tách chiết và xác định hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin từ vỏ chôm chôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC TÊN ĐỀ TÀI TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA ANTHOCYANIN TỪ VỎ CHÔM CHÔM Cán hướng dẫn Sinh viên thực ThS ĐỖ TẤN KHANG HUỲNH XUÂN MỸ MSSV: 3092355 LỚP: SINH HỌC- K35 Cần Thơ, 2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Th.S Đỗ Tấn Khang Huỳnh Xuân Mỹ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình thực luận văn, em nhận quan tâm, giúp đỡ tận tình từ nhà trường, thầy cô bạn bè Em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy Đỗ Tấn Khang thầy Trần Thanh Mến tận tình hướng dẫn bổ sung kiến thức, động viên em suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô Bộ môn Sinh học- Khoa Khoa học Tự nhiên, quý thầy cô cộng tác Viện Nghiên Cứu Phát triển Công Nghệ Sinh học tận tình hướng dẫn động viên em Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Trần Văn Bé Năm anh chị cán Phòng Sinh học Phân tử, Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh học giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em trình thực luận văn Chân thành cảm ơn tập thể lớp Sinh học K35 bạn Nguyễn Ngọc Như Thanh giúp đỡ em suốt trình học tập hoàn thành luận văn Em xin kính chúc quý thầy cô bạn sinh viên lời chúc sức khỏe, thành công Huỳnh Xuân Mỹ CBHD: Th.S Đỗ Tấn Khang i SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết luận văn hoàn thành dựa kết nghiên cứu hướng dẫn thầy Đỗ Tấn Khang Các số liệu kết có luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố luận văn trước Cán hướng dẫn Sinh viên thực Th.S Đỗ Tấn Khang CBHD: Th.S Đỗ Tấn Khang Huỳnh Xuân Mỹ ii SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ I LỜI CAM KẾT II MỤC LỤC III DANH SÁCH HÌNH VII DANH SÁCH BẢNG VIII DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IX TÓM TẮT X ABSTRACT XI CHƯƠNG I GIỚI THIỆU CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU II.1 Tổng quan oxy hoá chất chống oxy hoá II.1.1 Sự oxy hoá II.1.2 Chất chống oxy hoá II.1.3 Một số chất chống oxy hoá điển hình thực vật II.1.4 Một số nghiên cứu hợp chất chống oxy hóa từ thực vật a) Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa hợp chất chống oxy hóa số thực vật ăn Thái Lan b) Xác định hoạt tính chống oxy hóa vitamin C số cao ethanol thô chiết từ thực vật phương pháp ferric thiocyanate (FTC) II.2 Tổng quan chất chống oxy hóa Anthocyanin II.2.1 Anthocyanin II.2.2 Cấu trúc hoá học Anthocyanin II.2.3 Tính chất Anthocyanin II.2.4 Sự phân bố Anthocyanin 11 II.3 Vai trò Anthocyanin thực vật sức khoẻ người 13 II.3.1 Đối với thực vật 13 II.3.2 Đối với sức khoẻ người 14 II.4 Hoạt tính chống oxy hoá Anthocyanin 15 II.4.1 Một số chế chống oxy hoá Anthocyanin 15 II.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả chống oxy hoá Anthocyanin 15 CBHD: Th.S Đỗ Tấn Khang iii SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.4.3 Một số nghiên cứu Anthocyanin từ thực vật 17 a) Chất chống oxy hóa Anthocyanin từ trái ăn 17 b) Nghiên cứu tách chiết Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus Sabdariffa- Ứng dụng để sản xuất giấy thị phát nhanh hàn the thực phẩm 17 c) Xác định hàm lượng Anthocyanin số nguyên liệu rau phương pháp pH vi sai 18 II.5 Tổng quan Chôm chôm 18 II.5.1 Giới thiệu 18 II.5.2 Thành phần hoá học 19 a) Thịt 19 b) Hạt 20 c) Vỏ Chôm chôm 20 II.5.3 Một số nghiên cứu chất chống oxy hóa vỏ Chôm chôm 20 a) Phân lập nhận danh cấu trúc hóa học hợp chất flvonoid glycoside từ vỏ trái Chôm chôm (Nephelium lappaceum L.) 20 b) Xác định hợp chất phenolic từ Chôm chôm hoạt tính chống oxy hóa chúng 20 c) Chất chống oxy hóa hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết Chôm chôm21 II.6 Một số phương pháp sàng lọc khả chống oxy hóa 22 II.6.1 Phương pháp FRAP 22 II.6.2 Phương pháp đo MDA 22 II.5.3 Phương pháp sàng lọc khả loại gốc tự DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) 23 