Gốc tự do, nguyên nhân sinh ra gốc tự do và các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1.Gốc tự 1.Định nghĩa: 2.Nguyên nhân sinh gốc tự do: .4 3.Các loại gốc tự 1.Các loại gốc tự (ROS) .5 2.Các loại gốc tự (RNS): 4.Tác hại gốc tự .9 2.Hoạt tính chống oxi hóa 12 1.Hoạt chất chống oxy hóa .12 1.Khái niệm 12 2.Cơ chế chất chống oxi hóa 12 3.Phân loại chất chống oxy hóa (antioxidant) (15) 12 4.Phân loại chất chống oxi hóa thực phẩm 14 2.Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 14 1.Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH(16,17,18,19,20) 14 2.Phương pháp thu hoạt tính ức chế gốc tự NO(19,21) 17 3.Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) (22,27) .19 4.Phương pháp đo MDA (23,24) .21 5.Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng dịch trích từ thực vật (24) 22 6.Phương pháp ORAC (25) .23 7.Phương pháp FRAP (24,26) 26 8.Phương pháp TRAP (26) 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 LỜI MỞ ĐẦU Như biết: Oxy phần tử bắt buộc sống, hệ thống sống tiến hóa để tồn diện phân tử oxy hầu hết hệ thống sinh học Tính chất oxy hóa oxy đóng vai trò quan trọng tượng đa dạng sinh học Oxy có tính hai lưỡi, phần thiết yếu cho sống; làm trầm trọng thêm thiệt hại bên tế bào kiện oxy hóa Các gốc tự hay nói xác chất hoạt động chứa oxy(reactive oxygen species-ROS) dẫn xuất dạng khử oxy Các gốc tự nguyên nhân gây tổn thương dẫn tới bệnh nguy hiểm cho người Khoảng vài chục năm đây, xu hướng nghiên cứu gốc tự chất chống oxi hóa ngày trọng nhiều ngành Y, Dược Sinh học Gốc tự gia tăng mức nguyên nhân phát sinh bệnh tật có 60 loại bệnh người có liên quan đến gốc tự Nhiều loại thuốc chất chống oxi hóa có khả loại bỏ gốc tự dùng để dự phòng điều trị bệnh viêm nhiễm, bệnh tim mạch, ung thư, lão hóa… Theo tiến sĩ Bruce Ames Đại học Berkley, California tế bào đơn lẻ thể ngày phải chịu khoảng 10.000 cú công Rất nhiều công số nhắm vào DNA, việc đưa đến hậu làm gia tăng tốc độ biến đổi gen, từ dẫn đến biến đổi tế bào gây nguy ung thư Ngoài ra, màng tế bào, protein mỡ bị gốc tự bắn phá gây tổn hại Gốc tự nguy hiểm để tránh gây hại gốc tự cần thiết phải loại bỏ chúng cách sử dụng chất chống ôxi hóa bổ sung vitamin A, vitamin C, vitamin E, polyphenol,… Chất chống oxi hóa loại phụ gia giúp ngăn chặn làm chậm trình oxi hóa chất khác Chất chống oxi hóa ngăn trình phá hủy cách khử gốc tự do, kìm hãm oxi hóa cách oxi hóa chúng Chất chống oxi hóa làm giảm tác dụng cách trình oxi hóa nguy hiểm cách liên kết với với phân tử có hại, giảm sức mạnh hủy diệt chúng Nhận thấy nguy hiểm gốc tự để hiểu rõ nhóm em nghiên cứu đề tài: ‘‘Các gốc tự do, nguyên nhân sinh gốc tự phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa’’ Với hiểu biết hạn chế nên trình làm tiểu luận không tránh khỏi sai sót nên nhóm em mong nhận thông cảm góp ý Thầy để tốt trình học tập Gốc tự Định nghĩa: Gốc tự nguyên tử, phân tử ion có điện tử lẻ đôi vòng nên mang điện tích âm có khả ôxy hóa tế bào, phân tử, nguyên tử khác Các gốc tự liên quan đến nhiều phản ứng mô sống với vai trò chất trung gian có hoạt tính mạnh thời gian ngắn, ví dụ tượng quang hợp Do bị điện tử nên gốc tự không ổn định có xu hướng chiếm đoạt điện tử từ cấu trúc lân cận, tạo hàng loạt gốc tự Quá trình diễn theo phản ứng dây chuyền, gây tổn thương màng tế bào, phân tử protein ADN Hậu xuất biến đổi làm tổn hại, rối loạn chức năng, chí gây chết tế bào (1) Mỗi ngày tế bào phải hứng chịu 10.000 đợt công gốc tự Và suốt 70 năm đời, phải liên tục chống chọi với 17 gốc tự Nguyên nhân sinh gốc tự do: Nguồn gốc hình thành gốc tự (OH., O2.-, NO.,…) tia UV, xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, cháy, căng thẳng,… Các gốc tự nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… dẫn tới bệnh nguy hiểm ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch…Do đó, để tránh gây hại gốc tự cần thiết phải loại bỏ chúng cách sử dụng chất chống ôxi hóa bổ sung Vitamin A, vitamin C, vitamin E, polyphenol,… Gốc tự hình thành từ hai nguồn, nguồn nội sinh nguồn ngoại sinh.