CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYM LIPASE

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYM LIPASE

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT

TÍNH CỦA ENZYM LIPASE

Enzym thuỷ phân chất béo có nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các tế bào của những cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển của lipit từ cơ quan này sang cơ quan khác Một khía cạnh quan trọng của hệ enzym thuỷ phân chất béo là chúng chỉ xúc tác cho các phản ứng lý hoá tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha béo-nước, nhờ cơ chế hấp phụ bề mặt (kiểu xúc tác sensu stricto) Hầu hết enzym Lipase là enzym hoà tan được trong nước hoạt động trên những cơ chất không tan trong nước Đặc tính phức tạp của loại xúc tác này làm cho nó khó định lương đươc chính xác cả

về tỷ suất bề mặt cũng như những tham số tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha (như lực căng bề mặt, tính nhớt bề mặt, điện thế bề mặt) và liên quan với chất lượng bề mặt của cơ chất mà quá trình phân ly chất béo phải phụ thuộc Sự nhũ hoá giữa nước và các chất không tan trong nước sẽ cần đến sự tồn tại của các chất hoạt động bề mặt như: các chất tẩy rửa, các chất béo khác nhau, protein… ngay tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha, vì vậy có thể ảnh hưởng một cách mạnh mẽ đến phương pháp đo hoạt tính của enzym Lipase mà sự kìm hãm không đặc hiệu của lipase do sự xuất hiện của Protein tại bề mặt tiếp xúc của hai pha dầu-nước là một ví dụ điển hình

Các enzym Lipase đã được định nghĩa bằng những thuật ngữ động học, được dựa trên hiện tượng “ hoạt động bề mặt giữa các pha “, nghĩa là sự gia tăng hoạt tính xuất hiện khi một phần cơ chất tan trong nước trở thành cơ chất không tan trong nước Quá trình này chưa được quan sát trên các esterases ( nhóm enzym xúc tác sự tổng hợp và thuỷ phân các ester ) Cấu trúc 3-D của lipase được xác định gần đây cho thấy các nếp gấp / của hydrolase và tâm

ái nhân có chứa gốc Serin Một số lipase ( không phải là tất cả ) còn có vùng kieểm soát trung tâm hoạt động và hiện tượng “ hoạt động bề mặt “chưa phải

là tiêu chuẩn thích hợp để phân loại các esterases đặc biệt như lipase Vì các enzym thường được đặt tên theo kiểu phản ứng mà chúng xúc tác, lipase có thể được định nghĩa lại là các carboxy-esterases hoạt động trên chuỗi acylglycerols mạch dài: chúng là những enzym phân cắt lipit đơn giản

Ở những nước công nghiệp phát triển, các chất béo ăn được đã có mặt trong bữa ăn của con người, mà thành phần chủ yếu là triacylglycerols (TAGs) từ 100-150g mỗi ngày, chiếm khoảng 30% năng lượng mà cơ thể đưa vào hàng ngày Những phân tử TAG không thể tự đi qua màng ruột được Một chuỗi các phản ứng thuỷ phân và hấp thụ cần xảy ra để giải phóng hoá năng có mặt trong các mạch hydrocacbon của TAG sinh vật có thể sử dụng được

Enzym lipase bên trong bộ máy tiêu hoá đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong những chu trình cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người và những động vật bậc cao Lipase hiện nay được sử dụng rộng rãi như những chất xúc tác chọn lọc trong môi trường có nước ( hoặc ít nước ) và nhiều phân tử tổng

hợp mà có thể được sử dụng như những cơ chất của lipase Trong quá trình này, chúng ta chỉ đề cập đến sự phân tích lipase kéo theo sự thuỷ phân ester carboxylic

Những phản ứng này thường được thực hiện dưới điều kiện hoạt độ của nước thấp Hơn nữa, người đọc được tham chiếu tới những điều lệ phổ biến mà liên quan đến enzym Lipase trong phép phân tích lập thể chọn lọc

Trong enzym học, người ta không định lượng enzym một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định mức độ hoạt động ( hoạt độ ) của enzym Bởi vì, khi có mặt enzym thì sự hoạt động của nó được biểu hiện

ra ở chỗ nó làm thay đổi cac tính chất vật lý, hoá lý cũng như tính chất hoá học của hỗn hợp phản ứng Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzym thông qua xác định lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng

Về nguỵên tắc, có thể chia ra 3 nhóm phương pháp sau:

1 Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lương sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzym xác định

2 Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của

cơ chất hay sản phẩm ứng với một nồng độ enzym nhất định

3 Chọn nồng độ enzym cần thiết như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

Ba nhóm phương pháp này được tóm tắt trong bảng sau :

Nhóm Các thông số cố định Các thông số thay đổi

Nồng độ enzym

Biến thiên của S hay P

2 Lượng cơ chất mất đi (hay

lượng sản phẩm tạo thành)

Nồng độ [E]

Thời gian

Lượng S mất đi (hay P tạo thành)

Nồng độ E

Có thể tìm thấy trên các bài báo, tạp chí khoa học nhiều phương pháp để đo hoạt tính thuỷ phân của enzym lipase Những phương pháp này có thể được phân loại như sau :

1 Phương pháp chuẩn độ ( Titrimetry )

2 Phương pháp quang phổ ( Spectroscopy ( photometry,fluorimetry ))

3 Phương pháp sắc ký ( Chromatography )

4 Phương pháp phóng xạ ( Radioactivity )

5 Phương pháp sức căng bề mặt ( Interfacial tensionmetry )

6 Phương pháp đục kế ( Turbidimetry )

7 Phương pháp đo độ dẫn điện ( Conductimetry )

8 Phương pháp hoá học miễn dịch ( Immuno-chemistry )

9 Phương pháp hiển vi ( microscopy )

…

Phản ứng thuỷ phân triacylglycerol được xúc tác bởi enzym Lipase có thể được viết :

TAG DAG MAG Glycerol

TAG = triacylglycerols

DAG = diacylglycerols

MAG = monoglycerols

FFA = free fatty acids

I.Các phương pháp hoá lý :

I.1 Sự biến mất của cơ chất :

I.1.1 Phương pháp đo độ đục :

a) Trong môi trường rắn :

Phương pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester carboxylic được dùng làm cơ chất , bản chất là xác định đường kính của vùng khuyếch tán sản phẩm Sự phân giải chất béo sẽ làm lan rộng vùng sáng màu trên đĩa thạch Hiện tượng quang học này chỉ quan sát được khi các acid béo được giải phóng ra hoà tan một phần vào nước Quá trình sáng màu này là kết quả của sự giảm kích thước của các hạt nhũ bị thuỷ phân có tác dụng làm giảm ánh sáng khuyếch tán

Kỹ thuật này cũng có thể được áp dụng trong quá trình theo dõi sự thuỷ phân của Twees do các enzym lipase khác nhau xúc tác

b) Trong môi trường lỏng:

Phương pháp này theo dõi sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian

Kỹ thuật này rất nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối với các hệ nhũ tự nhiên

ví dụ như huyết tương chẳng hạn, thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến quá trình Thêm vào đó, kết quả không hoàn toàn tuyệt đối là những giá trị hoạt động của enzym Lipase và thu được dữ liệu đáng tin cậy

Vì vậy, enzym Lipase thuần khiết được sử dụng để xây dựng một đường chuẩn Bước chuẩn hoá này đã hạn chế sự khuyếch tán rộng của phương pháp nhạy cảm này

Pháp phân tích esterase bằng phương pháp đo độ đục đã được phát triển, sử dụng một dung dịch Tween 20 với sự hiện diện của CaCl2, và sử dụng esterase từ Lysobacter enzymogenes làm nguồn enzym Phản ứng được theo dõi bằng việc đo sự gia tăng mật độ quang ở bước sóng 500nm vì quá trình thuỹ phân giải phóng ra các acid béo từ Tween 20 và sự kết tủa của chúng dưới dạng muối Canxi

Phương pháp phân tích đo độ đục này đã được sử dụng để xác định hoạt tính

riêng của enzym lipase từ chủng Chromobacterium ( với liều lượng là 87

IU.mg-1) và chủng Candida cylindracea ( với liều lượng là 0.5 IU.mg-1)

II Phương pháp đĩa Wilhelmy:

II.1 Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết:

Trong số các phương pháp xác định sức căng bề mặt thì kĩ thuật màng film đơn phân tử tại bề mặt tiếp xúc của không khí -nước đã được phát triển rộng

và được nhóm nghiên cứu của Fréderic Beisson, Claude Rivìere cũng như nhóm của Brockman sử dụng Kỹ thuật này về cơ bản gồm một lớp Teflon ( lớp chống dính ) phủ trên máng, mà trên đó là một dung dịch Một bản mỏng Pt nhúng trong bề mặt của pha nước được gắn liền với một electromicrobalance để đo áp suất bề mặt mà nó trực tiêp` liên quan đến sức căng bề mặt

Một vài công ty đã có sẵn thiết bị này và được thương mại hoá: KSV ( Helsinki, Finland ), Kruss GmbH ( Hamburg, Germany ) và Kibron Inc (Helsinki, Finland) Một màng film đơn phân tử của chất béo có thể được phân bố tại bề mặt của pha nước, sử dung dung môi dễ bay hơi như chloroform để hoà tan chất béo Dung dịch chất béo được áp dụng ở dạng những giọt nhỏ mà chúng có khả năng bay hơi được Vùng bị chiếm giữ bởi lớp chất béo có thể là hàng rào được điều chỉnh bởi một lớp Teflon quét trên

bề mặt của pha nước Áp suất bề mặt có thể được duy trì bề mặt có thể được duy trì không đổi tự động bằng cách sử dụng sự thuyên chuyển của Teflon

mà được kiểm soát và điều chỉnh phụ thuộc vào đầu ra của electromicrobalance Dung dịch chứa enzym lipase được tiêm vào bên dưới màng film chất béo, áp suất bề mặt sẽ giảm vì sự hoà tan của những sản phẩm phản ứng thuỷ phân chất béo Khi lớp màng chắn này di chuyển có tác dụng duy trì hằng số áp suất bề mặt, động học của phản ứng có thể được theo dõi bằng cách ghi lại sự chuyểng động của lớp màng chắn này theo thời gian Với kỹ thuật này, ta có thể đo và điều khiển những tham số bề mặt quan trọng như áp suất bề mặt ( năng lượng tự do của bề mặt tiếp xúc giữa các pha) và vùng phân tử của cơ chất Phương pháp màng film đơn phân tử thích hợp để nghiên cứu những phản ứng enzym trên chất béo mà được phân bố tại

bề nặt tiếp xúc không khí-nước

Phương pháp này có độ nhạy cao, và lương chất béo thấp đáp ứng yêu cầu để thực hiện những phép đo động học đáng tin cậy

II.2 Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất:

Hầu hết những nghiên cứu động học về hoạt động của enzym thuỷ phân chất béo đã được thực hiện invitro, dùng những chất béo thuần khiết làm cơ chất Thực tế, tất cả các mặt phân cách của sinh vật đều là sự pha trộn phức tạp của hỗn hợp gồm lipit và Protein Kỹ thuật đơn lớp lý tưởng thích hợp cho việc nghiên cứu kiểu hoạt động của hệ enzym thuỷ phân chất béo tại mặt phân cách, sử dụng hỗn hợp chất béo đã được điều chỉnh Có 2 phương pháp từ hỗn hợp chất béo tạo màng đơn lớp tại bề mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách phân bố hỗn hợp chất béo không tan trong nước vào một dung môi hữu

cơ dễ bay hơi, hoặc tiêm một dung dịch nhũ tương của chất tẩy rửa vào trong pha nước,được bao phủ bởi lớp đơn chất béo không tan

Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và Verger [70] cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt không thay đổi và thành phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình Fig 1A

Màng chắn bằng teflon được đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “ Zero-order

“ để ngăn truyền thông bề mặt giữa màng chứa ( reservoir ) và bộ phận phản ứng (reaction compartment) Áp suất bề mặt được xác định rõ đầu tiên bằng cách đặt bản Pt vào trong bộ phận phản ứng , nơi mà hỗn hợp film được phân

bố ở áp suất yêu cầu Áp suất bề mặt được đo sau khi chuyển bản Pt tới màng

chứa, nơi mà film cơ chất thuần khiết được phân bố tiếp sau.Áp suất bề mặt của màng chứa bằng với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng bằng việc di chuyển lớp màng chắn di động Màng chắn giữa 2 bộ phận được chuyển dịch cho phép những bề mặt tiếp xúc với nhau và enzym được tiêm vào trong bộ phận phản ứng và kết quả động học được ghi chép như mô tả

II.3 Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp:

Bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp đơn phân tử, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng giá trị tối ưu xảy ra ở mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt Giá trị chính xác của điểm tối ưu biến đổi tuỳ theo sự kết hợp giữa enzym và cơ chất được sử dụng Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra

để giải thích hiện tượng này là: Giả thuyết đầu tiên, được đề nghị bởi Hughes và những người làm việc thuộc thế hệ sau ông: Sự định hướng phụ thuộc màng bao của cơ chất có lẽ là một trong những nhân tố điều hoà mà quá trình phân giải chất béo phụ thuộc

Sử dụng những enzym đã được đánh dấu phóng xạ, Verger và Pattus đã thiết lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính hoạt động bề mặt của enzym Thật vậy, sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system) nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và tỉ lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỉ lệ này thường là 1 cm-1, phụ thuộc vào

độ sâu của cái máng Trong khi đó, ở khối lớn tỉ lệ này có thể cao khoảng

10-5 cm-1, phụ thuộc vào lượng lipit sử dụng và trạng thái của sự phân giải lipit Kết quả là ở trường hợp của khối lớn sự hấp phụ hầu hết các enzym xuất hiện tại bề mặt giao tiếp, trong khi ở lớp đơn chỉ có 1 phân tử enzym trong hàng trăm các enzym có thể xuất hiện tại bề mặt giao tiếp Vì ở tình trạng này, một lượng nhỏ không xác định ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ thuỷ phân được hấp phụ trên lớp đơn Để khắc phục sự giới hạn này thì nhiều phương pháp đã được đề ra để phục hồi và đo lượng enzym đã được hấp phụ tại bề mặt giao tiếp

Sau khi đo tốc độ, Momsen và Brockman [77] đã chuyển lớp đơn đến 1 mẩu giấy kỵ nước và những enzym được hấp phụ sau đó được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ Sau khi so sánh với tốc độ của mẫu trắng và pha mang ( subphase ), số lượng của những enzym được hấp phụ sẽ được tính toán từ vận tốc của mạng lưới và hoạt động của những enzym đặc hiệu

Trong bảng phân tích những enzym hoạt động phóng xạ, màng film được hút

ra bằng cách lồng những đáy của ống mao quản thuỷ tinh cong vào trong chất lỏng và nổi lên trên đỉnh của một phần thành Teflon Khi những phân tử enzym được đánh dấu phóng xạ tan trong pha mang sẽ bị hút ra cùng với những thành phần đi kèm với màng film Kết quả sẽ được kiểm tra dựa trên

sự hoạt động phóng xạ trong cùng một thể tích của pha mang được hút ra Sự khác biệt giữa 2 giá trị thực sự đã phản ánh được hoạt động phóng xạ vượt mức tồn tại ở bề mặt tiếp xúc, được quy cho phân tử enzym có liên kết với

màng film Bởi vì có thể sử dụng kỹ thuật lớp đơn để đo tốc độ phản ứng được thể hiện bằng đơn vị mol.cm-2.min-1 và sự vượt mức của enzym ở bề mặt bằng đơn vị mg.cm-2 Ta dễ dàng đạt được giá trị hoạt động đặc hiệu của enzym thường được đo bằng đơn vị là mol.min-1 mg -1( IU.mg-1)

Bằng cách kết hợp đồng thời 2 kĩ thuật ELISA và kĩ thuật lớp đơn phân tử, ta

có thể đo được hoạt tính của enzym lipase trong đường ruột của người ( HGL-Human gastric lipase) Trên lớp màng 1,2 didecanoyl-sn-glycerol (lớp dicaprin) và cũng có thể xác định được sự vượt mức của enzym bề mặt tương ứng Một lượng HGL luân chuyển sẽ gia tăng một cách ổn định với màng bao lipit Những hoạt tính đặc hiệu được xác định trên lớp dicaprin tại 35mN.m-1

đã được tìm thấy ở cùng một mức độ giá trị khi được đo dưới điều kiện phân tích khối lớn tối ưu, sử dụng cơ chất là chất nhũ hoá tributyrin (liều lượng là 1000IU cho 1mg enzym) Tại một nồng độ lipase cho trước trong pha mang nước, sự liên kết bề mặt của các HGL với lớp màng phosphatidylcholine ưa béo của lòng đỏ trứng đã được nhận ra rằng chậm hơn 10 lần so với trường hợp của lớp màng dicaprin

Tuy nhiên, chúng ta phải lưu ý rằng những phân tử enzym được liên kết bề mặt không chỉ bao gồm những enzym đó ( là những enzym liên quan trực tiếp đến sự xúc tác) mà còn một lượng Protein không đoán được (được hấp phụ lên lớp đơn) Những enzym này không liên quan đến sự thuỷ phân enzym của lớp

II.4 Phương pháp hiển vi lực nguyên tử (Atomic force microscopy):

Để theo dõi động học của sự thuỷ phân của màng phospholipids kép bằng phospholipase A2, Nielsen đã làm một thí nghiệm sử dụng phương pháp hiển

vi lực nguyên tử (AFM) trong môi trường chất lỏng Theo những nghiên cứu này thì sự thuỷ phân enzym của màng acylglycerols/phospholipids kép bằng

enzym Humicola lanuginosa lipase (HLL) cũng đã được nghiên cứu bằng

phương pháp AFM Màng lipit kép củng cố bởi Mica bị thuỷ phân bởi HLL

và vì sản phẩm hoà tan trong dung dịch đệm, các khu vực bị khoét sâu của màng kép sẽ bị phát hiện ra bởi đỉnh AFM Húng ta sẽ có được những hình ảnh thời gian thực của sự thuỷ phân xuất hiện ở lớp màng kép và sẽ phân tích chúng bằng phần mềm đã được thiết lập sẵn Những hình ảnh này sẽ chỉ ra được sự xuất hiện của vết lõm tại bề mặt ở mức xấp xỉ 10-9 một cách gia tăng dần Thêm vào đó, sự gia tăng diện tích của lỗ hổng ở lớp màng kép lipit mà được ghi nhận như là chức năng thời gian và hoạt tính đặc hiệu của enzym sẽ được đánh giá với điều kiện một phân tử lipase sẽ hoạt động trong 1 lỗ Kết quả được sử dụng để làm mẫu cho động học của phản ứng enzym tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha béo-nước Dữ liệu này cung cấp hình ảnh đầu tiên ở tầm Nano của động học quá trình phân giải lipit

II.5 Quang phổ học hồng ngoại:

Một phân tích liên tục để đo sự thủy phân của những TAG do lipase xúc tác micell đảo ngược sử dụng Fourier thay đổi quang phổ học hồng ngoại (FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy), được phát triển bởi Walde và Luisi [80] Sự phân hủy chất béo có thể được theo dõi bằng việc ghi lại phổ FTIR của toàn bộ hỗn hợp phản ứng Số lượng những ester axit béo và FFAs (

mà cực đại đỉnh tương ứng tại 1751cm-1 và tại 1715 cm-1 ) có thể dựa trên cơ

sở của những hệ số tắt và định luật của Beer Phương pháp này được ứng dụng để đo sự phân hủy chất béo của những cơ chất khác nhau ( như trioctanoyglycerol, các loại dầu thực vật )

III Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân:

III.1 Sự giải phóng Proton như một phép phân tích gián tiếp:

III.1.1 Những chất chỉ thị màu:

a) Trong môi trường rắn: Khi dung dịch lipase được đặt trên một đĩa agar chứa ester carboxylic như một cơ chất, có thể theo dõi độ pH bằng việc quan sát sự thay đổi màu của những chất chỉ thị (do những axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân gây ra) mà trước đó đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel agar.Ở đây tồn tại một mối quan hệ tuyến tính giữa đường kính của đốm ( vị trí ) khuyếch tán axit béo và logarit của vùng phân bố enzym Kỹ thuật này rất tiện lợi trong việc sàng lọc nhanh chóng những vi sinh vật phân hủy lipid phát triển trên những đĩa agar Tuy nhiên một vài sai sót có thể là kết quả từ quá trình axit hóa của môi trường, vì sự phát sinh của những chất chuyển hóa axit khác với FFAs mà được giải phóng bởi những vi khuẩn lipase

b) Trong môi trường chất lỏng: mặc dù đây là một phương pháp định tính, kỹ thuật này cung cấp một phương tiện đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần nhỏ cột ghi sắc kí tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát những thay đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều với những cơ chất ester

Một phương pháp định tính đơn giản hơn mà dựa vào sự phát hiện những đặc trưng mạnh mẽ về mùi của axit butyric và axit caproic, chúng có mùi của những giọt sữa đã bị thủy phân mà được dùng như một cơ chất lipase

III.1.2 Phép chuẩn độ:

Phương pháp pH-stat nổi tiếng (Fig 2) nói chung đã được sử dụng như một phép phân tích enzym lipase khác [82,83] Đây là một kỹ thuật tiện lợi để mô

tả đặc điểm và sự đặc biệt của lipase cũng như hiện tượng kích hoạt bề mặt tiếp xúc giữa các pha

Với phương pháp pH-stat, hoạt động của lipase được đo trên một máy khuấy trộn hệ nhũ tương của những TAGs tự nhiên hay chất tổng hợp bằng việc trung hòa FFAs được giải phóng theo thời gian bởi sự thêm vào chất chuẩn độ NaOH để duy trì độ pH tại một giá trị điểm cuối không đổi Thiết bị pH-stat có sẵn đã được sản xuất thương mại như bức xạ kế (Copenhagen,Denmark ) hoặc Metrohm Ltd (Herisau, Switzerland )

Trong trường hợp đặc biệt của lipase/colipase tụy tạng phức tạp, sự phân tích thường chung nhất là được thực hiện trong một máy điều nhiệt (ở 37oC) bình phản ứng hiện chứa đựng 0.5ml tributyrin trong 5ml dung dịch đệm có chứa nước ( có pH = 8 ), trong đó không có mặt của bất kỳ chất hoạt động bề mặt hay hệ nhũ tương nào khác

Thông thường, tributyrin đơn giản được nhũ tương hóa tại chỗ bởi sự kích thích khuấy trộn cơ học hiệu quả trong bình pH-stat Hiệu quả của dịch đồng nhất tuần hoàn của dầu oliu được nhũ tương hóa với keo arabic đã được chỉ

ra để cải thiện độ nhạy của phép phân tích Phương pháp pH-stat được dùng

để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực vật, có mặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với keo arabic như cơ chất

Kỹ thuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính lipase trong huyết thanh, plasma và dịch tá tràng Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả khá chính xác (nhạy) trong giới hạn 1mol axit béo được giải phóng trong 1 phút Khi sử dụng NaOH 0.1M làm chất chuẩn

độ thì phương pháp này không đáng tin cậy trong việc nhận biết được mức độ hoạt động nhỏ hơn 0.1 mol/phút Ngoài tính nhạy thấp của nó, nhược diểm của phương pháp pH-stat là vùng phân bố hẹp của những giá trị pH mà có thể được nghiên cứu tìm hiểu Đặc biệt hơn, sự phát hiện những Proton được giải phóng trong suốt thời gian phản ứng thủy phân mà được xúc tác bởi những enzym lipase thì cần có quá trình ion hóa một phần những axit béo được giải phóng Bởi vậy, những giá trị pH của điểm cuối của môi trường phản ứng phải gần bằng nhau, hoặc cao hơn, thích hợp hơn giá trị pKa hiển thị của axit béo được giải phóng Điều này đã được tường trình bởi Benzonana và Desnuelle mà giá trị pKa hiển thị của axit oleic có thể cao đúng 7.5 trong những điều kiện phân tích của lipase [93] Hơn nữa, nên chú ý rằng: khả năng ion hóa cũng như sự có mặt của những ion Canxi sẽ làm giảm đáng kể sự chính xác của những giá trị pKa hiển thị Sự có mặt của những ion Ca2+ có ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả ion hoá của những axit béo mạch dài Hiện tượng kết tủa vi mô này điều khiển cân bằng hóa học bằng định luật hoạt động khối lượng

Nếu tại giá trị pH được chọn, FFAs không hoàn tòan bị ion hóa, sự chuẩn độ liên tục của họ cũng không chính xác hoặc không thể thực hiện được, thậm chí sau khi đã có một hệ số hiệu chỉnh Sự chuẩn độ ngược (a back-titration ) phải được thực hiện, như trong trường hợp của HGL, hoạt động trong những điều kiện pH axit Bởi vậy, hoạt động HGL được đo bằng việc ủ ấm dung dịch enzym với hệ nhũ tương TAG trong vài phút ở pH = 3 Sự giải phóng

FFAs không được ion hóa thì được chuẩn độ ngược ở cuối phản ứng bằng việc chuyển dịch nhanh độ pH từ 3 đến 9

III.2.Phương pháp Fluorimatric ( đo sự phát hùynh quang ) dựa vào những ester Umbelliferyl:

Một phương pháp mới Fluorimatric để đo hoạt tính lipase đã được mô tả Hỗn hợp hùynh quang umbelliferone (UMB) được ester hóa với những axit báo no và không no có chiều dài mạch carbon khác nhau, và sử dụng cơ chất

là những ester không hùynh quang để đo hoạt tính của 2 loại enzym lipase

được làm sạch từ 2 chủng Rhizopus delemar và Candida cylindracea Cường

độ huỳnh quang của UMB do các chất được giải phóng bởi sự thủy phân cơ chất đã cho một dấu hiệu về hoạt động của lipase với những ester tương ứng UMB được tìm thấy có phần nhạy và ổn định hơn so với 4-methylumbelliferone (4-MU) đã được sử dụng trước đây Phương pháp có độ nhạy cao ( nmoles UMB/ml/hr) được mô tả ở đây đã được kiểm tra trên 5