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 III.1 Phương tiện 25 III.1.1 Địa điểm thời gian thực 25 III.1.2 Nguyên liệu 25 III.1.3 Hoá chất 25 III.1.4 Thiết bị 25 III.2 Phương pháp 26 III.2.1 Chuẩn bị hóa chất xử lí mẫu 26 CBHD: Th.S Đỗ Tấn Khang iv SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên a) Xử lí mẫu 26 b) Chuẩn bị acid gallic 26 c) Chuẩn bị DPPH 26 d) Xây dựng đường chuẩn (khảo sát nồng độ ảnh hưởng đến khả chống oxy hóa acid gallic) 27 B độ hấp thụ DPPH có acid gallic 27 e) Phương pháp DPPH (khảo sát khả chống oxy hóa dịch chiết) 27 III.2.2 Bố trí thí nghiệm 28 a) Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dung môi trình ly trích Anthocyanin 28 c) Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản trình ly trích Anthocyanin 31 d) Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng loại vỏ Chôm chôm trình ly trích Anthocyanin 32 III.3 Phân tích số liệu 33 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 IV.1 Xây dựng đường chuẩn (khảo sát khả chống oxy hóa acid gallic theo nồng độ) 34 IV.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dung môi trình ly trích Anthocyanin 36 IV.2.1 Xác định bước sóng cực đại 36 IV.2.2 Khảo sát ảnh hưởng dung môi trình ly trích Anthocyanin 36 IV.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản trình ly trích Anthocyanin 42 IV.4.1 Xác định độ ẩm mẫu 42 IV.4.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến quy trình ly trích Anthocyanin 42 IV.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng loại vỏ Chôm chôm trình ly trích Anthocyanin 44 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 CBHD: Th.S Đỗ Tấn Khang v SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên V.1 Kết luận 46 V.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 51 CBHD: Th.S Đỗ Tấn Khang vi SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên DANH SÁCH HÌNH Hình Cơ chế hoạt động chất chống oxy hoá Hình Cấu trúc số anthocyanidin tự nhiên Hình 4: Sự tạo phức cyanidin DNA 16 Hình Quả Chôm chôm 18 Hình Phản ứng FRAP 22 Hình Phản ứng trung hòa gốc DPPH 24 Hình Máy vortex 25 Hình Máy đo quang phổ (trái) máy li tâm (phải) 26 Hình 10 Quy trình so sánh hệ dung môi ly trích Anthocyanin từ vỏ Chôm chôm 29 Hình 11 Quy trình khảo sát ảnh hưởng loại acid ly trích Anthocyanin từ vỏ Chôm chôm 30 Hình 12 Quy trình khảo sát khả chống oxy hóa dịch từ hai loại mẫu tươi mẫu khô 32 Hình 13 Quy trình khảo sát khả chống oxy hóa dịch từ hai loại vỏ Chôm chôm thường chôm nhãn 33 Hình 14 Đường chuẩn acid gallic phương pháp DPPH 35 Hình 15 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi tách chiết Anthocyanin: (1) Ethanol/nước: 1/1; 1% HCl, (2) Ethanol/nước: 3/2; 1% HCl, (3) Ethanol/nước: 7/3; 1% HCl, (4) 100% Ethanol, (5) 100% nước cất 38 Hình 16 Ảnh hưởng acid tách chiết Anthocyanin: (1) Acid HCl, (2) Acid axetic (3) Đối chứng acid, (4) Acid citric 40 Hình 17 Ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến tách chiết Anthocyanin: (1) Mẫu tươi, (2) Mẫu khô 43 Hình 18 Ảnh hường loại vỏ Chôm chôm ly trích Anthocyanin: (1) Chôm chôm thường, (2) Chôm chôm nhãn 44 CBHD: Th.S Đỗ Tấn Khang vii SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.Cấu trúc hóa học Anthocyanin Bảng Các Anthocyanin môt số nguồn thực vật 12 Bảng Độ hấp thụ quang phổ (giá trị OD) dịch chiết Anthocyanin bước sóng 430 nm 37 Bảng Ảnh hưởng hệ dung môi đến giá trị OD dịch chiết có DPPH sau 30 phút (khả khử gốc tự DPPH) 38 Bảng Ảnh hưởng hệ dung môi đến khả chống oxy hóa dịch chiết 39 Bảng Ảnh hưởng acid đến độ hấp thụ (giá trị OD) dịch chiết Anthocyanin 41 Bảng Độ ẩm mẫu 42 Bảng Ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến khả làm DPPH dịch chiết Anthocyanin 43 Bảng Khả chống oxy hóa dịch chiết Anthocyanin từ hai loại vỏ Chôm chôm 44 CBHD: Th.S Đỗ Tấn Khang viii SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên Các hợp chất chống oxy hóa thực phẩm đóng vai trò quan trọng bảo vệ sức khỏe Bằng chứng khoa học cho thấy chất chống oxy