Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease nội tạng tôm hùm xanh (panulirus homarus) nuôi tại vùng biển khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRỊNH THỊ KIM LIÊN TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus) NUÔI TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HOÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ Khánh Hòa – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRỊNH THỊ KIM LIÊN TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus) NUÔI TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HOÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60 54 01 04 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ VĂN NINH CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Khánh Hòa – 2014 KHOA SAU ĐẠI HỌC i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt chương trình thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch luận văn này, xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học kính trọng cảm ơn sâu sắc Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy Đỗ Văn Ninh thầy Đỗ Lê Hữu Nam hướng dẫn, giúp đỡ tận tụy lời khuyên quý giá suốt trình thực đề tài Cảm ơn PGS – TS Lại Văn Hùng – Trưởng Khoa Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nha Trang – Chủ nhiệm Đề tài, cung cấp tôm hùm để thu nhận enzyme nội tạng hỗ trợ kinh phí thực đề tài Trân trọng cảm ơn đến Ban lãnh đạo Thanh tra sở Nông nghiệp PTNT Khánh Hòa tạo điều kiện tốt để hoàn thành chương trình học cao học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Đỗ Thị Tuyến (Viện Sinh học nhiệt đới T.P Hồ Chí Minh) chị Nguyễn Minh Nhật (Trung tâm Thí nghiệm – Thực hành, Đại học Nha Trang) giúp đỡ nhiệt tình cho hoàn thành tốt đề tài Chân thành cảm ơn động viên anh chị bạn lớp cao học Công nghệ sau thu hoạch khóa 2011 Cuối chân thành cảm ơn gia đình bạn bè bên cạnh tạo điều kiện tốt suốt thời gian học tập thực đề tài Khánh Hòa, tháng 11 năm 2014 Trịnh Thị Kim Liên ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn “Tách chiết, tinh tính chất protease nội tạng Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) nuôi vùng biển Khánh Hoà” trung thực rõ ràng Học viên Trịnh Thị Kim Liên iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học tôm hùm xanh 1.1.1 Phân loại hình thái 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 1.1.4 Đặc điểm sinh sản 1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 1.1.6 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tôm hùm nuôi 1.1.6.1 Nhiệt độ nước 1.1.6.2 Độ mặn 1.1.6.3 Thức ăn 1.1.6.4 Chất lượng nước 1.1.6.5 Hàm lượng oxy hoà tan 1.2 Tình hình nghiên cứu dinh dưỡng tôm hùm 1.3 Tình hình nghiên cứu thức ăn viên cho tôm hùm 1.3.1 Các công trình nghiên cứu nước 1.3.2 Các công trình nghiên cứu nước 10 1.4 Các nghiên cứu nước hệ enzyme protease tôm hùm .12 1.5 Enzyme protease 14 1.5.1 Một số khái niệm enzyme 14 1.5.2 Bản chất cấu trúc enzyme 14 1.5.3 Phân loại Protease 16 1.