(2,3) + Ở nguồn nội sinh, gốc tự hình thành: - Từ chuỗi chuyền điện tử ty thể (các phản ứng phosphoryl oxy hóa mitochondria): superoxide anion (O2●), peroxynitrate (ONO-), hydrogen peroxide (H2O2), gốc hydroxyl (●OH) - Từ hoạt động hô hấp leucocyte, gốc tự hình thành để giết vi khuẩn - Từ trình tự chết tế bào (apoptosis): in vitro, người ta thấy chất oxy hóa nội sinh AXO ngăn trở apoptosis + Ở nguồn ngoại sinh, gốc tự hình thành từ khí ozone, xạ tử ngoại, khói thuốc lá.(3) Các loại gốc tự Các loại gốc tự (ROS) ROS sản phẩm chuyển hóa tự nhiên thể đóng vai trò quan trọng liên lạc tế bào cân nội môi Tuy nhiên, thời gian bị tác động stress từ môi trường (như UV hay tiếp xúc với nhiệt độ cao,…), nồng độ ROS tăng lên cách đột ngột Nó làm tổn thương cấu trúc tế bào Đó gọi stress oxi hóa (oxidative stress) ROS ngoại sinh tạo thành xạ ion hóa.(4) * ROS ngoại sinh ROS ngoại sinh tạo từ chất ô nhiễm, thuốc lá, khói bụi, chất độc hóa học phóng xạ Các phóng xạ ion hóa phản ứng với nước gây nên tổn thương cho sinh vật, trình gọi phân ly phóng xạ Vì nước chiếm tới 55-60% thể nên khả xảy phân ly phóng xạ cao trường hợp có diện phóng xạ ion hóa Trong trình này, nước bị electron trở nên hoạt động Và sau chuỗi phản ứng bước, nước chuyển thành gốc hydroxy (OH), hydrogen peroxide (H2O2), gốc superoxide (O2-) oxygen phân tử (O2) Gốc hydroxy hoạt động, di chuyển electron phân tử nằm đường nó, chuyển phân tử thành gốc tự hoạt hóa chuỗi phản ứng tiếp tục hydrogen peroxide nguy hiểm với DNA gốc hydroxy khả hoạt động thấp cho phép có đủ thời gian phân tử di chuyển vào nhân, sau tiến hành phá hủy đại phân tư DNA.(5) * ROS nội sinh ROS nội bào sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, nguồn gồm có ti thể, peroxisome, hệ võng nội bào phức hợp NADPH oxidase (NOX) màng tế bào Ti thể sản xuất lượng cho tế bào, adenosine triphotphate (ATP) Quá trình sản xuất ATP gọi phosphorin hóa oxide hóa, gồm có chuỗi vận chuyển proton (ion hydrogen) xuyên màng ti thể, gọi chuỗi truyền electron Trong chuỗi vận chuyển electron, electron truyền qua chuỗi protein thông qua phản ứng oxi hóa – khử mà chất nhận sau lại có tình khử lớn chất trước Chất nhận electron cuối oxygen Trong điều kiện bình thường, oxigen bị khử để tạo thành nước; nhiên, có tỉ lệ nhỏ từ 0,1% – 2% electron vượt qua chuỗi truyền điện tử (con số dựa vào kết nghiên cứu ti thể độc lập xem tỉ lệ thể sống), oxygen bị khử không hoàn toàn tạo thành gốc superoxide tự (·O 2-), đề cập đầy đủ phức hợp I phức hợp III Superoxide tự hoạt hóa, bất hoạt men đặc hiệu bắt đầu trình lipid peroxidation dạng hoạt động nó, HO2· pKa hydroperoxyl 4.8, vậy, điều kiện sinh lí bình thường, dạng tồn superoxide Nếu có nhiều tổn thương ti thể, tế bào vào trình tự chết Protein Bcl2 nằm bề mặt ti thể, phát tổn thương hoạt hóa nhóm protein có tên gọi chung Bax nằm sâu màng ti thể, gây tiết chytochrome C chất gắn với Apaf-1, hay apoptotic protease activating factor-1, chất tự bào tương Sử dụng lượng từ ATP ti thể, cytochrome C Apaf-1 kết hợp với tạo thành apoptosome Apotosome tiếp tục gắn với protein tự bào tương khác capase9 Capase-9 đâm xuyên qua protein màng ti thể, phá vỡ chúng bắt đầu chuỗi phản ứng gây biến tính protein cuối thực bào.(5) Các loại gốc tự (RNS): NO• phân tử nhỏ có chứa electron lẻ antibonding 2π * y quỹ đạo và, đó, gốc tự NO• tạo đặc biệt mô sinh học synthases oxit nitric (NOSs), chuyển hóa arginine thành citrulline với hình thành NO • qua phản ứng oxy hóa năm electron(6) Nitric oxide (NO•) phản ứng cực đoan hoạt động phân tử oxy hóa sinh học quan trọng báo hiệu phân tử có lượng lớn trình sinh lý khác nhau, bao gồm truyền dẫn thần kinh, điều chỉnh huyết áp, chế bảo vệ, thư giãn trơn điều chỉnh miễn dịch (7) Do tính chất đặc biệt nó, năm 1992, NO• đánh giá "phân tử năm" Tạp chí Khoa học(8) NO• có chu kỳ bán rã vài giây môi trường nước NO • có độ ổn định môi trường có nồng độ oxy thấp (halflife > 15 s) Tuy nhiên, kể từ hòa tan dung dịch nước môi trường lipid, dễ dàng khuyếch tán qua tế bào chất màng plasma(9) NO• có tác dụng dẫn truyền thần kinh mềm dẻo khớp thần kinh hệ thống thần kinh trung ương Trong môi trường ngoại bào, NO• phản ứng với ôxy nước để tạo thành nitrat anion nitrit Việc sản xuất mức loài nitơ phản ứng gọi căng thẳng nitrosative (10) Điều xảy hệ phản ứng loài nitơ hệ thống lớn hệ thống khả trung hòa loại bỏ chúng Căng thẳng Nitrosative