hóa giảm nguy bệnh mãn tính ung thư bệnh tim Các chất chống oxy hóa chủ yếu có nguồn gốc từ thiên nhiên có trái cây, rau Các chất chống oxy hóa có nhiều thực phẩm vitamin C, vitamin E, caroten, acid phenolic, phytate kích thích tố nữ công nhận có khả làm giảm nguy mắc bệnh (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Hầu hết hợp chất chống oxy hóa chế độ ăn điển hình có nguồn gốc từ thực vật Một số hợp chất, chẳng hạn Gallates, có hoạt động chống oxy hóa mạnh, chất khác mono-phenol chất chống oxy hóa yếu Có số nghiên cứu lâm sàng cho thấy chất chống oxy hóa trái cây, trà, rau rượu vang đỏ yếu tố thực phẩm giúp làm giảm tỷ lệ mắc bệnh mãn tính bệnh tim số bệnh ung thư (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Hình Cơ chế hoạt động chất chống oxy hoá Cơ chế hoạt động chất chống oxy hoá: Chất chống oxy hóa chất dinh dưỡng, làm gốc tự cách đưa lên electron Khi phân tử gốc tự nhận thêm electron từ phân tử chống oxy hóa, gốc tự trở nên ổn định không khả gây hại CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.1.3 Một số chất chống oxy hoá điển hình thực vật Vitamin C (ascorbic acid): Vitamin C có nhiều loại rau tươi nước cam, chanh, quít, có hàm lượng cao rau xanh, đặc biệt cải xanh, tiêu, khoai tây, cải Brussel, rau cải, cà chua, cam, quýt, chanh, bưởi…Theo Niki et al., (1995) vitamin C kết hợp với α-tocopherol có hiệu cao việc làm trình oxy hóa Acid gallic: Có sồi, hạt dẻ, trà, đinh hương, mâm xôi, óc chó…Acid gallic thuộc nhóm acid trihydroxybenzoic, có tính kháng nấm kháng khuẩn Acid gallic hoạt động chất chống oxy hóa giúp bảo vệ tế bào khỏi nguy bị oxy hóa Acid gallic có khả kháng tế bào ung thư mà không gây hại đến tế bào khỏe mạnh Carotenoid: Là dạng sắc tố hữu tự nhiên có nhiều rau trái (nhất loại có màu đỏ, cam, vàng…) Carotenoid chất chống oxy hóa tan lipid Những tác dụng chống oxy hóa giảm peroxyde lipid Carotenoid nghiên cứu (Upritchardetal, 2003) Vitamin E: Vitamin E có nguồn gốc thiên nhiên chiết xuất từ dầu thực vật đậu tương, ngô, mầm lúa mạch, loại hạt có dầu hạt hướng dương Nó bảo vệ tế bào chống lại trình oxy hóa cách tác động trực tiếp đến loạt gốc oxy tự Vitamin E có vai trò quan trọng việc phòng chống xơ vữa động mạch thông qua việc làm trình oxy hóa LDLs (Low density lipoprotein: có vai trò vận chuyển cholesterol) gốc tự (Steinberg, 1992; Witztum, 1994) II.1.4 Một số nghiên cứu hợp chất chống oxy hóa từ thực vật a) Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa hợp chất chống oxy hóa số thực vật ăn Thái Lan Một số lượng lớn thực vật sử dụng làm thực phẩm dược thảo Thái Lan, khảo sát hoạt tính chống oxy hóa phương pháp tẩy trắng β-Carotene Hàm lượng chất có thực vật, chẳng hạn vitamin C, vitamin E, Carotenoids, Tannin, Phenolics xác định Kết cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao tìm thấy loài Gymnema inodorum, Piper sarmentosum Mentha arvensis Dựa vào mối CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên tương quan hàm lượng chất hóa học loài thực vật số chất chống oxy hóa quan sát, kết cho thấy hóa chất vitamin C, vitamin E, Carotenoids, hợp chất Phenolic chất đóng góp vào hoạt động chống oxy hóa thực vật (A Chanwitheesuk et al., 2004) b) Xác định hoạt tính chống oxy hóa vitamin C số cao ethanol thô chiết từ thực vật phương pháp ferric thiocyanate (FTC) Dịch chiết Ethanol thô từ vỏ rễ bần, vỏ thân sung, hạt cau dùng để xác định khả chống oxy hóa phương pháp Ferric Thiocyanate (FTC) với acid ascorbic dùng làm chất chuẩn Kết cho thấy hoạt tính chống oxy hóa acid ascorbic (88,09 ± 0,27) %, cao Ethanol vỏ rễ bần (41,99 ± 0,07) %, vỏ thân sung (36,65 ± 0,07) %, hạt cau (79,16 ± 0,13) % So sánh kết đạt với kết chống oxy hóa vitamin C với acid ascorbic chuẩn cho thấy độ lệch 8,37 % Kết xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) cho thấy phần trăm hoạt tính chống oxy hóa acid ascorbic, cao ethanol thô vỏ rễ bần, vỏ thân sung, hạt cau hệ DPPH giá trị SC50 (μg/mL) khác (91,0 ± 0,3) % 937 (μg/mL), (77,9 ± 0,3) % 32/28 (μg/mL), (82,9 ± 0,3) % 27,3 (μg/mL), (89,9 ± 0,2) % 25,83 (μg/mL) Đối chiếu kết chống oxy hóa phương pháp FTC với phương pháp DPPH cho thấy độ sai lệch acid ascorbic 2,06 %, vỏ rễ bần 25,09 %, vỏ thân sung 32,7 %, hạt cau 7,59 % (Trần Thị Bé Lan ctv, 2011) CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.2 Tổng quan chất chống oxy hóa Anthocyanin II.2.1 Anthocyanin Các Anthocyanin thuộc nhóm chất màu tự nhiên tan nước lớn giới thực vật …(Giuseppe, 2007) Theo nghiên cứu khác nhà khoa học khảo sát phân bố màu sắc dịch tế bào thực vật, năm 1835 Marquart đặt thuật ngữ “Anthocyanin”, kết hợp Anthos – nghĩa hoa Kysanesos – nghĩa màu xanh (theo tiếng Hy Lạp) Tuy nhiên, màu xanh, Anthocyanin mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác hồng, đỏ, cam gam màu trung gian Hình Một số thực vật chứa Anthocyanin Các Anthocyanin hết nhóm đường gọi anthocyanidin hay aglycon Mỗi anthocyanidin bị glycosyl hóa acylate loại đường acid khác vị trí khác Vì lượng Anthocyanin lớn anthocyanidin từ 15-20 lần Anthocyanin chất màu thiên nhiên sử dụng an toàn thực phẩm, tạo nhiều màu sắc hấp dẫn cho sản phẩm Trong năm gần đây, số nghiên cứu Anthocyanin hiển thị loạt hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính chống viêm, kháng khuẩn, chống gây ung thư làm giảm nguy bệnh tim mạch vành…(Giuseppe, 2007) CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.2.2 Cấu trúc hoá học Anthocyanin Anthocyanin thuộc nhóm hợp chất Flavonoid (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011), có khả hòa tan nước chứa không bào Về chất, Anthocyanin hợp chất glycoside dẫn xuất polyhydroxy polymethoxy 2-phenylbenzopyrylium muối flavylium (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Cho đến nay, người ta xác định 18 loại aglycon khác nhau, loại phổ biến Pelargonidin, Cyanidin, Delphinidin, Peonidin, Petunidin Maldivin Trong có sáu Anthocyanidin phổ biến, có tổng cộng 539 Anthocyanin báo cáo phân lập từ thực vật, 277 Anthocyanin số xác định sau năm 1992 (Gould et al., 2002) Bảng Cấu trúc hóa học Anthocyanin Anthocyanidin Cấu trúc R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 Aurantinidin -H -OH -H -OH -OH -OH -OH Cyanidin -OH -OH -H -OH -OH -H -OH Delphinidin -OH -OH -OH -OH -OH -H -OH Europinidin -OCH3 -OH -H -OH -H -H -OH Luteolinidin -OH -OH -H -H -OH -H -OH Pelargonidin -H -OH -H -OH -OH -H -OH Malvidin -OCH3 -OH -OCH3 -OH -OH -H -OH Poonidin -OCH3 -OH -H -OH -OH -H -OH Petunidin -OH -OH -OCH3 -OH -OH -H -OH Rosinidin -OCH3 -OH -H -OH -OH -H -OCH3 Trong tự nhiên, Anthocyanin trạng thái tự (không bị glycosyl hóa) Nhóm hydroxy tự vị trí C-3 làm cho phân tử Anthocyanidin trở nên không ổn định làm giảm khả hòa tan so với Anthocyanin tương ứng Vì vậy, glycosyl hóa diễn ra, vị trí nhóm 3-hydroxy Nếu có thêm phân tử đường sữa, vị trí bị glycosyl hóa thường gặp C-5 Ngoài ra, glycosyl hóa gặp vị trí C-7, C-3’, C-5’ CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên Loại đường phổ biến glucose, có vài loại monosaccharide (như galactose, rammose, arabinose), loại disaccharide (chủ yếu rutinose, sambubiose hay sophorose) trisaccharide tham gia vào trình glycosyl hóa Sự methoxyl hóa Anthocyanin glucoside tương ứng diễn thông thường vị trí C-3’ C-5’, gặp vị trí C-7 C-5 Tuy nhiên nay, người ta chưa tìm thấy hợp chất bị glycosyl hóa hay bị methoxyl hóa tất vị trí C-3, -5, -7 -4’ cần thiết phải nhóm hydroxyl tự C-5, -7 hay -4’ để hình thành dạng cấu trúc quinonoidal base (dạng cấu trúc Anthocyanin thường tồn không bào thực vật có pH từ 2,5 – 7,5) Hình Cấu trúc anthocyanidin tự nhiên Sự acyl hóa xảy vị trí C-3 phân tử đường hay ester hóa nhóm hydroxy C-6 Các nhóm acyl hóa phenolic acid ρ-coumeric, caffeic, ferulic hay sinapic acid loạt acid acetic, malic, malonic, axalic succinic II.2.3 Tính chất Anthocyanin Anthocyanin tinh khiết dạng tinh thể vô định hình hợp chất phân cực nên tan tốt dung môi phân cực Anthocyanin hòa tan tốt nước dịch