở trong các hạt ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong tinh bột , glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch Maltose được tạo thành do sự xúc tác

của β-Amylase có cấu hình β

Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự

phân giải của tinh bột trong quá trình nảy mầm

của hạt Ở lúa, β-Amylase được tổng hợp trong

suốt quá trình của hạt và hầu như không được

tổng hợp ở hạt khô Ở lúa mạch, Enzyme có mặt

ở trong hạt khô, nó được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da

2.2.1.2 Cơ chế tác dụng β-Amylase:Amylase:

β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme) Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-Amylase phân cắt các liên kết α- 1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin

Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột :

β-Amylase chịu nhiệt kém hơn α-Amylase nhưng bền hơn với acid β-Amylase

bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C Nhiệt độ tối thích của β-Amylase là 550C , pH 5,1 – 5,5

Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-Amylase thường có một nhóm caboxyl thể hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron Sự nghịch đảo hình thể của cacbon anome (C1) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất đồng hoá trị trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động Sau

đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải phóng

ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme

2.2.2 γ-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)Amylase (EC 3.2.1.3):

2.2.2.1 Cấu tạo γ-Amylase:Amylase:

Gluco amylase có khả năng thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6-glucoside, ngoài ra còn

có khả năng thủy phân liên kết -1,2 và -1,3-glucoside

Gluco amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột,glucogen, amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại enzyme amylase khác

γ-Amylase ( glucoamylase hay

α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những Enzyme có thể

thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch

α-glucan để giải phóng ra ở dạng β

Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được tạo

ra bởi các vi sinh vật Đặc biệt là kiểu nấm mốc

aspergillus, penicillium và Rhizopus

Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme

Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một nửa gốc cystein Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của Enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc

đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid

glucose mannose, galactose và glucosamin

Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoEnzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng Amyloglucosidase I

tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có

cả hai tinh chất này

2.2.2.2.Cơ chế hoạt động γ-Amylase:Amylase:

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ) Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit

2.2.2.3.Tính chất γ-Amylase:Amylase:

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose

Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4 ; α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase…

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin , dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả các loại Enzyme khác Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ Các polisaccharide có nhánh như amylopectin,

glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 500C Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và khôngđược bảo vệ bởi Ca2+

3 NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE:

Có 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận enzym: các mô và cơ quan động vật, các mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

3.1 Thu nhận enzyme amylase từ nguồn thực vật:

Người ta đã biết cách chiết xuất enzyme amylase từ hạt nảy mầm để sử dụng trong ngành công nghiệp chế biên thực phẩm Vd như kẹo mạch nha, bia khi đó, hạt ngũ cốc được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp và khi đó ta thuđược malt

3.1.2 Lúa

Hệ enzyme trong lúa cũng tương tự như trong hạt đại mạch, trong quá trình nảy mầm, hoạt động các enzyme tăng cao thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme vàquá trình sinh hóa gần giống đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ phản ứng

Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết khi hạt nảy mầm, chúng lại chuyển sang hoạt động

3.2 Thu nhận enzym từ nguồn động vật:

Enzyme amylase có trong tụy tạng của động vật

3.2.1 Thu nhận enzyme amylase từ tuyến tụy gà:

Tụy gà là một cơ quan tham gia nhiều vào quá trình tiêu hóa và là nguồn phụ phẩm

có thể tận dụng để ly trích enzyme Ở Việt Nam, các loại enzyme amylase và protease đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Hiện nay, enzyme vẫn phải được nhập từ nước ngoài với giá thành tương đối cao Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích tìm

ra phương pháp hiệu quả để ly trích enzyme amylase từ tụy gà

Kết quả cho thấy phương pháp ly trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate có

pH 7 rồi kết tủa protein bằng (NH4)2SO4 60% bão hòa, sau đó đem đi thẩm tích và đông khô chân không đã cho hiệu quả ly trích enzyme tốt nhất

Amylase được trích từ tụy gà hoạt động tốt ởnhiệt độ 50oC với pH 7,5 Việc thêm NaCl 0,1% và CaCl2 0,05% đều làm tăng hoạt tính của amylase

Protease được trích từ tụy gà hoạt động tốt ở nhiệt độ 50oC với pH 7,6 Việc thêmcysteine 0,01% và CaCl2 0,1 ppm đã làm tăng hoạt tính protease Phân tích điện di SDS-PAGE cho thấy sự hiện diện của enzyme amylase, trypsin và chymotrypsin trong mẫu

protein trích được Sản phẩm sau khi bảo quản 90 ngày ở 20oC vẫn duy trì hoạt tính xúc tác.