dẫn đến phản ứng nitrosylation làm thay đổi cấu trúc protein ức chế chức bình thường protein Các tế bào hệ thống miễn dịch sản xuất superoxide anion oxit nitric bùng nổ oxy hóa kích hoạt suốt trình viêm Theo điều kiện, oxit nitric anion superoxide phản ứng với để tạo lượng đáng kể lượng lớn phân tử oxi hóa hoạt động, anion peroxynitrite (ONOO -), chất oxy hóa mạnh, gây phân mảnh DNA oxy hóa lipid(11): NO• + O2•- → ONOOPhản ứng có số tốc độ cao biết đến cho phản ứng • NO , 7.0 × 109M-1 s-1 Như độc tính NO • chủ yếu liên quan tới khả kết hợp với anion superoxide Nitric oxide dễ dàng liên kết với số kim loại chuyển tiếp ion; thực tế, nhiều hiệu ứng sinh lý NO• có tác dụng kết liên kết ban đầu với Fe2+ - nhóm Haem cyclase enzyme hòa tan guanylate (SGC) (12) Fe2+{sGC} + NO• → Fe2+{sGC}–NO Tác hại gốc tự Các gốc tự công vào thể vào lúc Dược sĩ Bruce Ames, Đại học California, ước lượng tế bào thể phải hứng chịu khoảng 10.000 gốc tự công ngày Trải qua 70 năm đời, thể hình thành ước chừng đến 17 gốc tự Rất nhiều số nhắm vào DNA (deoxyribonucleic acid) chất liệu di truỵền Một hậu làm tăng tỷ lệ đột biến Người già có tỷ lệ đột biến cao gấp lần so với trẻ nhỏ Chính những đột biến làm tăng tỷ lệ ung thư Thêm vào đó, gốc tự gây tổn thương cho tất chất liệu mô thể màng tế bào, protein mỡ Mô mỡ nơi bị tổn thương sớm thường gặp nhất, loại mô dễ bị oxy hóa Các chuyên gia dùng thuật ngữ “sự peroxide hóa Lipid” để mô tả oxy hóa mỡ thể Sự peroxide hóa lipid làm khởi phát chuỗi phản ứng liên tục chất mỡ bị chặn đứng chất chống oxy hóa Các gốc tự gây tổn hại cho acid nucleic (adenine, thymine, guanine cytosine), thành phần cấu trúc DNA Tổn thương làm DNA mã không xác theo thông tin sinh học – tế bào ung thư hình thành Gốc tự làm tổn thương protein, dẫn đến rối loạn chức nhiều quan thể Ví dụ như, protein collagen da, gây tổn hại da; hay enzyme (bản chất protein) bị tổn thương không hoạt động hiệu để xúc tác phản ứng sinh hóa thể Các enzyme không sửa chữa phục hồi nồng độ gốc tự cao, vòng xoắn bệnh lý làm thể lão hóa nhanh tạo ung thư Bình thường, tế bào tự chống lại ROS emzyme α-1microglobulin, superoxide dismutases, catalases, lactoperoxidases, glutathione peroxidases peroxiredoxins Một số phân tử nhỏ ascorbic acid (vitamin C), tocopherol (vitamin E), uric acid, glutathione đóng vai trò quan trọng chống oxi hóa tế bào Tương tự, chất chống oxy hóa polyphennol giúp chống lại ROS cách lọc gốc tự Ngược lại, khả chất chống oxi hóa ngoại bào lại hạn chế, ví dụ chất chống oxi hóa quan trọng huyết tương acid uric Vai trò ROS đề cập đến nhiều tài liệu, không liên quan đến chết theo chương trình tế bào mà tạo kháng thể thể khởi động bơm ion Điều làm ROS trở thành chất kiểm soát chức tế bào Đặc biệt, tiểu cầu tham gia vào việc làm lành vết thương trì cân máu tiết ROS để tạo thêm tiểu cầu vị trí vết thương Chúng nói lên liên quan đến đáp ứng miễn dịch thông qua việc tạo thêm bạch cầu ROS liên quan đến hoạt động tế bào trước đáp ứng viêm khác nhau, bao gồm bệnh lí tim mạch Chúng liên quan đến việc suy giảm chức nghe thông qua tổn thương ốc tai gây tăng tần số âm thanh, sử dụng thuốc gây độc lên tai cisplatin, tật điếc bẩm sinh người động vật ROS có dính líu đến chế gây chết tế bào theo chương trình tổn thương thiếu máu cục bộ, ví dụ đột quỵ đau tim Gây tổn thương oxy hóa Ở sinh vật hiếu khí, lượng tạo thành ti thể thông qua chuỗi truyền electron Để tạo thêm lượng, ROS tạo thành, nhiên chất có khả 10 Acontrol(0 phút) = độ hấp thu mẫu đối chứng sau pha chế Acontrol(30 phút) = độ hấp thu mẫu đối chứng sau 30 phút ủ Asample(30 phút) = độ hấp thu mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ Ablank(30 phút) = độ hấp thu mẫu trắng sau 30 phút ủ Lượng mẫu cần thiết để phản ứng với nửa lượng DPPH (hay độ hấp thu 50%) gọi lượng tương đối Trolox phản ứng Khi đó, hoạt tính chống oxi hóa mẫu diễn tả thuật ngữ số micromole Trolox/100g mẫu hay đơn vị Trolox/100g hay TE/100g (TE: trolox equivalent) hay IC50 (17) Cách 2: Khả khử gốc tự DPPH xác định theo công thức sau : DPPH (%) = 100 × (ACT - ASP)/ACT Trong đó: ACT: Độ hấp thu quang học mẫu trắng không chứa dịch chiết ASP: Độ hấp thu quang học mẫu có chứa dịch chiết Kết báo cáo giá trị