bão hòa Khi kết hợp với đường cho phân tử Anthocyanin hòa tan CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên Mức độ methyl hóa nhóm OH vòng benzene cao màu đỏ Nếu nhóm OH vị trí thứ ba kết hợp với gốc đường màu sắc thay đổi theo số lượng gốc đường đính vào nhiều hay Các Anthocyanin dễ bị phân hủy Độ ổn định Anthocyanin phụ thuộc pH, nhiệt độ lưu trữ, cấu trúc hóa học, nồng độ, ánh sáng, oxygen, dung môi, diện enzyme, flavonoid, protein ion kim loại Cấu trúc Anthocyanin thay đổi tùy thuộc vào pH Hầu 100% dạng cation flavylium pH = 1,5, pH = 2,5 có khoảng 67% dạng cation pH tăng làm tăng việc proton, chuyển dạng quinol màu đỏ xanh Vòng B ảnh hưởng tới độ ổn định Anthocyanin, nhóm OH - OMe làm giảm độ ổn định aglycon (anthocyanidin) môi trường trung tính, Pelargonidin có nhóm OH nên ổn định Trái với aglycon, monoglycoside hầu hết diglycoside ổn định điều kiện pH trung tính Điều giải thích phân tử đường tránh thoái hóa dạng trung gian bền thành acid phenolic aldehyde (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Tùy vào pH mà Anthocyanin tồn dạng cấu trúc: dạng cation flavylium, baz quinodial, baz carbinol chalcone Khi dung dịch pH < 3,2, Anthocyanin tồn chủ yếu dạng: cation flavylium baz quinodial màu đỏ/vàng Anthocyanin thường xuất màu đỏ tế bào lá, tùy thuộc vào tính chất hoá học, nồng độ chúng tương tác với sắc tố khác, chúng cho màu hồng, tím, xanh, cam, nâu, chí màu sắc màu đen (Gould et al., 2002) Khi tăng số lượng nhóm OH vòng benzene màu xanh đậm So với đa số chất màu thiên nhiên, Anthocyanin chất màu có độ bền hơn, thể tính bền môi trường acid Ngoài ra, phân hủy tạo thành dạng không màu sản phẩm cuối phân hủy có dạng màu nâu cộng với sản phẩm không tan (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 10 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên Màu sắc Anthocyanin thay đổi theo pH môi trường, cụ thể sau:  pH = 1: Màu đỏ cation flavynium  pH = 24: Màu xanh quinoidal  pH = 56: Hai dạng không màu carbinol pseudo baz chalcone  pH > 7: Anthocyanin bị thoái hóa tùy vào nhóm  pH = 46: Có dạng cấu trúc Anthocyanin tồn tại: Ion dương flavylium, quinoidal khan (cấu trúc nước), carbinol baz không màu chalcone màu vàng nhạt Cân dạng quinoidal baz carbinol thông qua cation flavylium (cấu trúc D, A E) Khi pH tăng, dạng bazơ khan tăng, điều kiện acid, dạng ion flavynium màu đỏ chủ yếu II.2.4 Sự phân bố Anthocyanin Anthocyanin tập trung hạt kín loài hoa, phần lớn nằm hoa quả, có rễ Trong loại thực vật này, Anthocyanin tìm thấy chủ yếu lớp tế bào nằm bên biểu bì (Gould & Lee, 2002) Các hợp chất Anthocyanin xuất rộng rãi khoảng 27 họ, 73 loài nhiều giống thực vật (Gould et al.,2002) Các họ thực vật vitaceae (nho) rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi, táo,…) nguồn Anthocyanin chủ yếu Bên cạnh có họ thực vật khác Solanceae (cà tím), Saxifragaceae (quả lý đỏ đen), Ericaceae (quả việt quốc) Brassicaceae (bắp cải tím) Các loại Anthocyanin phổ biến glucoside Cyanidin, Pelargonidin, Peonidin Delphinidin, sau Petuidin Maldivin Số lượng 3–glucoside nhiều gấp 2,5 lần 3,5–glucoside Loại Anthocyanin hay gặp Cyaidin-3-glucoside CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 11 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên Bảng Các Anthocyanin môt số nguồn thực vật Tên thực vật Tên thông Loại Anthocyanin thường Allium cepa Củ hành đỏ Cy-3-glucoside, 3-galactoside, 3diglucoside 3-laminarriobioside, Pn-3-glucoside Brassica oleraea Bắp cải tím Cy-3-sophoroside-5-glucoside cacyl (red cabbage) hóa với malonoyl, ρ-coumaroyl, di-ρcoumarol,feruloyl, diferuloyl, sinapoyl disinapoyl Fragaria spp Dâu tây Pg Cy-3-glucoside (strawberry) Glycine maxima Đậu nành (vỏ) Cy Dp-3-glucoside Hibicus sabdariffa L Hoa dâm bụt Cy, Pn, mono- biosides Raphanus sativus Củ cải đỏ (rễ) Pg Cy-3-sophoroside-5-glucoside acyl hóa với ρ-coumaroyl, feruloyl, caffeoyl Vitis spp Nho Cy, Pn, Dp, Pt Mv mono diglucoside; dạng tự dạng acyl hóa CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 12 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.3 Vai trò Anthocyanin thực vật sức khoẻ người II.3.1 Đối với thực vật Trong giới thực vật, chlorophyll loại chất màu chiếm ưu đóng vai trò quan trọng trình quang hợp Sự xuất chất màu khác, màu xanh (Anthocyanin, Carotenoid), thường nhằm mục đích tạo tương phản, thu hút loài động vật, tạo điều kiện cho trình thụ phấn phát tán hạt giống Các nghiên cứu chứng minh Anthocyanin giúp che chở lục lạp, bảo vệ lục lạp chống lại cường độ ánh sáng cao, giúp ngăn ức chế trình quang hợp Chalker-Scott (1999) đề vai trò Anthocyanin thực vật gồm:  Hấp thụ tia xạ  Vận chuyển monosaccharide  Điều chỉnh áp suất thẩm thấu giai đoạn khô hạn nhiệt độ thấp Ngoài ra, Anthocyanin phát số vai trò khác như: Hale cộng (2001, 2002) thấy hàm lượng chất màu tăng khả tích tụ molybden tungsten loài Brassica sp (Bắp cải) tăng; hay mô có chứa Anthocyanin, khả bị công nấm mốc giảm (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Anthocyanin tích tụ tế bào kết tổn thương học hay thiếu hụt phosphoros nitrogen (Gould et al., 2002) Nói chung, Anthocyanin tin có khả tăng cường phản ứng chống oxy hóa tế bào yếu tố gây stress CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 13 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.3.2 Đối với sức khoẻ người Ngoài vai trò sinh lý thực vật, hợp chất Anthocyanin chứng minh mang lại nhiều ích lợi sức khỏe cho người Các hợp chất Anthocyanin hấp thu vào dày dạng phân tử hỗ trợ chế vận chuyển qua mật Ngoài ra, phân tử Anthocyanin không bị biến đổi tác dụng hệ vi khuẩn ruột non Vì thế, phân tử Anthocyanin không thay đổi huyết tương nước tiểu Các nghiên cứu gần cho thấy Anthocyanin hấp thu mức độ thấp, khoảng 0,016% đến 0,11% lượng tiêu thụ người (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Mặc dù thể hấp thu lượng nhỏ, phân tử Anthocyanin sau chuyển hóa biểu hoạt tính chống ung thư, chống xơ vữa động mạch, chống viêm, giảm mức độ thẩm thấu, độ vỡ mao mạch, ức chế đông tụ tiểu huyết cầu thúc đẩy tạo thành cytokine từ điều hòa phản ứng miễn dịch Tất hoạt tính dựa khả chống oxy hóa Anthocyanin Cũng nhờ khả này, hợp chất Anthocyanin giúp bảo vệ màng dày chống lại thương tổn oxy hóa, hoãn lại giai đoạn đầu bệnh ung thư dày, ung thư ruột ruột kế Hoạt tính thành phần hệ vi khuẩn đường ruột bị thay đổi sau dùng dịch trích từ loại mọng (berry) có chứa hợp chất flavonoid gồm Anthocyanin (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Một số hoạt tính sinh học cyanidin-3-glucoside:  Giảm khả bị oxy hóa LDL  Bảo vệ hồng cầu khỏi tác động oxy hóa  Giảm phân tách DNA  Ức chế độc tính đại thực bào cách giảm hàm lượng NO  Ngăn chặn tác hại tia UV liposome  Kháng viêm  Chống bệnh tim mạch  Ức chế tác động phát triển tế bào ung thư CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 14 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.4 Hoạt tính chống oxy hoá Anthocyanin II.4.1 Một số chế chống oxy hoá Anthocyanin Sự thiếu electron tự nhiên phân tử Anthocyanin giúp cho hợp chất đặc biệt hoạt động Một số chế chống oxy hóa Anthocyanin có từ nghiên cứu sau:  Ngăn chặn gốc hoạt động cách cho hydro  Chelate ion kim loại xúc tác cho phản ứng oxy hóa  Liên kết với protein, tạo phức chất bền Phản ứng vào nhóm hydroxy nằm vị trí ortho vòng B Anthocyanin Cyanidin đóng vai trò quan trọng giúp ổn định gốc tự Ngoài ra, nhóm ortho- dihydroxy có khả chelate ion kim loại từ ngăn chặn peroxy hóa lipid (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Cơ chế chống oxy hóa Cyanidin-3- glucoside (C3G) Tsuda tìm cách giải thích cách cho phản ứng với gốc alkylperoxyl (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) Dựa sản phẩm phản ứng, tác giả cho C3G chống oxy hóa theo chế khác với alpha-tocopherol giả thuyết C3G phá vỡ cấu trúc quét gốc tư Các hợp chất flavonoid nói chung có Anthocyanin chống oxy hóa cách quét gốc O2 tự do, hay phản ứng với gốc peroxy tham gia vào phản ứng oxy hóa dây chuyền Nhờ vào khả cho gốc tự H+, hợp chất ức chế phản ứng peroxy hóa lipid (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) II.