Tiểu luận môn hóa sinh thực phẩm phương pháp tách chiết xác định hoạt độ và ứng dụng của protease

Mở đầu Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của Công Nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp,

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - THỰC PHẨM



MÔN: HÓA SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ VÀ

ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE GVHD: NGUYỄN THỊ TRANG

NHÓM 2

1 Hoàng Thị Thanh Nga 14063011 Nhóm trưởng

4 Nguyễn Thị Thảo Nguyên 14047721

Tp.hcm, Ngày 18 tháng 9 năm 2015

2014-2015

Mở đầu

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của Công Nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Trong đó, Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như; chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm cho phomát,làm mềm thịt, bổ sung để tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia Xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm (sản xuất chất tẩy rửa, thuốc da, y tế, nông nghiệp )

Phần 1 - Phương pháp tách chiết enzyme protease

Để tách và tinh chế enzyme nói chung là protease nói riêng thì có một số phương pháp hóa - lý khác nhau Có thể chia làm ba nhóm chính sau:

- Phương pháp kết tủa

- Phương pháp sắc ký

- Phương pháp phân tách hệ hai pha nước

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng

từ mức độ tế bào, cơ quan cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu

đủ, dứa, ) và động vật (gan, dạ dày bê, ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và

đa dạng

Phần 2 - Thu nhận và làm sạch enzyme protease từ vi sinh vật và

thực vật

2.1 Thu nhận và làm sạch enzyme protease từ vi sinh vật.

Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và

xạ khuẩn

Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu:

Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn

2.2 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme.

Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào vi sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có

Tuyển chọn và cải tao giống vi

Sinh vật

Phương pháp bảo quản giống

Vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy vi sinh Tổng hợp enzyme

Tách và làm sạch chế phẩm

enzyme

thể được các vi sinh vật tiết ra môi trường sống Đó là các enzyme ngoài

tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào

Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu tử của tế bào Do đó có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ các cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch

Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenzizator)

Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng đến các yếu tố vật lí và hóa học khác nhau như sóng siêu

âm Dùng các dung môi hữu cơ như buthanol, aceton, glycerin, ethyl acetate và chất detergent Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ

Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc bằng các dung dịch muối trung tính

Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý

Trước hết đó là nhiệt độ Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C) Các thao tác phải nhanh Một số chất điện li làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút

Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường Là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm

tích(dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng các lọc qua gel sephadex

Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt

độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ,các phương pháp sắc ký( sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion) điện li, phương pháp lọc gel

Mục đích yêu cầu: các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết( hoạt độ riêng) Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gay ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và qui trình công nghệ sau này( ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da) Cũng có khi người ta cẩn sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học

Enzyme nói chung rất dễ giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng

ở nhiệt độ thấp, độ pH thấp không có mặt các chất gây biến hình

enzyme

2.2.1 Phương pháp kết tủa

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dung dịch enzyme các loại muối có thể được dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme Loại muối này lại rẻ và phổ biến Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767 g/l ở 250C)

2.2.2 Phương pháp sắc ký Các kỹ thuật sắc ký cột

Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột

Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - lọc filtration)

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra

Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải

là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không

có tính đàn hồi(không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl)

Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau diện tích tổng số của các protein enzyme Hãy nói cách khác, phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion Tác nhân ( hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc

là chất ionit Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh ( Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polystiron Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa Các chất trao đổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol ( ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn

Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn xuất este của cellulose

C2H5

C2H5

Cellulose - O – CH2 - N

C2H5

Trong H2O nó được phân li:

Cellulose – C2H4 – N – (C2H5) + H2O

C2H5

+ OH Cellulose – O – C2H4 – N+

C2H5

H Đây là chất trao đổi anion

Nếu chất là sephadex thì thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex

Đó là các loại DEAE – sephadex và CM – sephadex Ưu điểm của loài này là vừa tách được protein enzyme về kích thước và về diện tích tổng

số của các protein enzyme Trường hợp CM – sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO

O – CH2 - COOH

Phân ly

COO – (mang điện tích)

Đây là chất trao đổi cation

Ngoài ra, có các phương pháp:

- Phương pháp dùng cháy phụ

- Phương pháp dùng chất phụ đặc biệt hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực ( afinity chromatography)

2.2.3 Phương pháp tách hệ hai pha nước

Cơ sở kỷ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung môi vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt Hệ dung môi được sử dụng trong phương pháp này có thể là polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc

heejpolymer/muối như PEG và patasium phosphate, sodium phosphate, sodium sulphate…

Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein

Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách

và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách chất rắn ra khỏi chất lỏng

So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như:

+ Có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70 – 80,5)

+ Đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy

mô lớn

+ Và đặc biệt polymer được tái sử dụng

Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa hóa trị phosphate hoặc

sulphate…

Phần 3 - Xác định hoạt độ protease

Cách xác định hoạt độ của protease từ quả đu đủ và nấm mốc Aspergillus oryzae

3.1 Hóa chất và dụng cụ

- Quả đu đủ, nấm mốc Aspergillus oryzae

- Dung dịch tartaric acid 1%; dung dịch trichloacetic acid 0,3M; dung dịch casein 2%; dung dịch đệm Britton và Robinson (acetic acid,

phosphoric acid, boric acid); dung dịch HCl 0,2N; dung dịch tyrosine 1 mM; dung dịch Folin

- Dụng cụ thủy tinh (bình tam giác, ống nghiệm, pipete…)