IC50 nồng độ dịch chiết khử 50% gốc tự DPPH điều kiện xác định Giá trị IC 50 thấp hoạt tính khử gốc tự DPPH cao Cách 3: Khả chốngoxy hóa DPPH tính toán cách sử dụng phương trình sau đây: Ảnh hưởng chống oxy (%) = [1 - (Amẫu– Amẫu rỗng) / Akiểm soát] x 100 Ta có A kiểm soát độ hấp thụ chất kiểm soát (dung dịch DPPH không mẫu),A mẫu độ hấp thụ mẫu thử nghiệm (DPPH dung dịch cộng với mẫu thử), A mẫu rỗng độ hấpthụ mẫu (mẫu mà dung dịch DPPH) Cách 4: % ức chế gốc DPPH mẫu thực vật tính toán theo công thức Yen Dul (1994) : % Ức chế DPPH = [(AC(0) – AA(t))/AC(0)]x100 AC(0) độ hấp thu dung dịch DPPH thời điểm t = phút AA (t) độ hấp thu mẫu thử nghiệm thời t = 16 Để xác định giá trị IC50, mẫu thử pha thành nồng độ: mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml 0,03125 mg/ml Giá trị IC50 mẫu tính phương pháp hồi qui tuyến tính đồ thị biểu diễn phần trăm loại gốc tự DPPH tương ứng với nồng độ mẫu thử a Chuẩn bị dịch chiết hóa chất Hóa chất: Dung dịnh DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ) Dịch chiết: Khi tiến hành nghiên cứu đối tượng khác có lượng mẫu khác nhau, trung bình từ 1,5 -2 kg Từ nguồn mẫu lớn lấy ngẫu nhiên mẫu nhỏ từ nguyên liệu Quá trình chiết thực mẫu nhỏ, dịch chiết từ mẫu nhỏ phân tích lặp lại – lần Kết báo cáo cuối giá trị trung bình từ mẫu nhỏ dùng để đánh giá kết cho mẫu lớn Trong trình chiết, nước sử dụng làm dung môi chiết với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/15 (w/v) Nhiệt độ thời gian chiết 90C 30 phút Quá trình chiết thực bể ổn nhiệt ( Elma, S 300H, Elmasonic, Germary) Dịch lọc thu sau trình ly tâm 4C, tốc độ 5.000 rpm 15 phút ( Centrifuge, Labentech, Mega 17R, Germary ) 15 b Cách tiến hành Khoảng 20µl đến 140µl dịch chiết trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3ml Sau thêm 1ml dung dịch DPPH 0,2mM, lắc để yên bóng tối 30 phút Độ hấp thu quang học đo bước sóng 517nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia) c Quy trình Ưu điểm, hạn chế tính ổn định phương pháp DPPH a Tính ổn định DPPH phương pháp nhanh chóng, đơn giản, không tốn kém, sử dụng rộng rãi để đánh giá khả hợp chất để hoạt để đánh giá hoạt động chống oxy hóa thực phẩm Nó sử dụng để định lượng chất chống oxy hóa hệ thống sinh học phức tạp, cho mẫu rắn lỏng Phương pháp dễ dàng áp dụng để đo lường khả chống oxy hóa tổng thể hoạt động nhặt rác gốc tự trái nước rau ép Phương pháp việc thực phản ứng mẫu với DPPH methanol / nước, tạo điều kiện khai thác hợp chất chống oxy hóa từ mẫu Xác định hoạt tính chống oxy hóa loại thực phẩm sử dụng DPPH so sánh với phương pháp khác Phân tích chất chống oxy hóa phương pháp khác giới hạn hợp chất hòa tan dung môi lựa chọn b Ưu điểm DPPH phép phản ứng với toàn mẫu đủ thời gian định phương pháp cho phép DPPH để phản ứng chậm với chất chống oxy hóa yếu DPPH sử dụng dung môi hữu dung dịch nước không phân cực sử dụng để kiểm tra hai chất chống oxy hóa ưa nước ưa mỡ 16 Có độ xác cao , dễ dàng kinh tế có giá trị để đánh giá hoạt động nhặt rác triệt để chất chống oxy hóa, hợp chất ổn định không cần phải tạo c Hạn chế Do DPPH tương tác với gốc khác đường cong đáp ứng thời gian để đạt trạng thái ổn định không tuyến tính với tỷ lệ khác chất chống oxy hóa / DPPH (Brand-Williams et al 1995; Sanchez-Moreno et al 1998.) DPPH nhạy cảm với số Lewis loại dung môi oxy DPPH hòa tan dung môi hữu can thiệp hấp thụ từ hợp chất mẫu vấn đề phân tích định lượng Độ hấp thụ DPPH methanol acetone giảm ánh sáng Phương pháp DPPH có hạn chế việc phản ánh phân vùng chất chống oxy hóa hệ thống nhũ tương hữu ích để đo lường hoạt động chống oxy hóa huyết tương, protein kết tủa môi trường phản ứng có cồn Phương pháp thu hoạt tính ức chế gốc tự NO(19,21) Hóa chất – dụng cụ Dung dịch natri nitroprussid 10 mM: pha đệm phosphat pH 7.4 (20 mM) trước tiến hành thí nghiệm bảo quản chai tối màu Thuốc thử Greiss :bao gồm dung dịch A B: + Dung dịch A: sulfanilamide 2% acid phosphoric (H3PO4) 4% + Dung dịch B: N-(1-napthyl)-ethylendiamin 0.2% nước cất Hai dung dịch trộn với tỉ lệ thể tích trước thí nghiệm Quercetin hợp chất thử nghiệm cô lập từ hoa cúc trắng, độ tinh khiết chất xác định theo phương pháp HPLC Máy UV-Vis Cơ sở phương pháp Natri nitroprussid bị phân hủy