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease 17 1.5.5 Phương pháp phân tách làm enzyme 18 1.5.5.1 Phương pháp trích ly enzyme 18 1.5.5.2 Phương pháp làm enzyme .19 1.5.5.3 Phương pháp sắc ký lọc gel 20 1.5.6 Xác định trọng lượng phân tử điện di SDS – PAGE 23 Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Thời gian địa điểm 25 2.2 Vật liệu .25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 iv 2.3.1 Sơ đồ trình nghiên cứu tổng quát 26 2.3.2 Tách chiết protease từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) 27 2.3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ chế phẩm protease 27 2.3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease 27 2.3.3.2 Xác định độ bền nhiệt protease tôm hùm xanh 28 2.3.3.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease .28 2.3.3.4 Xác định độ bền pH protease tôm hùm xanh 30 2.3.3.5 Ảnh hưởng ion kim loại hoá trị II đến hoạt độ protease 31 2.3.4 Các phương pháp nghiên cứu áp dụng 31 2.3.4.1 Hàm lượng protein hòa tan xác định theo phương pháp Lowry .31 2.3.4.2 Xác định hoạt độ protease từ nội tạng tôm hùm xanh theo phương pháp Anson 31 2.3.4.3 Tinh enzyme phương pháp sắc ký lọc gel 31 2.3.4.4 Xác định trọng lượng phân tử phương pháp điện di SDS-PAGE 32 2.4 Thiết bị, hóa chất dùng nghiên cứu 32 2.4.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 32 2.4.2 Hóa chất dùng nghiên cứu 33 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Thu nhận chế phẩm enzyme protease thô từ tôm hùm xanh .34 3.1.1 Quá trình chuẩn bị nguyên liệu xử lý tôm hùm để thu nhận nội tạng 34 3.1.2 Kết xử lý nội tạng để thu dịch chiết enzyme nội tạng tôm hùm 34 3.1.3 Kết tủa protease ethanol 96% để thu chế phẩm protease thô 34 3.1.4 Kết xác định hàm lượng protein chế phẩm protease thô nội tạng tôm hùm xanh 35 3.1.5 Kết xác định hoạt độ protease chế phẩm enzyme thô nội tạng tôm hùm xanh 36 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease 37 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease 37 3.2.2 Khảo sát độ bền nhiệt enzyme protease 38 3.2.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme protease 40 3.2.4 Khảo sát độ bền pH enzyme protease 41 3.2.5 Xác định ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt độ enzyme protease 42 3.3 Tinh chế phẩm protease thô sắc ký lọc gel 44 3.4 Xác định trọng lượng phân tử protease điện di SDS – PAGE .45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CL Carapace length: kích thước chiều dài phần giáp đầu ngực FA Axít béo EFA Các axít béo cần thiết FCR Hệ số chuyển hóa thức ăn SGR Tốc độ tăng trưởng đặc trưng AWG Tăng trưởng đạt theo tuần DGC Hệ số tăng trưởng tương đối theo ngày TCA Trichloracetic CPT Chế phẩm protease thô HLP Hàm lượng protein HP Hoạt độ protease HĐR Hoạt độ riêng protease MW Trọng lượng phân tử Cs Cộng vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 3.1 Kết xác định hàm lượng protein mẫu CPT 36 Bảng 3.2 Kết xác định mM tyrosine theo phương pháp Anson 36 Bảng 3.3 Lượng CPT, hàm lượng protein hoạt độ protease chế phẩm protease thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh 37 Bảng 3.4 Bảng hoạt độ riêng, độ tinh hiệu suất thu hồi protease 44 Bảng 3.5 Kết xác định trọng lượng phân tử protein mẫu CPT protease nội tạng tôm hùm xanh sau tinh 47 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1.Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) Hình 1.2 Đặc điểm hình thái tôm hùm Hình 2.1 Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) dùng nghiên cứu 25 Hình 2.2 Sơ đồ trình nghiên cứu tổng quát 26 Hình 2.3 Sơ đồ trình tách chiết thu chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) 27 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chế phẩm protease thô 28 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt chế phẩm protease thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh 29 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH tới hoạt độ 29 chế phẩm protease thô 29 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ bền pH chế phẩm protease thô 30 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng ion kim loại hóa trị II đến hoạt độ chế phẩm protease thô 30 Hình 3.1 Đường chuẩn Albumin .35 Hình 3.2 Đường chuẩn Tyrosin .36 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ hoạt độ enzyme protease nội tạng tôm hùm xanh 38 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ hoạt độ enzyme protease nội tạng tôm hùm xanh ủ 39 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease nội tạng tôm hùm xanh 40 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH hoạt độ enzyme protease 42 ủ 42 Hình 3.7 Ảnh hưởng ion kim loại hóa trị II hoạt độ 43 enzyme protease nội tạng tôm hùm xanh .43 Hình 3.8 Sắc ký đồ protein chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm hùm 44 Hình 3.9 Hình ảnh phổ điện di protein chế phẩm protease nội tạng tôm hùm xanh sau tinh phương pháp điện di SDS - PAGE 45 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Tôm hùm xanh hay gọi tôm hùm đá (Panulirus homarus) đối tượng nuôi biển có tốc độ tăng trưởng trung bình, nhiên chúng có giá trị kinh tế cao nên nghiên cứu nuôi số nước giới như: New Zealand, Việt Nam, Úc, Philippines (Smith et al., 2003; Tuan & Mao, 2004; William et al., 2005) Ở Việt Nam, nghề nuôi tôm hùm năm 1992, đến nghề nuôi tôm hùm lồng phát triển mạnh, số lượng lồng tăng lên đáng kể, sản lượng tôm hùm lồng đạt 1,3 nghìn tấn, tăng 22,7% (Tổng Cục Thống kê, 2011) Lượng lồng tôm hùm nuôi Khánh Hòa chiếm 2/3 tổng số lượng lồng nuôi nước, toàn tỉnh có 23 tiểu vùng phân theo địa giới hành 04 vùng nuôi Vạn Ninh, Ninh Hòa, Nha Trang Cam Ranh, với 18.842 lồng nuôi sản lượng tôm hùm lồng đạt gần 1000 tấn/ năm (Chi cục Nuôi trồng thuỷ sản Khánh Hoà, 2013) Các loài tôm hùm nuôi là: Tôm hùm (Panulirus ornatus) Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) Trong nghề nuôi tôm hùm Việt Nam, cá tạp, cua, ghẹ, sò nhỏ xem nguồn thức ăn chủ yếu Tuy nhiên việc sử dụng nguồn thức ăn có bất lợi gây ô nhiễm môi trường, cạnh tranh nguồn cá tạp với mục đích sử dụng khác: thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc, gia cầm…, người nuôi không chủ động nguồn thức ăn vào mùa mưa bão (Tuan cs, 2000) Để khắc phục tình trạng trên, hướng nghiên cứu sản xuất thức ăn tổng hợp dạng viên cho nuôi tôm hùm lồng cần thiết (Lê Anh Tuấn, 2005) Tuy thông tin dinh dưỡng nghiên cứu sử dụng thức ăn tổng hợp dạng viên cho tôm hùm hạn chế Các công trình nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng tôm hùm nhằm phát triển thức ăn tổng hợp dạng viên cho tôm hùm để thay cho nguồn thức ăn cá tạp nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đối