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả chống oxy hoá Anthocyanin Rất nhiều nghiên cứu cho thấy mối tương quan cao hàm lượng màu nguyên liệu (trái cây, rau) với khả chống oxy hóa Ngoài ra, khác cấu trúc Anthocyanin ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa Trên thực tế, cách thay đổi vị trí loại gốc hóa học gắn vào vòng thơm phân tử Anthocyanin, khả nhận electron độc thân từ gốc tự khác CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 15 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên Hình Sự tạo phức cyanidin DNA (http://www.docs.vn/vi/sinh-hoc-38/43343-tong-quan-ve-cac-nguyen-lieu-chua.html) Theo kết nghiên cứu Anthocyanin aglycon cyanidin chúng cherry chát, khả ức chế oxy hóa lipid Cyanidin cao glucoside nó, từ cho thấy hoạt tính chống oxy hóa Anthocyanin aglycon định Số lượng gốc đường vị trí C3 có vai trò quan trọng đến khả chống oxy hóa, số lượng phân tử đường khả chống oxy cao Bằng phương pháp đo khả hấp thụ gốc oxy thấy Cyanidin – glucoside có hoạt tính ORAC cao số 14 loại Anthocyanin kiểm tra cao 3,5 lần hoạt tính Trolox (chất tương đương vitamin E) Chính vậy, người ta hướng đến khả sử dụng nhiều phương pháp khác trình nuôi cấy huyền phù tế bào chọn giống thực vật nhằm thu loại Anthocyanin mong muốn (Huỳnh Thị Thanh Tuyền ctv, 2011) CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 16 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.4.3 Một số nghiên cứu Anthocyanin từ thực vật a) Chất chống oxy hóa Anthocyanin từ trái ăn Các loại trái ăn 12 loài thực vật trích xuất methanol bị dung môi phân ba vùng: hexane, ethyl acetate, dung dịch nước Phân đoạn dung dịch nước bán tinh khiết tách nhựa HP-20SS Diaion để loại bỏ đường acid ascorbic Sau đó, phân đoạn tầm soát cho hoạt động chống oxy hóa cách sử dụng khảo nghiệm 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl Chín số phân đoạn bán tinh khiết biểu khả chống oxy hóa cao Cyanidin-3-Ob-glucopyranoside, chất chống oxy hóa Anthocyanin, xác định từ phân đoạn dung dịch nước bán tinh khiết loài Chrysophyllum cainito, Eugenia uniflora Myrciaria cauliflora Delphinidin-3-Ob-glucopyranoside xác định từ Eugenia uniflora (L.S Einbond et al 2004) b) Nghiên cứu tách chiết Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus SabdariffaỨng dụng để sản xuất giấy thị phát nhanh hàn the thực phẩm Nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích chiết xuất chất màu Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus, tách bỏ bớt tạp chất để thu thành phẩm chứa hàm lượng Anthocyanin cao Sử dụng chất màu thu để nghiên cứu sản xuất giấy thị xác định nhanh hàn the thực phẩm Bằng phương pháp so màu phương pháp pH vi sai, xác định điều kiện tối ưu cho trình chiết chất màu dung môi Ethanol/nước: 50/50 bổ sung 1% HCl; tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 14 ml/1 gam; thời gian chiết ngày Bằng phương pháp chiết phân đoạn, tách chất màu thô Anthocyanin từ dịch chiết đài hoa Hibiscus Đã xác định hàm lượng chất màu nguyên liệu khô 15,2% tương ứng nguyên liệu tươi 1,06% Độ acid nguyên liệu khô 3,37 mldH+/1 gam nguyên liệu, độ acid chất màu khô 3,83 mldH+/1 gam chất màu, tương ứng 0,58 mldH+/1 gam nguyên liệu khô, tức độ acid giảm 83% Đã khảo sát số điều kiện để sản suất giấy thị hàn the chọn thông số thích hợp với tỉ lệ pha loãng 1gam màu khô/400ml nước cất; thời gian ngâm tẩm dịch màu lên giấy 120 giây; thời gian tiếp xúc giấy thị với thực phẩm (hoặc dịch thực phẩm) 90 giây CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 17 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ [...]