ánh sáng sinh gốc tự NO Trong dung dịch nước, NO sinh phản ứng với oxy tạo thành sản phẩm bền vững nitrit nitrat Khi mẫu có hoạt chất ức chế NO, hoạt chất phản ứng cạnh tranh với oxy, kết làm giảm nồng độ nitrit tạo thành dung dịch Dựa giảm hàm lượng nitrit tạo thành mẫu có hoạt chất ức chế NO so với mẫu hoạt chất ức chế NO (mẫu control), ta tính khả ức chế gốc tự NO hoạt chất Hàm lượng nitrit tạo thành xác định dựa phản ứng lên màu với thuốc thử Greiss bước sóng 540 nm Khả ức chế gốc tự NO xác định dựa phần trăm ức chế I (%) Từ đó, ta tính giá trị IC50, đại lượng đánh giá khả ức chế mạnh hay yếu hoạt chất, IC50 (Inhibitory concentration) định nghĩa nồng độ mẫu mà ức chế 50% gốc tự NO Để có sở đánh giá hoạt tính mẫu chất khảo sát, sử dụng quercetin acid caffeic làm chất đối chứng để so sánh, chất có hoạt tính mạnh gốc tự NO sử dụng làm chất đối chứng tài liệu tham khảo 17 Chuẩn bị mẫu Hoa cúc trắng khô (2.3kg) trích hoàn lưu methanol (MeOH) 3h Sau cô quay, cao methanol (500g) chiết với hexan (127g), chloroform (21g), etylacetat (44g), butanol (88g) nước (200g) Lấy 18g cao CHCl cao EtOAc chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi MeOH-CHCl thu phân đoạn Tiếp tục sử dụng sắc ký cột sắc ký mỏng điều chế phân đoạn thu 28g hợp chất tinh khiết, chia thành nhóm là: nhóm flavonoid (1-15), nhóm dẫn xuất acid caffeoylquinic (16-22) nhóm phenol đơn giản (23-28) Công thức hợp chất trình bày sau: Mẫu cao chất hòa tan hỗn hợp dung dịch đệm phosphat pH 7.4 – etanol, nồng độ etanol cuối khoảng 2% Mỗi mẫu thử nồng độ khác nhau, đó: + Mẫu cao metanol: 200, 100, 50 25 (g/mL + Mẫu chất: 100, 50, 25, 10 (M 18 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự NO Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) (22,27) Cấu tạo Enzyme XO: Là protein dimer đồng (homodimeric protein) có phân tử lượng 300000 Da, monomer protein tổ chức gồm phần (domain) chính: phần chứa tâm Fe2S2, phần chứa tâm molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi molybdopterin, phần flavinadenine dinucleotide (FAD) Trong phần chứa Mo phần lớn trung tâm hoạt tính xúc tác enzyme, tâm Fe2S2 FAD đóng vai trò chất vận chuyển điện tử trình oxy hóa xúc tác enzyme Cơ chế hoạt động enzyme XO: Enzyme XO ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase) Enzyme XO xúc tác cho hydroxyl hóa chất khác theo phản ứng tổng quát: Cơ chế xúc tác XO cho phản ứng biến đổi màu xanthine thành acid uric Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO: Xanthine oxidase enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự O2● Acid uric có bước sóng cực đại hấp thu 290 nm Nếu mẫu thử có khả kháng enzyme XO cao hạn chế hình thành acid uric, làm giảm giá trị mật độ quang 19 Phản ứng tạo acid uric Các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa ngày sử dụng nhiều nhằm tìm hợp chất có khả ức chế gốc tự kháng trình sinh nó, hợp chất gọi chất kháng oxy hóa Chúng đƣợc sinh từ thể hệ thống kháng oxy hóa có chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò thiết yếu nhằm chống lại gốc tự độc hại sản sinh liên tục thể, chất kháng oxy hóa có phân tử lượng thấp glutathinon, vitamin E, vitamin C hợp chất có thực phẩm, rau hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin Phương pháp xác định theo Noro cộng (1983) • Thuốc thử: Đệm phosphat 70 mM (pH=7,5), xanthin oxidase 0,08 U/ml, xanthin 150 µmol, HCl 1N • Tiến hành: Hỗn hợp gồm 300 µl dung dịch mẫu, 1500 µl đệm phosphate 70 mM 100 µl xanthin oxidase 0,08 U/ml đem ủ 15 phút 250C Sau dung dịch thêm vào 900 µl dung dịch xanthin 150 µmol vào tiếp tục ủ 30 phút Sau phản ứng kết thúc HCl 1N đo mật độ đo quang bước sóng 290 nm Tính toán : Khả ức chế Khả ức chế enzym xanthin oxidase mẫu thử tính công thức: I (%) = [(Ac-As)/Ac] *100 Ac: Giá trị mật độ quang dung dịch mẫu thử As: Giá trị mật độ quang dung dịch có mẫu thử 20 Phương pháp đo MDA (23,24) MDA (Malonyl dialdehyde) sản phẩm cuối trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên áp dụng rộng rãi thực tế để nghiên cứu trình peroxy hóa lipid màng tế bào Nguyên tắc MDA sinh trình peroxy hóa lipid màng tế bào, cho phản ứng với acid thiobarbituric, phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại bước