tượng tôm hùm (Panulirus ornatus) như: Smith cs (2003, 2005), Mai Như Thuỷ (2006) Đối tượng tôm hùm xanh Panulirus homarus nuôi phổ biến Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận có nghiên cứu thử nghiệm sản xuất thức ăn tổng hợp viên Tuy nhiên thức ăn công nghiệp cho tôm hùm chưa sản xuất ứng dụng hiệu Do để sản xuất thức ăn công nghiệp đáp ứng nhu cầu sinh trưởng tôm hùm cần nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng, nghiên cứu hệ enzyme tiêu Xác định hoạt độ protease: Hoạt độ enzyme khảo sát nhiệt độ 37oC pH = Cho ml dung dịch chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ 37oC 10 – 15 phút Sau thời gian ủ, cho ml dịch chiết enzyme thô (cũng ủ 37oC) vào Lắc trộn để 10 phút 37oC Sau cho vào ống nghiệm ml dung dịch TCA 5% để ngừng phản ứng enzyme, lắc trộn nhanh để protein dư hợp chất cao phân tử khác kết tủa, giữ ống nghiệm 30oC để ổn định dung dịch 25 phút, sau lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Lấy 1ml dịch lọc từ ống nghiệm cho vào ống nghiệm khác có đánh số tương ứng, cho vào ống ml dung dịch Na2CO3, lắc Thêm ml thuốc thử Folin, Trộn đều, để yên 20 phút Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thu bước sóng 660 nm (ghi nhận kết Am) Mẫu đối chứng: lấy ml nước cất thay cho ml dung dịch enzyme tiến hành bước tương tự mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết độ hấp thụ A0 Hàm lượng tyrosine giải phóng protease thủy phân tính cách lấy Am – A0 lấy kết so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ protease theo tính toán sau: Một đơn vị hoạt độ (ĐVHĐ) protease xác định lượng enzyme để tạo lượng amino acid tương đương với 100 g tyrosine ml dịch lọc điều kiện thí nghiệm Ký hiệu là: Hoạt độ protease tính đơn vị/g (U/g) hay đơn vị/ml (U/ml) theo công thức: HP = molTyrosin n (U/ml) t Trong đó: 8: Toàn thể tích hỗn hợp phản ứng (2ml chất, ml dung dịch enzyme, ml dung dịch TCA 5%) t: Thời gian để enzyme tác dụng với chất (10 phút) n: hệ số pha loãng, Tính toán hoạt độ riêng (HĐR) protease: từ kết hàm lượng protein HLP (mg/ml) hoạt độ protease HP (U/ml) tính hoạt độ riêng enzyme: HĐR = HP (U/mg) HLP Bảng 3.2 Bảng số liệu xây dựng Đường chuẩn tyrosine x (mg/ml) OD 0,054 ΔOD 0,02 0,4861 0,04 0,762 0,08 1,1234 0,12 1,4589 0,16 1,8922 0,2 2,358 0,3 3,2585 0,4321 0,708 1,0694 1,4049 1,8382 2,304 3,2045 Hình 3.1 Đường chuẩn Tyrosine Phụ lục Các bước tiến hành tinh enzyme phương pháp sắc ký lọc gel [11,17] Dụng cụ thiết bị Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ (Hình 3.1) Phễu đổ gel Bình hút chân không Flow Adaptor 1,5 cm, Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm; thể tích: 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 () = 30 x (1,5/2)2 x 3,14), Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm: 50 Vòi hút chân không để khử bọt khí cho dung dịch Hóa chất Đệm phosphate 0,1M; pH 7,0: khử bọt khí trước dùng Gel “Bio-Gel P-100”, hãng Bio-Rad có đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45 - 90 m; khả ngậm nước: 12 ml/1 g gel khô; phạm vi phân tách: 5,000 100,000 Da Hình 4.1 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio – Rad Các bước tiến hành a Chuẩn bị gel Cân 12 g gel “Bio-Gel P-100” khô (chính xác cần dùng 11,4 g thể tích gel bị suốt trình thao tác nên cần cân dư), cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate (0,1M, pH 7,0) đựng cốc Dùng dung dịch đệm phosphate pH 7,0 nhiều gấp lần so với thể tích lớp gel cần cho cột, Cụ thể dùng 53ml x = 106 ml dung dịch đệm Đối với gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 20oC để hydrate hóa bắt đầu 100oC Sau thể huyền phù đồng hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, để ổn định suốt trình hydrate hóa Sau trình hydrate xảy hoàn toàn, gạn lớp bề mặt Chuyển dung dịch vào bình hút chân gắn với vòi hút chân không Khử khí dung dịch khoảng từ 5-10 phút, lắc nhẹ (xoay) bình Không dùng đũa khuấy làm hư gel Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp (106 ml) lắc nhẹ, Để gel ổn định 90 - 95% số hạt ổn định Gạn loại lớp bề mặt cách hút để loại hạt mịn Lặp lại công việc lần để loại bỏ 90% hạt mịn làm cản trở trình lọc gel Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát cột cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột, Rót dung dịch gel vào cột thành dòng di chuyển nhẹ Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột tránh bị bọt khí Khi lớp hình thành cột từ đến cm, mở khóa đầu cột cột nạp đầy gel (packed) Khi cột nạp đầy gel, khóa đầu (outlet) cột gắn flow adaptor.Mở khóa đầu cột cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy Đóng đầu cột điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp gel Nạp mẫu vào bề mặt lớp cách bơm tiêm mẫu vào lớp gel qua flow adaptor Nếu tiêm mẫu tốc độ dòng tiêm không vượt tốc độ dòng tách đề nghị b Chuẩn bị mẫu Mẫu chạy sắc ký phải (không bị nhiễm bẩn hạt rắn); hòa tan hoàn toàn dung dịch đệm Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45m) làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng cột c Thu xác định mẫu tách Dịch khỏi cột đo độ hấp thụ bước sóng 280 nm detector hệ thống sắc ký thể độ hấp thụ dạng sắc ký đồ phần mềm LP Data View máy tính Dịch thu tự động máy thu mẫu (collector), phân đoạn ml d Xác định hàm lượng protein hoạt độ protease sau tinh Thu fraction chứa dịch enzyme protease tinh qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác định hoạt độ enzyme protease theo phương pháp Amano, pH 7,0 hàm lượng protein theo phương pháp Lowry e Tính hiệu suất hoạt độ enzyme protease độ tinh enzyme sau tinh sắc ký lọc gel,  HTenzym2 x100 Hiệu suất hoạt độ enzyme HTenzym1 Trong đó: HTenzyme1: Hoạt độ enzyme protease trước tinh (U/ml enzyme trước tinh sạch) HTenzyme2: Hoạt độ enzyme protease sau tinh (U/ml enzyme sau tinh sạch) Hoạt độ riêng enzyme protease sau tinh (U/mg)  Độ tinh enzyme protease sau sắc ký  HTenzym2 HLproteinsautinhsach Hoatdoriengenzym2 Hoatdoriengenzym1 Trong đó: Hoatdoriengenzyme1: Hoạt độ riêng enzyme protease trước tinh Hoatdoriengenzyme2: Hoạt độ riêng enzyme protease sau tinh Phụ lục Các bước tiến hành xác định trọng lượng phân tử phương pháp điện di SDS-PAGE [16] Dụng cụ thiết bị Bộ điện di đứng (vertical electrophoresis) Bộ nguồn chạy điện di( electrophoresis power supply) Biorad Pipetteteman 1000μl Pipetteteman 200 μl Pipetteteman 10 μl Típ xanh: hộp Típ vàng: hộp Típ trắng: hộp Giấy lọc