Tách chiết, thu nhận và khảo sát một số tính chất của amylase nội tạng tôm hùm xanh (panulirus homarus) nuôi tại vùng biển khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  TRẦN THỊ THANH HỒNG TÁCH CHIẾT, THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA AMYLASE NỘI TẠNG TƠM HÙM XANH (Panulirus homarus) NI TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HỊA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cán hướng dẫn: TS ĐỖ VĂN NINH Nha Trang, tháng 06 năm 2013 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện cho học tập Các thầy cô khoa Công nghệ Thực Phẩm trường Đại học Nha Trang cung cấp kiến thức, kỹ cần thiết giúp tơi thực đồ án cách hồn chỉnh Các anh chị, thầy cô trực thuộc phịng thí nghiệm Viện Cơng Nghệ Sinh Học Mơi Trường, Phịng thí nghiệm Sắc Ký Viện Cơng Nghệ Sinh Học Môi Trường, trường Đại học Nha Trang Các anh chị cao học, bạn làm phịng tận tình hỗ trợ q trình thực đề tài Thầy Đỗ Văn Ninh tận tình đạo đề tài cách tốt thầy Đỗ Hữu Nam trực tiếp hướng dẫn cách công tâm Cảm ơn mẹ, cha động viên ủng hộ tinh thần vật chất để giúp thực đề tài cách tốt Tháng năm 2013 Trần Thị Thanh Hồng GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG ii TÓM TẮT LUẬN ÁN Trần Thị Thanh Hồng, Đại học Nha Trang, tháng năm 2013 “ Tách chiết, thu nhận khảo sát số tính chất amylase nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) nuôi vùng biển Khánh Hòa” Giáo viên hướng dẫn: TS Đỗ Văn Ninh Đề tài nhằm cung cấp kiến thức cho nghiên cứu liên quan đến enzyme tiêu hóa amylase tương lai nhằm đến vấn đề lớn nâng cao suất chất lượng tôm hùm nước Đề tài tiến hành tách chiết enzyme từ nội tạng tơm hùm xanh cách trích ly đệm Tris-HCl 0,05M; pH=7, trích ly 40 phút với tỉ lệ 1:7 kết tủa cồn 960 với tỉ lệ 1:6 Sau xác định hàm lượng protein dịch chiết, xác định hoạt tính amylase, khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH, ion kim loại hóa trị II nồng độ 1mM 5mM đến hoạt tính amylase, khảo sát độ bền nhiệt amyalse Kết thí nghiệm cho thấy: enzyme amylase hoạt động nhiệt độ tối ưu 500C, pH tối ưu 6, ion kim loại hóa trị II nồng độ 1mM ion Ca2+ kích thích hoạt động enzyme amylase cịn ion cịn lại khơng nồng độ 5mM ion kim loại kìm hãm hoạt động enzyme amylase, thí nghiệm xác định độ bền nhiệt amylase hoạt tính amylase so với nhiệt độ tối ưu 600C giảm 21,44%; 700C giảm 86,89%; 800C giảm 93,32%; 900C giảm 97,1% GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vii DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.3 Ý NGHĨA VỀ ĐỀ TÀI CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus) 2.1.1 Phân loại hình thái 2.1.2 Đặc điểm phân bố 2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 2.1.4 Đặc điểm sinh sản 2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 2.1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tôm hùm nuôi GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG iv 2.2 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME 2.2.1 Định nghĩa 2.2.2 Cấu tạo phân tử 10 2.2.3 Phân loại enzyme 10 2.2.4 Tính chất hóa lý 11 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme 11 2.3 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME TIÊU HÓA 14 2.3.1 Đặc điểm chung hệ enzyme tiêu hóa 14 2.3.2 Sự sinh sản hệ enzyme tiêu hóa 15 2.4 SƠ LƯỢC VỀ AMYLASE 16 2.4.1 Giới thiệu 16 2.4.2 α-Amylase 16 2.4.3 β-Amylase 19 2.4.4 Glucoamylase (α-1,4glucan-gluhydrolase) 21 2.5 SƠ LƯỢC VỀ TINH BỘT 22 2.5.1 Giới thiệu 22 2.5.2 Quá trình thủy phân tinh bột amylase 22 2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ENZYME 22 2.6.1 Phương pháp trích ly kết tủa muối 23 2.6.2 Phương pháp trích ly kết tủa dung mơi hữu 23 GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG v 2.6.3 Phương pháp sử dụng Ph 24 2.7 CÁC VẤN ĐỀ TRONG XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 25 2.7.1 Một số điểm cần lưu ý xác định hoạt tính enzyme 25 2.7.2 Nguyên tắc chung phương pháp xác định hoạt tính enzyme 26 2.8 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE 26 2.8.1 Đo biến thiêng độ nhớt dung dịch 26 2.8.2 Đo mật độ quang dung dịch sau thực phản ứng với iod 27 2.8.3 Đo lượng đường khử tạo thành 27 2.9 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ ENZYME TIÊU HĨA CỦA TƠM HÙM 28 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 31 3.2 VẬT LIỆU 31 3.3 HÓA CHẤT SỬ DỤNG 31 3.4 THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 31 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.6 QUY TRÌNH THU NHẬN ENZYME VÀ THUYẾT MINH QUY TRÌNH 33 3.6.1 Q trình thu nhận enzyme 33 3.6.2 Thuyết minh quy trình 33 3.