sóng 532 nm, phản ứng thực môi trường pH 2-3, nhiệt độ 90-100 độ C thời gian từ 10 đến 15 phút Dựa giảm cường độ hấp thu phức ta tính khả kháng oxy hóa chất cần nghiên cứu (3,5) Phản ứng tạo phức MDA acid thiobarbituric biểu diễn sau Cơ chế phản ứng màu MDA acid thiobarbituric Phương pháp thực theo Bagaladorov cộng (1987) • Thuốc thử: Tween 80 (1%), FeSO4 (10-3 M), acid ascorbic (10-2 M), acid trichloracetic (30%) acid thiobarbituric 0,25% • Tiến hành: Hỗn hợp dung dịch gồm ml of Tween 80 (1%), 0,2 ml FeSO4 (10-3 M), 0,2 ml acid ascorbic (10-2 M) 0,2 ml mẫu trộn đều, sau mang ủ 40oC tối thời gian 48 Kết thúc phản ứng peroxid hóa lipid cách thêm 1,3ml acid trichloracetic (30%) Hỗn hợp trộn ủ thời gian Sau đó, dung dịch ly tâm tốc độ 600 vòng/phút thời gian 10 phút ml dịch hút vào ống nghiệm nhỏ thêm vào ml acid thiobarbituric 0,25% Ống nghiệm đặt vào nước sôi khoảng 15 phút, để nguội, sau đo độ hấp thu bước sóng 532 nm Tất mẫu thực lặp lại lần • Tính toán Phần trăm ức chế peroxid hóa lipid mẫu thử tính theo công thức % ức chế = [(X– Y )/X)]x100 Với X độ hấp thu mẫu chứng (không có mẫu thử) Y độ hấp thu dung dịch phản ứng có mẫu thử nghiệm 21 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng dịch trích từ thực vật (24) Hóa chất Thuốc thử Folin-Ciocalteau (pha loãng 10 lần) Natri carbonate(Na2C03) 7,5% Chất chuẩn: gallic acid nồng độ 35 pg/L Cách tiến hành: Lấy 1ml dịch trích ly sau ly tâm cho vào ống nghiệm, thêm 2.5 ml tác nhân FolinCiocalteau Sau phút, thêm vào 2ml dung dịch Natri Carbonat 7,5% Lắc để yên cho hỗn hợp phản ứng 60 phút Sau thời gian lấy mẫu đo quang phổ bước sóng 760nm Nếu kết vượt chuẩn pha loãng mẫu nước đến nồng độ thích hợp Chuẩn bị dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn acid gallic có nồng độ dãy từ 035 pg/L Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng chứa 1ml nước cất + 2.5 ml thuốc thử Foilin + 2ml Na2CO3 7.5% Chuẩn bị mẫu đối chứng (control): mẫu đối chứng chuẩn bị tương tự mẫu thí nghiệm thay 1ml dịch trích 1ml dung môi Chú ý rằng, dịch trích pha loãng nước lần dung môi phải pha loãng nước nhiêu lần, nghĩa “hệ số pha loãng dung môi phải hệ số pha loãng dịch trích” Bảng: Phương pháp lấy mẫu đo quang bước sóng 760nm Công thức tính Từ kết đo dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn acid gallic y= f(x) với y mật độ quang, x nồng độ chất chuẩn (µg acid gallic /L) Tính độ lệch chuẩn R đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ acid gallic mẫu đo quang học M (µg acid gallic /L) Hàm lượng polyphenol nguyên liệu tính sau PP: hàm lượng polyphenol tổng nguyên liệu (µg acid gallic/g chất khô) M: hàm lượng polyphenol mẫu đo quang học (µg acid gallic /L) f: hệ số pha loãng V: thể tích dung môi dùng trích ly polyphenol (ml) m: khối lượng mẫu đem trích ly (g) W: độ ẩm mẫu (%) 22 Kết quả: Đường chuẩn xác định hàm lượng polyphenol tổng Phương pháp ORAC (25) Phương pháp đo mức độ phân hủy bị oxi hóa fluorescein có diện gốc peroxy Phản ứng điều kiện so sánh với phản ứng diện chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) diện mẫu chứa chất chống oxi hóa cần xác định hoạt tính Khi fluorescein bị oxi hóa, cường độ phát huỳnh quang giảm Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang liên tục 35 phút sau thêm chất oxi hóa vào Khi có mặt chất chống oxi hóa, phân rã fluorescein chậm Xây dựng đường cong biểu diễn phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian vùng đường cong dùng để tính toán Kết tính toán mmol Trolox/g mẫu Hóa chất thuốc thử phương pháp ORAC Công thức hóa học phần lớn hợp chất sử dụng nghiên cứu trình bày hình Chất chống oxy hóa nghiên cứu catechin (CA), epicatechin (EC), epigallocatechin gallate (EGCG), kaempferol (KAP), myricetin (MYR), resveratrol (RESV), astaxanthin (ASX) chất mua từ Tokyo Kasei Co (Tokyo, Nhật Bản) Nakalai Tesque (Kyoto, Nhật Bản) Vì lợi ích việc so sánh, sử dụng dung dịch trolox (acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetra-methylchroman-2-carboxylic), chất tan nước vitamin E, loại chất liệu tiêu chuẩn Một điều phát triển spin-trap, (cyclophosphoranyl 2,2-dimethyl-1,3-propoxy) -5-methyl-1-pyrroline N-oxide (CYPMPO) tìm thấy từ nghiên cứu gốc tự (Hino, Nhật