Giấy thấm Găng tay: đôi Phao để eppendorf Eppendorf pH kế Hóa chất N,N,N’,N’-tetramethylenediamide [C6H16N2 - TEMED] Dung dịch Acryamide/Bisacryamide 40 % (29:1) (3,3% C) β -Mercaptoethanol [HSCH2CH2OH] Sodium Dodecyl Sulfate [SDS] Ammonium persulfate [(NH4)2S2O8][APS] Coomassie Brilliant Blue G 250 dạng viên(Bio-Rad) Cồn tuyệt đối [99,5 độ] Methanol [CH3OH] Tris (hydroxymethyl) aminomethane Axit acetic Bromophenol blue Glycerol [C3H8O3] Glycine [C2H5O2N] Axit Clohydric [HCl] 10 Thang chuẩn có kích thước xác định sau:  Myosin 209.000 Da  2- β galactosidase 124.000 Da  BSA 80.000 Da  Ovalbumin 49.100 Da  Carbonic anhydrase 34.800 Da  Soybean trysin inhibitor 28.800 Da  Lysozyme 20.600 Da  Aprotinin 7.100 Da Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%: cân 10g SDS cho 100 ml nước cất vào khuấy tan hết Dung dịch đệm gel phân tách (saparating gel buffer) Tris - HCl 1,5 M, pH 8,8 – 0,4% SDS: cân 36,3g Tris pha 100 ml nước cất thêm dần HCl 6N khuấy dung dịch pH kế 8,8 Hút ml dung dịch SDS 10% cho vào Thêm nước cất cho đủ 200ml, lắc giữ 40C Dung dịch đệm gel gom (stacking gel buffer) Tris – HCl 0,5M, pH 6,8 – 0,4% SDS: cân 6,05g Tris pha 100 ml nước cất thêm dần HCl 6N khuấy dung dịch pH kế 6,8 Hút ml dung dịch SDS 10% cho vào Thêm nước cất cho đủ 100 ml, lắc giữ 40C Ammoniumpersufate 10%( pha trước dùng): cân 0,1 g cho vào eppendorf 1000 μl thêm 1ml nước cất, lắc đều, để nhiệt độ phòng Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8,3: pha dung dịch mẹ 10X chứa 30 g Tris, 144 g Glycine, 10 g SDS hòa 1000 ml nước cất Dung dịch nạp mẫu 2X ( 2X treatment buffer): có thành phần sau: 2,5 ml dung dịch đệm Tris - HCl 0,5M, pH 6,8; 4ml 10%SDS; ml Glycerol; mg Bromophenol Blue; 0,2 ml mercaptoethanol; thêm nước đủ 10 ml Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250 ml dung dịch nhuộm gel chứa 0,625g Coomassie Blue G 250, 112,5 ml ethanol tuyệt đối, 112,5 ml nước cất 25 ml acid acetic, lắc đều, giữ chai màu tối Dung dịch giải nhuộm: 30 ml methanol: 10 ml acid acetic : 60 ml nước cất Phương pháp đổ gel Chuẩn bị đổ gel có kích thước 100 x 100 x 0,75 mm có nồng độ acrylamide 10% 11 a Gel phân tách (separating gel) Cho thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch: 40% Acrylamide/Bis (29:1) 2,5 ml Tris – HCl 1,5M pH 8,8 – 0,4% SDS: 2,5 ml Nước cất 4,445 ml TEMED: μl Ammonium persulfate 10%: 50 μl Tổng thể tích: 10 ml Sau cho Ammonium persulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipettte Pasteur pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel cho mức dung dịch gel cao cm (tránh tạo bọt khí khuôn gel), Sau đó, nhẹ nhàng đặt lớp nước cất lên lớp gel để mặt gel phẳng,Chờ gel đông (khoảng 20–30 phút) b Gel gom (Stacking gel): Cho thành phần sau theo thứ tự vào Becher 50 ml khác: 40% Acrylamide/ 0,8% bisacrylamide: 0,5 ml Tris – HCl 0,5M pH 6,8 – 0,4% SDS: ml Nước cất 2,476 ml TEMED: μl Ammonium persulfate 10%: 20 μl Tổng thể tích: ml Sau gel phân tách trùng ngưng hoàn toàn, đổ bên Tiến hành đổ lớp gel gom cách dùng pipette Pasteur pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn Đồng thời đưa lược vào gel để tạo giếng mẫu (tránh tạo bọt khí khuôn gel) Sau gel trùng ngưng  tháo lược  lắp dĩa gel vào phận điện di  cho dung dịch điện di vào buồng điện di Chuẩn bị mẫu chạy điện di a Xử lý mẫu: Hút 30 μl dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) 30 μl dung dịch mẫu protein vào eppendorf sạch, đậy nắp búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy - 10 phút, Ly tâm 10000v/ phút 1-5 giây Chú ý nồng độ protein mẫu vừa đủ cho hàm lượng protein giếng không vượt 20 – 40 μg hàm lượng protein/ band không vượt 0,1μg 12 Đối với thang chuẩn protein (Biorad) hút μl vào eppendorf 1ml chứa μl nước cất 10 μl dung dịch nạp mẫu b Tiến hành chạy điện di + Dùng pipetteman 10 μl nạp mẫu vào giếng (20 μl /giếng), + Tiến hành chạy điện di ổn định dòng: 100V + Sau điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm chuẩn bị trước (2 - giờ) Sau đó, tiến hành giải nhuộm cách ngâm gel dung dịch giải nhuộm gel trở nên suốt không màu Sau nhuộm xong, protein phát nhờ vạch màu xanh lam gel suốt Hình 5.1 Thiết bị điện di SDS-PAGE Bio –Rad Xác định trọng lượng phân tử protein Đo khoảng cách di chuyển band protein từ gel phân tách tới band protein khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối Tính giá trị Rf: Rf = Khoảng cách di chuyển protein Khoảng cách di chuyển vạch màu bromophenol Blue Vẽ biểu đồ log10 giá trị trọng lượng phân tử protein chuẩn giá trị Rf chúng Trọng lượng phân tử vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử xác định giá trị Rf chúng thông qua phương pháp ngoại suy từ hình 13 Phụ lục Bảng số liệu kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease CPT Bảng 6.1 Thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease CPT Nhiệt độ (oC) ĐC 10 20 30 40 50 60 70 OD 0,0606 0,9862 1,1064 1,1652 1,1782 1,2144 1,2423 1,0006 ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) 0,9256 1,0458 1,1046 1,1176 1,1538 1,1817 0,94 0,07289 0,08508 0,09104 0,09236 0,09603 0,09886 0,07435 524,791561 612,5732833 655,5147581 665,0086216 691,4453799 711,8206715 535,3078406 HĐR (U/mg) 5,31604637 6,20525981 6,64024941 6,73642058 7,0042203 7,21061842 5,42257444 Bảng 6.2 Thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease CPT Nhiệt độ (oC) ĐC 10 20 30 40 50 60 70 OD 0,0548 0,9553 1,0879 1,1008 1,1632 1,1903 1,2389 0,9943 ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR (U/mg) 0,9005 1,0331 1,046 1,1084 1,1355 1,1841 0,9395 0,07 0,084 0,085 0,091 0,094 0,099 0,074 506,4611 603,2985 612,7193 658,2899 678,0809 713,5734 534,9427 5,130362 6,111308 6,206739 6,668361 6,868841 7,228373 5,418876 Bảng 6.3 Thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease CPT Nhiệt độ (oC) OD ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR (U/mg) ĐC 0,0706 10 0,9407 0,8701 0,06726 484,2601 4,905469 20 1,0602 0,9896 0,07938 571,5306 5,789504 30 1,1002 1,0296 0,08344 600,7425 6,085416 40 1,1298 1,0592 0,08644 622,3593 6,30439 50 1,1704 1,0998 0,09056 652,0093 6,60474 60 1,2006 1,13 0,09362 674,0643 6,828153 70 0,9511 0,8805 0,06831 491,8552 4,982406 Bảng 6.4 Bảng tổng hợp kết tính hoạt độ riêng protease CPT Nhiệt độ (oC) 10 20 Trung bình HĐR (U/mg) 5,12 6,04 0,119 0,126 Giá trị trung bình HĐR (U/mg) 5,12 ± 0,119a 6,04 ± 0,126b 30 6,31 0,168 6,31±0,168bc 40 6,57 0,134 6,57± 