Qua các nguồn nguyên liệu động, thực vật chính có thể từ đó chiếtxuất các chế phẩm enzyme, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu nàykhông thể dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm sau đây:

 Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài

 Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được

 Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng làmnguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme nhằm thoảmãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân

Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật, cũng như sẽ khắc phục được mọi khó khăn

và hạn chế ở trên Cơ bản là do các lí do sau:

 Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn

 khác

 Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú

 Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền

 Tốc độ sinh sản rất nhanh

 Dễ kiểm soát quá trình sx và mở rộng ở quy mô công nghiệp

3.3 Thu nhận enzym từ nguồn vi sinh vật:

Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, vsv trở thành nguồn thu enzyme amylase chủ đạo Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi,giả nấm men và vi khuẩn,còn xạ khuẩn thì ít hơn

Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus

Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,

Endomycopsy, Endomyces cũng tạo amylase

Nhiều vi khuản có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa,

Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm vsv khác

Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vugaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ a-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác

3.3.1 Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme

Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:

 Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy

 Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính

 enzyme)

 Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất

 Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm

3.3.2 Sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae:

Phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống Ưu điểm của việc này

là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được bảo đảm chắc chắn Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ýnghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm

Quá trình lấy mẫu : có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rửa sạch

cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây Sau đó cho vào bao nylon và mang về phòng thí nghiệm.

Tiến hành thí nghiệm phân lập:

 Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây

 Lấy 10g mẫu đất hay mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo mẫu

 Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyền sang 1 ống nghiệm khác cóchứa 90ml nước cất vô trùng

 Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo

 Hút 0.1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốcphát triển, môi trường PDA (Potato Dextro Agar )

 Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày

 Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sánh xung quanh khuẩn lạc

 Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường nước khi cấy Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột

 Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông

 Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (quy mô nhỏ )

 Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm

 Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù

 Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm

KH2PO4 1,4 mg

NH4NO3 10mg

MnSO4.7H2O 0,1 mgFeSO4.7H2O 0,01 mg

Hồ tinh bột 20 g

Phân phối khoảng 30 – 40 ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi

Autoclave ở 73 – 121oC trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng Sau đó đem ủ

ở 25 – 30oC trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng / phút Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ Để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp

3.3.3 Sản xuất amylase từ Bacillus subtilis:

-Phương pháp phân lập các chủng Bacillus từ đất vườn qua trung gian cỏ khô

Lấy một ít đất vườn (10g) cho vào bình tam giác và thêm 90ml nước cất vô trùng lắc đều để tạo huyền phù, gia nhiệt tới 85oC trong 20-25 phút Cắt nhỏ một ít cỏ khô, rắc xung quanh cỏ ít bột CaCO3 rồi cho vào bình tam giác trên sao cho nước vừa ngập cỏ, để

từ 1-2 ngày ở nhiệt độ phòng Đổ 10ml môi trường phân lập vào đĩa petri vô trùng, để nguội và cấy một lần que cấy vòng từ màng vi sinh vật mọc trên mặt lớp cỏ khô lên bề mặt môi trường đặc, dùng que gạt gạt đều, sau đó gói đĩa petri và cho vào tủ ấm 25-35oC Sau 2-3 ngày thấy xuất hiện các khuẩn lạc riêng biệt trên mặt môi trường thạch

-Phương pháp giữ giống cấy truyền:

Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy dịch vi khuẩn phân lập đã được pha loãng bằng nước cất vô trùng, và cấy zic zăc trên bề mặt thạch nghiêng Nút ống nghiệm lại đặt vào tủ ấm 34oC, sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 4oC để giữ giống.

Giống được cấy truyền hàng tháng và hoạt hóa trước khi nhân giống

-Phương pháp thu dịch chiết α-amylase thô từ môi trường nuôi cấy:

Sau khi thu nhận được dịch nuôi cấy vi khuẩn, đem ly tâm 5000 vòng/phút trong

15 phút để loại bỏ sinh khối, thu nhận phần dịch bên trên, dung dịch này được sử dụng như dịch enzym α-amylase thô và được bảo quản ở 4oC

-Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym (CPE) α-amylase từ dịch chiết enzym thôbằng các tác nhân tủa:

Các tác nhân tạo tủa enzym thường được sử dụng là các dung môi hữu cơ: etanol

96o, aceton, muối trung tính (NH4)2SO4 để thu nhận chế phẩm enzym từ dịch chiết thô Từ