Bản) Tiền thân gốc tự 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) mua từ Wako Chem tinh khiết (Osaka, Nhật Bản) Heptakis (2,6-di-O-methyl) -β-cyclodextrin (DM-β-CD) 23 mua từ Tokyo Kasei Chem (Tokyo, Nhật Bản) Nước tinh chế phương pháp chưng cất qua hệ thống Mili-Q (Milipore Corp Billerica MA) sử dụng dung môi Chuẩn bị mẫu xác định EPR EPR spin trapping kỹ thuật sử dụng rộng rãi sinh học gốc tự Kỹ thuật dựa phản ứng sau đây: Hợp chất hóa học gọi bẫy spin (CYPMPO hiển thị ví dụ sơ đồ trên) phản ứng với gốc tự để tạo thành hợp chất R ổn định gọi spin adduct, gốc tự Các sản phẩm cộng spin tương đối ổn định dễ dàng xác định định lượng quang phổ kế EPR Trong nghiên cứu này, gốc tự tạo từ AAPH với tia UV (5s chiếu xạ, 200 W thủy ngân arc RUF-203s, nghiên cứu gốc tự do.) vào dung dịch mẫu thiết lập hộp cộng hưởng EPR Các giải pháp mẫu có AAPH CYPMPO đệm Natriphophat (0,1 M, pH = 7,4) Kết EPR thu phổ hình Việc phân tích mô hình phổ EPR cung cấp cho việc nhận dạng gốc tự do, chiều cao tín hiệu EPR tỉ lệ với nồng độ gốc tự Cái bẫy spin chất chống oxy hóa để cạnh tranh phản ứng với gốc AAPH, từ giá trị ORAC chất chống oxy hóa tính toán 24 Cường độ tín hiệu EPR sản phẩm cộng quay diện vắng mặt chất chống oxy hóa đo để tính toán giá trị ORAC-EPR Tính toán giá trị ORAC-EPR Phương pháp spin-bẫy cạnh tranh áp dụng để đánh giá giá trị ORAC-EPR Các phản ứng cạnh tranh diễn bẫy spin chất chống oxy hóa chống lại gốc tự khả hòa tan R • sau: AAPH → R • ST + R • → ST-R (EPR hoạt động) tốc độ không đổi k ST AOX (khả hòa tan) + R • → Sản phẩm (EPR im lặng) đánh giá liên tục k AOX , nơi ST ST-R biểu thị bẫy spin sản phẩm cộng cực đoan, tương ứng Phản ứng thứ ba thể phản ứng chống lại triệt để AOX R • Một công thức đơn giản cho tính toán ORAC-EPR bắt nguồn từ phản ứng báo cáo nơi khác Tại I I0 độ cao tín hiệu quay quanh dẫn chứng ST-R diện không diện AOx, I biểu thị cho nồng độ ban đầu thành phần Độ cao tín hiệu EPR tỉ lệ thuận với nồng độ loại EPR chủ động Chúng ta giả định AOx hoàn toàn hòa tan, nồng độ AOx với nồng độ AOx hòa tan Một chất tuyến tính (I0-I)/I trái ngược so với [AOx]0/[ST]0 cung cấp độ trượt kAOx/kST tương đương với giá trị ORAC cho AOx tương quan tới ST Phương pháp kiểm tra chất chống oxy hóa trolox quy ước xem tiêu chuẩn (10-12) Như vậy, giá trị ORAC trolox với ý tới CYPMPO (ktrolox/kCYPMPO) sử dụng để thể giá trị ORAC đơn vị tương đương trolox Ưu điểm phương pháp ORAC xác định có trễ pha mẫu chứa chất chống oxi hóa Đây điều thuận lợi đo mẫu thực phẩm chứa hợp chất chống oxi hóa có tốc độ phản ứng khác nhiều (26,27) Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian 25 Phương pháp FRAP (24,26) Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa phương pháp dựa khả chất chống oxi hoá việc khử phức Fe 3+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) pH thấp Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxi hóa có nguyên liệu Mức độ tăng cường độ màu đo bước sóng 593nm so sánh với chất chuẩn dung dịch FeSO hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene) Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxi hóa, chất chống oxi hóa nhường điện tử cho phức sinh Fe 2+-TPTZ Kết tính toán mmol Fe 2+/ g chất khô Do đó, kết tính toán lớn suy đoán môi trường phản ứng đó, số lượng phân tử nhường điện tử cao Tuy nhiên, điều không hoàn toàn phân tử chất chống oxi hóa khử nhiều phức Fe 3+-TPTZ lúc Đây hạn chế phương pháp FRAP Phương pháp thực theo Benzie Strain (1996) • Thuốc thử FRAP: Dung dịch đệm acetat 300mM (pH = 3,6), 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ) 40 mM HCl, 20 mM FeCl3.6H2O nước cất Tỷ lệ thành phần thuốc thử FRAP theo thứ tự 10:1:1 theo thể tích Dung dịch thuốc thử chuẩn bị (trong ngày) • Tiến hành: 1,5 ml thuốc thử FRAP trộn với 50 µl mẫu Hỗn hợp mang ủ thời gian 1,5 h nhiệt độ 37oC đo bước sóng 593 nm Đường chuẩn dung dịch FeSO4.7H2O pha thành nồng độ 1000, 750, 500, 250, 100 μM phản ứng với thuốc thử FRAP (Hình phụ lục 1) Vitamin C sử dụng chất đối chứng Kết thể qua đơn vị đo µmol FeII/ L Tất mẫu thử thực lặp lại lần Phương pháp TRAP (26) Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl tạo thành từ 2,2’-azobis(2amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) Khi cho AAPH vào môi trường plasma, chất khử bị oxi hóa Quá trình oxi hóa đo đạt thông qua hàm lượng oxi tiêu thụ điện cực Khi có mặt chất chống oxi hóa môi trường plasma, trình oxi hóa xảy chậm Giá trị TRAP mẫu thí nghiệm tính toán dựa vào độ dài pha lag mẫu so với độ dài pha lag mẫu trắng độ dài pha lag chất chuẩn dung dịch Trolox Kết tính toán mmol Trolox/kg mẫu rắn mmol Trolox/L mẫu lỏng Hóa chất: 200 ml đệm acetate 20 ml TPTZ 20 ml FeCl3 24 ml nước cất Chuẩn bị hàng ngày, bảo quản lạnh chưa sử dụng 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO http://vi.wikipedia.org/wiki/G%E1%BB%91c_t%E1%BB%B1_do Và: Contemporary Ayurveda by H.Sharma, M.D., and C Clark, M.D (Edinburgh: Churchill Livingstone,1998) ghostwritten by Bernard D Sherman (http://bsherman.net/freeradicals.htm) http://www.freeradical.org.au/attachments/DL_2010.pdf http://www.vnua.edu.vn/khoa/cnts/index.php? option=com_content&task=view&id=1023&Itemid=129 (Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam) Wikipedia- tiếng anh Droge W.Free radical in the physiological control of cell function physiol Rev 2002 82: 47-95 Ghafourifar, P., & Cadenas, E (2005) Mitochondrial nitric oxide synthase Trends Pharmacol Sci., 26, 190–195 Bergendi, L., Benes, L., Durackova, Z.,&Ferencik, M (1999) Chemistry, physiology and pathology of free radicals Life Sci., 65, 1865–1874 Koshland, D E (1992) The molecule of the year Science, 258, 1861 Chiueh, C C (1999) Neuroprotective properties of nitric oxide Ann N.Y Acad Sci., 890, 301–311 10 Klatt, P., & Lamas, S (2000) Regulation of protein function by Sglutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress Eur J Biochem., 267, 4928–4944 11 Carr, A., McCall, M R., & Frei, B (2000) Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species-reaction pathways and antioxidant protection Arterioscl Thromb Vasc Biol., 20, 1716–1723 12 Archer, S (1993) Measurement of nitric-oxide in biological models FASEB J., 7, 349–360 13 Free radical, oxidative strees and importance of antioxidant in humam healthy ( trang 55-58) 14,15 Đàm Sao Mai, Nguyễn Thị Hoàng Yến, Bùi Đặng Khuê, Phụ Gia Thực Phẩm, NXB Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh (2011), page 81-92 16 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3551182/ 17 http://en.wikipedia.org/wiki/DPPH 18 Halliwell B, Antioxidants and human diseases: ageneral introduction, Nutrition Reviews, 55, 1997, 44-52 19 Nghiên cứu hoạt tính chống ôxi hóa độc tính tế bào số hợp chất lignan stilbene, TS Nguyễn Thị Thanh Mai, ĐH Khoa học tự nhiên Tp.HCM, trang 6,7,8 20 Hoạt tính chống oxy hóa ức chế enzyme pholyphenolloxidase số loại thực vật ăn Việt Nam, Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Bá Vương – ĐH Nha Trang năm 2013 21 Bùi Hữu Trung, Nguyễn Thị Thanh Mai, Nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính ức chế gốc tự NO với cấu trúc hoạt chất cô lập từ hoa cúc trắng, Science & Technology Development, Vol 12, No.10-2009 27 22 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816736/ Biochem Pharmacol Nov 1, 2013; 23 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles /PMC3872137/ 24 Luận văn Nghiên cứu bảo quản dầu mỡ chất chống ôxy hóa tự nhiên 25 J Clin Nutr Biochem Tháng năm 2012; Công bố trực tuyến ngày 18 tháng 11 2011 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3299942/ 26 https://vi.scribd.com/doc/105873118/ 27.Tran Quang Hieu, Nguyen Ngoc Tuan, Le Van Tan, Spectroscopy method for determination of Thorium based on azocalixarene, Asian Journal of Chemistry, Vol 23.No 4, p.1716-1718 (2011) 28 29 ... hủy diệt chúng Nhận thấy nguy hiểm gốc tự để hiểu rõ nhóm em nghiên cứu đề tài: ‘ Các gốc tự do, nguyên nhân sinh gốc tự phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa ’ Với hiểu biết hạn chế nên... acid citric + Các hợp chất gốc phenolic (cả tự nhiên lẫn tổng hợp) Ví dụ: BHA, tocopherol (15) Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH (16,17,18,19,20)... chiết khử 50% gốc tự DPPH điều kiện xác định Giá trị IC 50 thấp hoạt tính khử gốc tự DPPH cao Cách 3: Khả chốngoxy hóa DPPH tính toán cách sử dụng phương trình sau đây: Ảnh hưởng chống oxy (%) =