Tổng quan về enzym protease

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4]. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% [6]. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau: - Phương pháp kết tủa - Phương pháp sắc ký - Phương pháp phân tách hệ hai pha nước Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống.

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4]

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải

là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% [6] Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau:

- Phương pháp kết tủa

- Phương pháp sắc ký

- Phương pháp phân tách hê ̣ hai pha nước

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống

Chương 1:

TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE

1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme

1.1.1 Vấn đề nghiên cứu enzyme ở nước ta

Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố định trên cột Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo

ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà Đây là một đóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta

1.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là

mô ̣t trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) [4]

1.2 Tổng quan về enzyme Protease

1.2.1 Giới thiệu chung

Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ

quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết

hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau

về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Protease

1.2.2 Phân loại Protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Hình 1.3 Sơ đồ phân loa ̣i protease

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đươ ̣c phân chia thành hai loa ̣i:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide

để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở

pH trung tính.

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

Chương 2:

NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE

2.1 Nguồn động vật:

- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất

- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+ Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus

2.2 Nguồn thực vật:

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từ nhựa của

lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này

là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá Ficin thu được từ nhựa cây cọ

(Ficus carica) Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên.

Hình 2.1 Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật

2.3 Nguồn vi sinh vật:

Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men

ϖ Vi khuẩn

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6]

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc

exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6]

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoa ̣t động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm Chúng được sinh ra nhiều bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Hình 2.2 Clostridium

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12

Hình 2.3 Bacillus

ϖ Nấm

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát

Hình 2.4 Nấm mốc

ϖ Xạ khuẩn

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm

mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S Trerimosus

Hình 2.5 Xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ S fradiae cũng có hoa ̣t tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide định trước Yếu

tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau:

• Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm

• Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng

và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

• Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sản xuất Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó

Chương 3:

THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT 3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật

Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn

Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu

Hình 3.1 Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme

3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao

Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập

từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu

3.1.1.1 Phương pháp gây đột biến

Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:

¬ Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repressor hoặc tổng hợp repressor

có ái lực thấp với gene opertor

Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó¬ có thể giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược

Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì có thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme

Gây đột biến ở đoạn gene hoạt hóa promotor để làm tăng áp lực của nó¬ đối với ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã…Dùng biện pháp này có thể làm tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần

Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lồi” một bazo khi tái tạo phân tử ADN

Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ) hay hóa học (các hóa chất) tác dụng lên tế bào sinh vật

3.1.1.2 Phương pháp biến nạp

Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi vi sinh vật dưới ảnh hưởng của ADN trong dịch chiết nhận nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác Ở đây yếu tố biến nạp là AND

Sự chuyển vật liệu di truyền (ADN) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào

Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chớ không đòi hỏi phải là ADN từ các giống

họ hàng Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn ADN nhất định, thường không quá

10 đoạn Các đoạn ADN được di truyền trong biến nạp có M=106-107 và phải có cấu trúc xoắn kép Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loài vi khuẩn như: Diplococus,

Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas

3.1.1.3 Phương pháp tiếp hợp gene

Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được truyền từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp thì sẽ không

có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa Hiện nay quá trình tiếp hợp gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa

3.1.1.4 Phương pháp tải nạp

Vật liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage) Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận Do đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận

3.1.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo quản giống Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu

• Phương pháp cấy chuyền

Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-40C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc

mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được) Nếu là

xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng

Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý

Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc

Hình 3.2 Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch

• Phương pháp làm khô

Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận) Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1 năm

Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền Tuy nhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn

• Phương pháp đông khô

Hình 3.3 Đông khô vi sinh vật

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng

dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật.

• Phương pháp bảo quản lạnh sâu:

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C)

Hình 3.4 Bảo quản lạnh sâu

Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản

và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO

(dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn

cả Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi

ro như cháy nổ Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô

Hình 3.5 Bảo quản trong nitơ lỏng

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải

có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe,

K và các chất vi lượng khác

3.1.3.1 Nguồn cacbon

Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzyme

và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp

Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp proteinase của nấm mốc có thể theo thứ tự:

Đối với Asp flavus 74: fructoza→ glucoza→ sacaroza→ ramnoza→ manoza→

galactoza→ arabinora→ lactoza

Đối với Asp awamori 200: fructoza→ manit→ sacaroza→ arabinoza→ manoza→

galactoza→ lactoza

Đối với Asp oryzae 79: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza

Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease Ví dụ:

Vi khuẩn Bac Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Protease ở môi trường tinh bột >8% Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25- 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu tăng nồng độ tinh bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính Tỷ số giữa cacbon và nitơ cần phải là 4: 1 Trên môi trường

có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng tổng hợp protease ngoại bào

bị ức chế Xạ khuẩn không phát triển được ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza hoặc arabinoza Glucoza, manoza, fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2- 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme

Ngoài ra một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi sinh vật Chẳng hạn chủng Ps Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n- parafin với 12, 14 và 16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol Chúng không chỉ đồng hoá được cả hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm

3.1.3.2 Nguồn nito

Nguồn nito sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ

Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao Trên môi trường kzapek NaNO3 được thay bằng cả cazein hoạt lực protease của nấm mốc được tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ Cho thêm vào môi trường có cám

mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22- 74% Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có B subtilis và B mesentericus, các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả Những muối khác NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt lực protease tới 30- 50% , còn amylaza giảm 7- 10 lần Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực protease và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương

Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm ứng để sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất

Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A oryzae 132- 63 tới 7- 24% Nhiều axit amin

có tác dụng ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin, axit glutamic, izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B megaterium 60% Còn đối với B subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metionin, axit glutamic, alanin, lơxin,…

Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và