đó so sánh và chọn tác nhân gây tủa thích hợp

Yêu cầu đối với giống vi sinh vật

Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo quy mô công nghiệp Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cầnphải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định Đó là:

 Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn Sản phẩm này phải có số lượng

và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình

trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất Do

đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về sốlượng và chất lượng

 Giống phải cho năng suất sinh học cao

 Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sảnxuất công nghiệp

 Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động

 Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết,

4 TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ ENZYME AMYLASE:

Enzyme amylase được thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch, malt thóc và ngô Có hai phương pháp tinh sạch enzyme amylase là phương pháp điện di trên gel polyacrylamide

4.1 Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký

Hạt lúc được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 300C trong 8 ngày Hạt nảy mầm được đồng hóa trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM (pH 8,5) (dung dịch đệm A) Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon

và dịch lọc thô được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút Phần ở trên được xem như dịch enzyme thô Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH4)2SO4 (25-60%) Phần kết tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc

độ 15.000 vòng trong 20 phút

Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A; enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0-0,5M Dung dịch được thẩm tích và được lôicuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn

amylase.Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose Những phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

4.2 Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE)

Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn với đệm Tris-HCl 0,05M (pH 8,0) Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích) Hỗn hợp sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000rpm trong 1 phút ở nhiệt độ

40C Phần nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch

enzyme

Gel được chuẩn bị sẵn sang và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V Sau khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác định sự hiện diện của amylase.

5 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE:

5.1 Đơn vị đo hoạt độ:

Mức độ hoạt động trong chế phẩm là thông tin quan trọng về lượng Enzyme trong đối tượng nghiên cứu, vì trong những điều kiện xác định, tốc độ phản ứng Enzyme tỉ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng Lượng Enzyme theo quy ước quốc tế được biểu diễn bằng đơn vị Enzyme Đơn vị Enzyme quốc tế ( UI ) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

Trong những điều kiện xác định ( bão hòa cơ chất ), tốc độ phản ứng do Enzyme xúc tác tỷ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng

Hoạt độ riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩm Enzyme

Hoạt độ phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa bởi 1 phân tử Enzyme sau 1 phút

Hoạt độ của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa trên 1 trung tâm hoạt động sau 1 phút

Hoạt độ xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm phản ứng tạo thành trên 1 đơn vị thời gian càng lớn

Bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa của cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng ta có thể đánh giá hoạt độ xúc tác của Enzyme Có 3 nhóm phương pháp:

 Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định

 Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sảnphẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định

 Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biếnthiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

* Phương pháp xác định hoạt độ Enzyme có rất nhiều Ở mỗi nước và mỗi phòng thí nghiệm có thể dùng phương pháp này hay phương pháp khác là tùy thuộc điều kiện và thói quen Nhưng khi so sánh chất lượng giữa các chế phẩm với nhau thì phải theo

phương pháp thống nhất

5.2 Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)Amylase theo Rukhliadeva:

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quangđiện sẽ tính được hoạt độ Enzyme

Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1 g tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1 giờ ( pH cho Amylase của malt là 4,8 – 4,9; của nấm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0 …)

5.3 Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)Amylase)

5.3.1 Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trongchế phẩm nghiên cứu Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme

Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH= 4,7 ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ giải phóng được 1 mg glucose

5.3.2 Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase:

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trongdịch chế phẩm nghiên cứu Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệu của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt độ Enzyme

Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan

pH = 4,7 ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 phút giải phóng được 1 μmol glucose.mol glucose

5.4 Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase có hoạt lực cao

Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng Asp.awamori 78 - 2 và Asp.awamori 22 có hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so với ban đầu.

5.4.2 Môi trường dinh dưỡng:

Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh trường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng hợp Amylase

Cám lúa mì thường chứa khoảng 20 - 30% tinh bột, 10 - 12% protit Ngoài ra còn chứa muối khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin

Để tiết kiệm cám người ta còn trộn thêm các nguyên liệu khác vào môi trường như trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia

Ở nước ta do không có cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bột ngô vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau

Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase có hoạt độ cao từ Asp.awamori

là cám 75% ( hàm lượng tinh bột 29% ) bột ngô 6% ( hàm lượng tinh bột 55% ) và 19% trấu Hàm lượng tinh bột chung là 25% Điều kiện tối ưu khi nuôi cấy là: to 32OC, độ ẩm57% và nuôi trong 42 giờ

Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin Sự có mặt của glucose, fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế

sự tích tụ Amylase Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm mốc phát triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase