Tổng quan về ENZYM LIPASE

Tổng quan về ENZYM LIPASE

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ ĐẶC ĐIỂM CỦA ENZYM

LIPASE

1 Định nghĩa Lipase

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3)

 Là enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol ( dầu thực vật, mỡ động vật ) tạo thành glixerin và axit béo tương ứng Lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng liên kết α - ester trong phân tử chứ

không phải c ắt đứt cả 3 liên kết ester cùng lúc

 Có hoạt tính mạnh đối với cơ chất không tan trong nước, thể hiện hoạt tính bề mặt

 Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo (nước trong dầu)

2 Phân loại và cấu trúc của lipase

2.1 Phân loại

 Theo nguồn gốc:

 Lipase từ động vật : thu nhận thường khó và hiệu quả kinh tế không cao

 Lipase từ thực vật

 Lipase từ vi sinh vật : vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzym với quy mô công nghiệp lớn, đồng thời việc thu nhận chế phẩm cũng dễ dàng và có thể thoã mãn trong 1 mức độ lớn nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau

C rugosa (C18:1 cis-9)

A niger (C10 và C12 hoặc C18:1 cis-9)

M miehei (C12)

G Candidum đặc hiệu với γ-linolenate trong dầu cây borage và axit

eruic từ dầu hạt nho.v.v

o Bertolini nhân hai giống lipase vô tính I và II từ chủng G candidum

ATCC 34614

o Loại I đặc hiệu với axit béo không no nối đôi vị trí cis-9

o Loại II đặc hiệu với các cơ chất có chuỗi acyl từ C8-C14

o Yuzo và các đồng sự báo cáo về tính đặc hiệu của hai loại lipase từ

chủng Pseudomonas (lipase HU 308 và AK 102) đối với các axit béo

C20 nối đôi vị trí delta 5

o Sự thay đổi hàm lượng axit béo C20 trong axit béo phân đoạn tách ra trong suốt quá trình thủy phân dầu giàu PUFA bằng lipase

2.2 Cấu trúc của lipase

Lipase từ động vật

 Cấu tạo lipase tuyến tụy từ người gồm hai tiểu phần, phần lớn hơn chứa ù đuôi N, phần nhỏ hơn chứa đuôi C

 Nhân của tiểu phần đuôi N hình thành bởi 9 sợi xếp song song trên mặt phẳng gấp nếp β

 Tiểu phần C hình thành bởi hai lớp mặt phẳng không song song

 Tiểu phần N chứa trung tâm hoạt động, liên kết với nhóm glycosyl, liên kết với Ca2+ và có thể liên kết với heparin

 Trung tâm hoạt động bị che dưới các vòng xoắn α mạch ngắn gọi là các nắp hay nút đậy

 Lipase từ nấm

 Không có sự tương đồng cấu trúc với lipase tuyến tụy ngoài mối liên hệ chuỗi Gly-X-Ser-X-Gly có liên hệ với trung tâm hoạt động

 Cũng có cấu trúc nắp đậy

 Lipase từ loài Bacillus

 Có khối lượng phân tử khoảng 19kDa

 Chuỗi A-X-S-X-G liên kết với trung tâm hoạt động

3 Tính chất của enzym lipase:

 Lipase cĩ hoạt tính bề mặt ở phân pha nước/lipit và chỉ thuỷ phân chất béo

đã nhũ hố Lipase khác với ccác enzym esterase khác ở điểm, esterase chỉ thuỷ phân các ester tan trong nước như TAG

 Lipase cĩ nhiều trong sữa, các hạt cĩ dầu (đậu nành, đậu phộng), ngũ cố (lúa mạch, yến mạch), trong trái cây và rau, trong hệ thống tiêu hố của động vật

và nhiều loại vi sinh vật

 Lipase cĩ thể thuỷ phân cả 3 liên kết ester trong TAG hoặc chỉ thuỷ phân một số liên kết ester nhất định giữa gốc –OH và các gốc acyl trong phân tử acyl lipit Bảng 4.9 cho biết đặc tính đặc hiệu của một số enzym lipase

Các gốc acyl ở vị trí 1,3 Tuyến tuỵ, sữa, Pseudomonas fragi,

Penicillium roqueforti

Các gốc acyl ở vị trí 1, 2 và 3 yến mạch, hạt thầu dầu, Aspergillus flavus

Axit oleic và linoleic ở vị trí 1,2 và 3 Geotrichum candidum

Kích thước của giọt dầu trong hệ nhũ tương càng nhỏ thì tổng diện tích bề mặt phân pha dầu / nước càng lớn dẫn đến hoạt tính của lipase càng cao Lipase trong tụy heo là enzim được nghiên cứu đầy đủ nhất Nĩ cĩ MW 48kDa, khả năng thủy phân giảm dần trong dãy cơ chất : TAG > DAG >MAG

Phân tử pancreatic lipase ( lipase tuyến tụy ) cĩ đầu kỵ nước gắn với giọt dầu nhờ các tương tác kỵ nước, cịn tâm hoạt động của enzym thì gắn với phân tử cơ chất tại tâm hoạt động cĩ các axit amin Ser, His, và Asp cĩ vai trị tham gia vào việc cắt các liên kết ester ( tương tự như ở serine proteinase ) Tâm hoạt động của lipase cịn chứa nhĩm Leucine cĩ tác dụng tạo ra liên kết kỵ nước với cơ chất lipid và đặt cơ chất đúng vào vị trí tại tâm hoạt động của enzym Hoạt tính của lipase được tăng cường bởi iơn Ca2+, các axit béo tự do tạo ra sẽ kết hợp với

Ca2+ để tạo thành muối khơng tan

- Lipase của sữa cũng tương tự như lipase tuyến tụy Các lipase thu được từ vi

sinh vật thường cĩ độ bền nhiệt cao Ví dụ như lipase từ Pseudomonas

fluosescence cĩ thể khơng bị mất hoạt tính khi thanh trùng hay xử lý ở nhiệt

độ cao cũng như trong quá trình sấy Lipase này cĩ thể gây ra những hư hỏng

và làm giảm chất lượng sữa bột trong quá trình bảo quản

- Hoạt tính lipase trong thực phẩm không hoàn toàn dự đoán được độ bền của thực phẩm trong quá trình bảo quản Tính đặc hiêu cơ chất của lipase rất khác biệt nên các axit béo tự do tạo ra trong quá trình thủy phân rất khó xác định Ngưỡng giá trị cảm nhân mùi và vị của các axit béo cũng thay đổi rất khác nhau nên ảnh hưởng của lipase lên mùi của thực phẩm cũng rất khác biệt Các thông tin chính xác chỉ có được khi định lượng các axit béo tạo ra torng quá trình bảo quản bằng sắc kí khí.

Chú thích : HLL: Humicola lanuginosa

PcamL: Penicillium camembertii RDL: Rhizopus delemar

CLL: Candida lipolytica RJL: Rhizomucor javanicus ROL: Rhizopus oryzae GCL: Geotrichum candidum CRL: Candida rugosa

PCL: Pseudomonas cepacia PFL: Pseudomonas fluorescens

Tuy nhiên lipase có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so vi71 các chất xúc tác thông thường.

Khả năng xúc tác của enzym được xác định thơng qua hoạt độ hoạt động của enzym Hoạt độ hoạt động của enzym được xác định thơng qua đơn vị hoạt độ Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị sau :

a) Đơn vị enzym quốc tế (UI) là lượng enzym cĩ khả năng xúc tác làm chuyển hố được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 UI = 1µmol cơ chất (10-6 mol)/phútb) Katal (Kat) là lượng enzym cĩ khả năng xúc tác làm chuyển hố được 1mol

cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1 Kat = 1mol cơ chất/giây

1 UI =

10

1 10-6 Kat = 16.67 nKat (nanokatal)c) Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzym là số đơn vị UI ( hoặc số đơn vị Katal) ứng với 1ml dung dịch (nếu là dịch) hoặc 1mg Protein (nếu là bột khơ) của chế phẩm enzym

Nếu chế phẩm enzym đã tinh sạch, hoạt độ được biểu thị bằng số UI (hoặc Kat) trên 1mg enzym Khi biết được khối lượng ptử của enzym ta hồn tồn cĩ thể tính được hoạt độ riêng của phân tử

d) Hoạt độ riêng phân tử: là số phân tử cơ chất được chuyển hố bởi một phân

tử enzym trong một đơn vị thời gian

3.2 Tính đặc hiệu của enzym:

3.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng: Enzym lipase chỉ có thể xúc tác cho phản ứng thuỷ phân

3.2.2 Đặc hiệu cơ chất: Cơ chất là chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzym và bị chuyển hoá dưới tác dụng của enzym

Lipase có tính đặc hiệu tương đối : nó có khả năng tác dụng lên 1 kiểu liên kết nhất đinh trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó Lipase có khả năng thuỷ phân được tất cả các mối liên kết ester carboxylic

Cơ chế tác dụng của lipase:

Thông thường, trong phản ứng có xúc tác enzym, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzym – cơ chất mà cơ chất được hoạt hoá, bởi lẽ khi cơ chất kết hợp vào enzym do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay

đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trởø nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng

Quá trình tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản phẩm, giải phóng enzym tự do thường trải qua 3 giai đoạn :

- Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm còn ezym dc giải phóng dưới dạng tự do

• Cơ chế tác dụng của Lipase : tâm ái nhân của lipase

sẽ tương tác với 1 trong 2 nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thuỷ phân Sự tạo thành phức hợp trực tiếp như thế với trung tâm phản ứng sẽ làm cho sự đứt các liên kết và sự thuỷ phân dc dễ dàng thuận lợi

• Một cơ chế khác liên hệ tính tác dụng của ezym với

sự khuyết electron của liên lết bị thuỷ phân là : Enym làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó, bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiều gần gũi với liên kết bị thuỷ phân Nhờ vậy mà làm cho sự phân bố electron trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo 1 chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết được dễ dàng hoặc khiến cho 1 trong 2 nguyên tử của liên kết tương tác được với các tác nhân ái nhân

Dưới tác dụng của enzym lipase, khi hợp chất AB kết hợp với enzym thì liên kết A-B bị kéo căng , kèm theo sự chuyển dịch electron dẫn đến làm đứt liên kết A-B và gắn nhóm HO- của nước vào phần B của phân tử

Sau khi hoàn thành phản ứng enzym dược giải phóng dưới dạng tự do

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của enzym lipase.

 Cơ chất

 Hệ nhũ tương thường

 Hệ nhũ tương đảo

 Hệ nhũ tương nhỏ (các micell đảo)

• Liu và các đồng sự tìm ra tỷ lệ mỡ heo/tristearin 3:1 là tối ưu trong tổng hợp chất thay thế bơ cacao từ Lipozym IM-20

• Báo cáo của Ting và các đồng sự thì tỷ lệ dầu nước là 10/5 là tối ưu với hiệu suất thủy phân dầu nành là 48% với lipase cố định trên hạt chitosan bằng phương pháp BINARY

o Romija chiết xuất trong dịch gan và tuỵ tạng của lớp đầu túc như mực

(Sepiaofficinalis), bạch tuộc ( Eledne cierbosa ) được enzym lipase

xúc tác phản ứng thuỷ phân thấy pH thích hợp nhất của lipase dịch gan là 6.0, còn của dịch tuỵ tạng là 6.4

o Hykeo đã lấy dịch ruột cá vược ( perca fluviatelis ) đem thuỷ phân

tributirin thì thấy tác dụng của chúng mạnh nhất ở 25–37oC,

pH = 12.3 – 12.8

o Các nhà khoa học Nhật đã dùng dịch tuỵ tạng của tôm càng (

Squil-laoratoria ) thuỷ phân methylacetat thấy chúng hoạt động mạnh ở

38oC, pH = 7.2 với thời gian là 15h

 Chất hoạt hóa và ức chế:

Canxi ( Ca ) hoạt hóa lipase trong phản ứng thủy phân theo ba cơ chế :

 Kết hợp với enzym làm thay đổi cấu trúc

 Giúp lipase dễ dàng hấp thụ lên bề mặt cơ chất-nước

 Khử các axit béo sản phẩm của phản ứng thủy phân giảm khả năng ức chế của axit với enzym

- Muối mật hoạt hóa lipase từ tuyến tụy của người

- Một vài cơ chất ức chế như :

o Các hợp chất bề mặt có chứa anion

o Protein

o Ion kim loại

o Axit boronuc

o Các hợp chất có chứa phospho như cabarmate, β-lactone…

 Nước:

Nước không những là môi trường để khuyếch tán enzym và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng nữa Nước có ảnh hưởng không những tới vận tốc mà cả đến chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzym nữa Nước cũng là 1 yếu tố điều chỉnh các phản ứng thuỷ phân bởi enzym, có thể dùng nước làm nhân tố tăng cường hay kìm hãm các phản ứng thuỷ phân có enzym xúc tác

Ting và đồng sự báo cáo tỷ lệ dầu-nước 10/5 là tối ưu cho lipase cố định trên hạt chitosan thì cho hiệu suất phản ứng thủy phân dầu nành là cao nhất.

Liu và các đồng sự báo cáo aw tối ưu của Lipozym là 0.61 trong phản ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin Condoret và các đồng sự [8] báo cáo aw tối ưu của Lipozyme IM-20 là 0.4-0.7

 Lipase cố định và lipase tự do:

Ting và đồng sự báo cáo lipase cố định trên hạt chitosan dùng tỷ lệ cơ chất nước 10/5 có hiệu suất 48% còn lipase tự do với tỷ lệ cơ chất 10/7 có hiệu suất thấp hơn là 45% trong phản ứng thủy phân dầu nành là cao nhất

• Olivier và các đồng sự báo cáo rằng 20.1 mg lipase từ chủng

Burkholdenia (BCL) cho phản ứng chuyển hóa ester nhanh hơn khi dùng

38mg lipase đó ở dạng tự do

Một vài báo cáo về các thông số ảnh hưởng :

 Thủy phân dầu nành bằng lipase cố định bằng phương pháp BINARY trên hạt chitosan báo cáo bởi Ting và các đồng sự

 Yếu tố tỷ lệ dầu nước (10/5)

Tỷ lệ nước (w/w)

dầu-Biến đổi nhờ lipase tự do (%)

Biến đổi nhờ lipase

cố định (%)

10:1 33.10 38.58

 Động lực học phản ứng thủy phân

V max (U/mg-protein) K m (mg)

Lipase cố định 254 1841

Liu và các đồng sự báo cáo ứng dụng lipase trong tổng hợp chất thay thế bơ cacao từ mỡ heo và tristearin bằng phản ứng chuyển hóa ester trong hệ thống

CO2 siêu tới hạn và ảnh hưởng của các thông số

 Cơ chất tối ưu (mỡ heo và tristearin)

 Thời gian tối ưu (3h)

Thời gian phản ứng

(h) Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %)

1 23.8 ± 0.7 36.9 ± 1.4 18.3 ± 1.2 12.3 ± 1.1 8.7 ± 1.0

3 23.0 ± 0.4 39.9 ± 1.2 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.5 7.8 ± 0.7

7 24.0 ± 1.1 38.4 ± 1.9 15.6 ± 1.2 14.0 ± 1.8 8.0 ± 1.9

Nguồn dầu Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %)

Thanh phần dầu ban đầu

 Aùp suất tối ưu ( 17 Mpa )

Aùp suất phản ứng

(MPa) Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %)

10 23.0 ± 0.4 39.9 ± 1.2 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.5 7.8 ± 0.7

17 22.6 ± 0.4 38.5 ± 0.9 14.9 ± 0.2 15.1 ± 0.4 8.9 ± 1.3

24 22.3 ± 2.0 39.7 ± 2.1 12.9 ± 0.8 16.6 ± 2.2 8.5 ± 1.2

 Nguồn cho nhóm acyl:

Nguồn cho nhóm acyl Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %)

Stearic acid 34.5 ± 1.6 34.5 ± 1.2 20.0 ± 1.2 6.3 ± 0.9 4.7 ± 0.7Stearic acid ethyl ester 34.8 ± 1.3 34.9 ± 1.3 18.3 ± 1.2 7.4 ± 0.7 4.6 ± 1.0Stearic anhydride 32.0 ± 1.3 34.8 ± 1.0 18.1 ± 1.5 7.7 ± 0.7 7.4 ± 1.1

Tristearin 22.6 ± 0.4 38.5 ± 0.9 14.9 ± 0.2 15.1 ± 0.4 8.9 ± 1.3

Nhiệt độ tối ưu (500C)

Nhiệt độ phản

ứng (oC) Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %)

40 26.3 ± 0.5 36.0 ± 1.0 19.4 ± 0.1 11.3 ± 0.5 7.0 ± 1.0

50 22.6 ± 0.4 38.5 ± 0.9 14.9 ± 0.2 15.1 ± 0.4 8.9 ± 1.3

60 23.7 ± 1.6 38.5 ± 1.0 14.7 ± 0.5 14.7 ± 0.4 8.4 ± 0.8

 Tỷ lệ mỡ heo và tristearin tối ưu (1.4):

Mỡ heo/triesterate Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %)

8.6 27.3 ± 0.4 32.3 ± 1.3 25.9 ± 1.4 6.6 ± 0.3 7.9 ± 0.3 5.7 26.3 ± 0.6 35.5 ± 0.6 21.2 ± 0.9 9.0 ± 0.6 8.0 ± 0.6 2.9 22.6 ± 0.4 38.5 ± 0.9 14.9 ± 0.2 15.1 ± 0.4 8.9 ± 0.3 1.4 17.8 ± 0.3 40.8 ± 1.0 10.2 ± 0.3 23.2 ± 0.8 8.0 ± 0.2 1.0 13.7 ± 0.6 41.0 ± 1.1 7.3 ± 0.4 30.2 ± 1.5 7.8 ± 0.5

• Hoạt độ nước aw tối ưu (0.61)

• pH tối ưu (pH=9)

• Năng suất thu hồi bơ cacao

Loại dầu Hiệu suất (%) Nhiệt độ nóng chảy (0 C)

Chuù thích: POL = palmito oleo linolein

POS = palmito oleo stearin SOS = stearin oleo stearin SOO = stearin oleo olein

TRÌNH THU NHẬN

1 Nguồn nguyên liệu :

Vì enzym là những xúc tác sinh học phổ biến trong thiêên nhiên nên người ta thường thu chúng từ các vật liệu sinh học

Trong tay con người có 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản : các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tuỵ, màng nhầy, dạ dày, tim… những phế liệu của công nghiệp thịt va thuỷ sản dùng để tách enzym rất tiện Dịch tuỵ ngoài chứa lipase còn có chứa amilase, protease và 1 số enzym khác

Trong phạm vi bài báo cáo này với mục tiêêu tận dụng phế liệu, ta nghiên cứu nguồn nguyên liệu từ tuyến tuỵ của động vật Tuỵ heo, bò… được lấy ngay sau khi con vật bị giết hay đã được bảo quản ở nhiệt độ đông đá Trước khi tách chiết để thu nhận enzym, phần tuỵ phải đươc loại bỏ mô liên kết và xay nhỏ bằng máy xay đồng hoá (Nguồn thu enzym lipase từ tuỵ tạng heo là tốt nhất Lượng enzym lipase chiếm 2.5% chất khô của tuyến tuỵ ( đã loại bỏ mỡ )).Trong cơ thể vi sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân, microxom, mitokondri…) của tế bào Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử (mitokondri) của tế bào Do đó, để có thể chiết rút enzym nội bào, trước hết cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học (nghiền với bột thuỷ tinh hoặc làm đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá) bằng tác dụng của các dung môi hữu cơ (rượu butylic, axeton, glixerin, etylaxetat…), của sóng siêu âm… Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính

 Đặc điểm nguồn thu nhận enzym từ tuỵ tạng :

Cấu tạo : Tuỵ tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng Chiều dài của tuỵ tạng heo khoảng 30 – 35cm, dày 1cm và nặng khoảng 80 – 150g Tận cùng bên phải là phần đầu, lớn hơn và hướng xuống, tận cùng bên trái là phần đuôi, nhỏ hơn , nằm ngang ở gần lá lách Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tuỵ tạng thành nhiều thuỳ nhỏ Tuỵ tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết

Tuỵ tạng được cấu tạo từ 2 loại tế bào gọi là tế bào ngoại tiết và tế bào nội tiết 98% tuỵ tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hay là tế bào tuyến,