- Tủ ấm, bếp đun cách thủy

- Máy so màu

3.2 Nguyên tắc

Dùng dịch chiết quả có enzyme thủy phân protein Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng trichloacetic acid Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đồ thị chuẩn

tyrosine

Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong trichloacetic acid tương ứng với một micromol tyrosine (0,181 mg) trong một phút, ở 300C

Protease của dịch chiết quả được xác định ở pH 7,2 ± 0,2

3.3 Các bước tiến hành

a Chuẩn bị dung dịch đ ệm Britton và Robinson pH 7,2

- Dung dịch A: Acetic acid 0,04M (2,32 ml pha thành 1000 ml),

phosphoric acid 0,04M, boric acid 0,04M

- Dung dịch B: 8g NaOH hòa tan trong nước cất và dẫn nước đến 1000 ml

- Dung dịch đệm Britton và Robinson có pH khác nhau phụ thuộc vào tỉ

lệ pha thể tích dung dịch A và B Pha đệm pH 7,2: lấy 100 ml dung dịch

A và 55 ml dung dịch B, dẫn nước cất đến 200 ml

b Dung dịch casein 2%

Hòa tan 2g casein vào 90 ml đệm Britton và Robinson pH 7,2 Nếu pH của dung dịch thấp hơn 7,2 thì dùng vài giọt NaOH 1N để điều chỉnh, dẫn đệm đến 100 ml

c Dung dịch enzyme

- Cân 1g đu đủ, nghiền với đệm Britton và Robinson pH 7,2 Đổ dịch nghiền vào bình định mức loại 100 ml Dùng đệm rửa cối chày, nước rửa cho vào bình định mức Bổ sung đệm đến vạch ngấn Lắc đều, lọc lấy dịch trong

- Chuẩn bị dịch enzyme từ dịch lên men vi nấm A oryzae : Nuôi cấy A oryzae trong môi trường dịch thể Czapek−Dox vô trùng

(saccharose 30g; NaNO3 3,5g; K2HPO4 1,5g; MgSO4 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4

0,01g rồi thêm 20 ml sữa đặc hoặc 10g gelatin, hoặc casein, nước cất

1000 ml) trong điều kiện nhiệt độ phòng trên máy lắc 200 vòng/phút sau

72 giờ thu lấy dịch lọc

d Tiến hành phản ứng

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 20 ml cơ chất (casein), đặt vào chậu ổn nhiệt ở 300C Sau 10 phút cho vào mỗi ống nghiệm 20 ml dung dịch enzyme (cũng ở 300C), lắc trộn đều và để 10 phút ở 300C Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch trichloacetic acid 0,3M; lắc trộn nhanh để protein dư và các hợp chất cao phân tử khác kết tủa, giữ các ống nghiệm ở 300C thêm 20 phút nữa rồi lọc lấy dịch Lấy 1 ml dịch lọc

và 5 ml dung dịch Na2CO3 0,5M cho vào ống nghiệm, trộn đều và thêm 1

ml thuốc thử Folin Sau 20 phút phản ứng, dung dịch có màu xanh da trời, mang đo trên máy so màu

Thí nghiệm đối chứng thay dung dịch enzyme bằng 20 ml nước cất

So sánh kết quả của thí nghiệm và đối chứng

e Xây dựng đường chuẩn tyrosine

Pha dung dịch gốc tyrosine có nồng độ 10−3 (1 mM): cân

181,12 mg tyrosine, hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N rồi định mức đến

100 ml bằng HCl 0,2N Từ dung dịch gốc pha loãng thành dãy nồng độ dung dịch như sau:

Tyrosine(ml

)

HCl

0,2N(ml)

Nồng độ

tyrosine

0,02 0,44 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30

Mỗi dung dịch trên lấy 1 ml cho vào 7 ống nghiệm, cho thêm vào mỗi ống 5 ml Na2CO3 0,5M và 1 ml thuốc thử Folin, lắc đều

Mẫu đối chứng thay 1 ml dung dịch tyrosine bằng 1 ml nước cất Giữ hỗn hợp phản ứng trong 20 phút, sau đó đo trên máy so màu ở bước sóng 720 nm Lấy số liệu trung bình của hai ống nghiệm dựng đường chuẩn tyrosine với trục hoành là nồng độ tyrosine (e) tính theo

micromol/ml, trục tung là mật độ quang (OD)

3.4 Tính kết quả

3.4.1 Định tính hoạt độ protease

+ Kiểm tra hoạt độ protease ở môi trường chứa casein hoặc gelatin tinh khiết: Dùng môi trường thạch đĩa Czapek−Dox thêm 10g gelatin, dùng khoan đồng khoan bỏ thỏi thạch rồi cho vào đó 1 ml dịch nuôi A oryzae trên, sau 24 giờ dùng thuốc thử HCl 1% hoặc dung dịch (NH¿¿ 4)2SO4¿ bão hòa đổ lên bề mặt môi trường thạch đĩa, nếu A oryzae sinh ra protease thì sẽ có một vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan do các protein đã bị phân giải, vùng không bị phân giải vẫn có màu trắng đục

Căn cứ vào đường kính vùng phân giải để xác định hoạt độ

protease

3.4.2 Định lượng hoạt độ protease

Hoạt độ protease (Hdp) tính bằng đơn vị/gam hay đơn vị/ml theo công thức:

Hdp= OD∗4∗1000

a∗10∗w

Trong đó: OD - mật độ quang đo được của mẫu

4 - Tỷ lệ thể tích của hỗn hợp phản ứng với dung dịch enzyme Sau khi thêm trichloacetic acid:

2ml cơ chất (tyrosine)+2 ml enzyme+4 ml TCA