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN 38 3.8 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE 38 GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG vi 3.9 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE 38 3.9.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính amylase 38 3.9.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính amylase 39 3.9.3 Ảnh hưởng ion kim loại hóa trị II đến hoạt tính amylase 40 3.9.4 Độ bền nhiệt amylase 41 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 4.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 43 4.1.1 Đường chuẩn albumin 43 4.1.2 Đường chuẩn iod 44 4.2 HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG MẪU 45 4.3 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA AMYLASE 46 4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính amylase 46 4.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính amylase 48 4.3.3 Ảnh hưởng ion kim loại II đến hoạt tính amylase 49 4.3.4 Độ bền nhiệt amylase 51 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 5.1 KẾT LUẬN 53 5.2 ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHẦN PHỤ LỤC GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN S: chất S Vmax: vận tốc phản ứng cực đại CoE: coenzyme đvC: đơn vị Carbon HTA: hoạt tính amylase KL: kim loại CPE: chế phẩm enzyme DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 4.1 Kết xác định hàm lượng protein mẫu GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH 47 SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Hình 2.1 Tơm hùm xanh (Panulirus homarus) Trang Hình 2.2 Cấu trúc khơng gian α-amylase 17 Hình 2.3 Cấu trúc khơng gian β-amylase 20 Hình 2.4 Cấu trúc khơng gian glucoamylase 21 Hình 2.5 Quá trình thủy phân tinh bột amylase 23 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái tơm hùm xanh (Panulirus 32 homarus) Hình 3.2 Gây mê tơm 35 Hình 3.3 Tơm sau gây mê 35 Hình 3.4 Lấy nội tạng tơm 36 Hình 3.5 Nội tạng tơm thu 36 Hình 3.6 Nghiền nội tạng 37 Hình 3.7 Khuấy nội tạng 38 Hình 3.8 Kết tủa dịch enzyme 39 Hình 3.9 Tủa enzyme thu sau ly tâm lần thứ hai 39 Hình 4.1 Đường chuẩn albumin Hình 4.2 Thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH 46 SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG ix Hình 4.3 Đường chuẩn iod 47 Hình 4.4 Thí nghiệm xác định hàm lượng protein mẫu 48 Hình 4.5 Thí nghiệm khảo xác ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt 49 tính amylase Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt 49 tính amylase Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt tính 51 amylase Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng ion kim loại hóa trị 52 II (1mM) đến hoạt tính amylase Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng ion kim loại hóa trị 53 II (5mM)đến hoạt tính amylase Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn bền nhiệt amylase GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH 55 SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG ... “ Tách chiết, thu nhận khảo sát mốt số tính chất amylase nội tạng tơm hùm xanh (Panulirus homarus) ni vùng biển Khánh Hịa” Với tôm hùm xanh đối tượng nuôi biển phổ biến vùng biển Khánh Hòa amylase. .. từ nội tạng tôm hùm xanh - Khảo sát hoạt tính amylase theo nhiệt độ - Khảo sát hoạt tính amylase theo pH - Khảo sát hoạt tính amylase có mặt ion kim loại hóa trị II - Khảo sát độ bền nhiệt amylase. .. Hồng, Đại học Nha Trang, tháng năm 2013 “ Tách chiết, thu nhận khảo sát số tính chất amylase nội tạng tơm hùm xanh (Panulirus homarus) ni vùng biển Khánh Hịa” Giáo viên hướng dẫn: TS Đỗ Văn Ninh