... gian chiết là 24h Kết quả thí nghiệm cho thấy khả năng chống oxy hóa ở mẫu tươi cao hơn mẫu khô lần lượt là 72,59 ± 1,28 % và 56,42 ± 1,02 % Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Anthocyanin từ vỏ Chôm chôm thường (72,59 ± 1,28 %) cao hơn dịch chiết từ vỏ Chôm chôm nhãn (69,57 ± 1,02 %) Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Anthocyanin từ vỏ Chôm chôm phụ thuộc vào điều kiện bảo quản nguyên liệu và. .. đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên tương quan giữa hàm lượng các chất hóa học của từng loài thực vật và chỉ số chất chống oxy hóa đã được quan sát, kết quả cho thấy các hóa chất như vitamin C, vitamin E, Carotenoids, và các hợp chất Phenolic là những chất đóng góp vào các hoạt động chống oxy hóa ở thực vật (A Chanwitheesuk et al., 2004) b) Xác định hoạt tính chống oxy hóa của vitamin C và một số... dung môi tối ưu để tách chiết Anthocyanin, một hợp chất chống oxy hóa vô cùng quí giá từ vỏ Chôm chôm (Nephelium lappaceum), phần luôn bị bỏ đi sau CBHD: ThS Đỗ Tấn Khang 1 SVTH: Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên khi sử dụng Bên cạnh đó, nghiên cứu còn khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện và giống Chôm chôm đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết Anthocyanin CBHD:... học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên TÓM TẮT Trong đề tài nghiên cứu, Anthocyanin được tách chiết từ vỏ Chôm chôm (Nephelium lappaceum L.) Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH được mô tả theo Akter et al (2010) Điều kiện tối ưu để tách chiết Anthocyanin trong đề tài được xác định như sau: Hệ dung môi Ethanol/nước: 1/1; 1% Acid Axetic, tỉ lệ giữa mẫu và. .. Huỳnh Xuân Mỹ Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 35 Khoa Khoa học Tự Nhiên II.4 Hoạt tính chống oxy hoá của Anthocyanin II.4.1 Một số cơ chế chống oxy hoá của Anthocyanin Sự thiếu electron tự nhiên của các phân tử Anthocyanin giúp cho các hợp chất này đặc biệt hoạt động Một số cơ chế chống oxy hóa của Anthocyanin có được từ các nghiên cứu như sau:  Ngăn chặn các gốc hoạt động bằng cách cho hydro  Chelate... ethanol thô chiết từ thực vật bằng phương pháp ferric thiocyanate (FTC) Dịch chiết Ethanol thô từ vỏ rễ bần, vỏ thân sung, và hạt cau được dùng để xác định khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp Ferric Thiocyanate (FTC) với acid ascorbic được dùng làm chất chuẩn Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của acid ascorbic là (88,09 ± 0,27) %, cao Ethanol vỏ rễ cây bần là (41,99 ± 0,07) %, vỏ thân sung... %, vỏ thân sung là (36,65 ± 0,07) %, và hạt cau là (79,16 ± 0,13) % So sánh kết quả đạt được với kết quả chống oxy hóa của vitamin C với acid ascorbic chuẩn cho thấy độ lệch là 8,37 % Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) cho thấy phần trăm hoạt tính chống oxy hóa của acid ascorbic, cao ethanol thô vỏ rễ bần, vỏ thân sung, hạt cau trên hệ DPPH... kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng Chúng làm giảm tác dụng của các quá trình oxy hóa nguy hiểm bằng cách liên kết với nhau với các phân tử có hại, giảm sức mạnh hủy diệt của chúng Đặc tính chính của các chất chống oxy hóa là khả năng bẫy các gốc tự do Những gốc tự do đó có thể oxy hóa axit nucleic, protein, chất béo hoặc DNA và có thể gây bệnh thoái hóa Các hợp chất chống oxy hóa như axit... cứu trên các Anthocyanin và aglycon cyanidin của chúng trong cherry chát, khả năng ức chế sự oxy hóa lipid của Cyanidin cao hơn các glucoside của nó, từ đó cho thấy rằng hoạt tính chống oxy hóa của Anthocyanin là do aglycon quyết định Số lượng các gốc đường ở vị trí C3 cũng có vai trò rất quan trọng đến khả năng chống oxy hóa, số lượng các phân tử đường càng ít khả năng chống oxy càng cao hơn Bằng phương... trong việc phòng chống xơ vữa động mạch thông qua việc làm sạch quá trình oxy hóa LDLs (Low density lipoprotein: có vai trò vận chuyển cholesterol) của các gốc tự do (Steinberg, 1992; Witztum, 1994) II.1.4 Một số nghiên cứu về các hợp chất chống oxy hóa từ thực vật a) Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và các hợp chất chống oxy hóa ở một số thực vật ăn được của Thái Lan Một số lượng lớn của thực vật được