0,134cd 50 6,83 0,117 6,83±0,117de 60 7,09 0,131 7,09±0,131e Sai số 14 70 5,27 5,27±0,146a 0,146 Bảng 6.5 Bảng phân tích Duncan HĐR (U/mg) CPT Nhiệt độ (oC) 10 70 20 30 40 50 60 N 3 3 3 P < 0,05 a 5,12 5,27 b 6,04 6,31 c d 6,31 6,57 6,57 6,83 e 6,83 7,09 Phụ lục Bảng số liệu kết khảo sát độ bền nhiệt protease CPT Bảng 7.1 Thí nghiệm lần độ bền nhiệt protease CPT Nhiệt độ (oC) OD ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) ĐC 10 20 30 40 50 60 70 0,0433 0,5502 0,9661 1,0408 1,1009 1,1834 0,7693 0,4899 0,5069 0,9228 0,9975 1,0576 1,1401 0,726 0,4466 0,0304 0,0726 0,0802 0,0863 0,0946 0,0526 0,0243 219,0161 522,7467 577,2999 621,1908 681,4403 379,0242 174,9792 HĐR HĐ tương đối (U/mg) (%) 2,2186 5,2953 5,8479 6,2926 6,9029 3,8394 1,7725 43 88 93 96 101 54 34 Bảng 7.2 Thí nghiệm lần độ bền nhiệt protease CPT Nhiệt độ (oC) OD ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR HĐ tương đối (U/mg) (%) ĐC 10 20 30 40 50 60 70 0,0452 0,5402 0,9493 1,0064 1,0809 1,1635 0,7906 0,4723 0,495 0,9041 0,9612 1,0357 1,1183 0,7454 0,4271 0,0292 0,0707 0,0765 0,0841 0,0924 0,0546 0,0223 210,326 509,09 550,79 605,197 665,52 393,192 160,738 2,1306 5,157 5,5794 6,1305 6,7416 3,983 1,6283 42 85 88 93 99 56 31 Bảng 7.3 Thí nghiệm lần độ bền nhiệt protease CPT Nhiệt độ (oC) OD ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR HĐ tương đối (U/mg) (%) ĐC 10 20 0,0411 0,5411 0,9201 0,5 0,879 0,0297 0,0682 213,977 490,76 2,1676 4,9713 42 82 15 30 40 50 60 70 1,0097 1,0506 1,1598 0,7491 0,4867 0,9686 1,0095 1,1187 0,708 0,4456 0,0772 0,0814 0,0925 0,0508 0,0242 556,194 586,063 665,812 365,879 174,249 5,6342 5,9367 6,7446 3,7063 1,7651 89 90 99 52 33 Bảng 7.4 Bảng tổng hợp kết tính hoạt độ tương đối (%) protease CPT Nhiệt độ (oC) 10 Trung bình HĐ tương đối (%) 42 20 Sai số Giá trị HĐ tương đối (%) 0,499 42 ± 0,499b 85 1,555 85 ± 1,555d 30 90 1,298 90 ± 1,298e 40 93 1,566 93 ± 1,566e 50 100 0,78 100 ± 0,78f 60 54 1,127 54 ± 1,127c 70 33 0,889 33 ±0,889a Bảng 7.5 Bảng phân tích Duncan hoạt độ tương đối (%) protease CPT Nhiệt độ (oC) N 70 10 60 20 30 40 50 P < 0,05 a 33 3 3 3 b c d e f 42 54 85 90 93 100 Phụ lục Bảng số liệu kết khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease CPT Bảng 8.1 Thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease CPT pH OD ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR (U/mg) ĐC 10 0,1951 0,8418 1,0518 0,9943 1,0148 1,2067 1,2422 1,4901 1,2267 1,0024 0,6467 0,8567 0,7992 0,8197 1,0116 1,0471 1,295 1,0316 0,8073 0,0446 0,0659 0,06007 0,06215 0,08161 0,08521 0,11036 0,08364 0,06089 321,1116746 474,4740846 432,4819961 447,4530885 587,5971194 613,5226696 794,5633431 602,2030632 438,3974034 3,25280488 4,80633917 4,38096669 4,53262123 5,95225565 6,21487692 8,04878716 6,1002113 4,44088872 16 Bảng 8.2 Thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease CPT mM pH OD ΔOD HP (U/ml) HĐR (U/mg) tyrosine ĐC 0,1287 0,8018 0,6731 0,047 340,3915 3,448106 1,0118 0,8831 0,069 493,7539 5,001641 1,0003 0,8716 0,067 485,3555 4,916566 1,0051 0,8764 0,068 488,8609 4,952075 1,1799 1,0512 0,086 616,5169 6,245208 1,2005 1,0718 0,088 631,561 6,397602 1,4518 1,3231 0,113 815,0847 8,256665 1,2048 1,0761 0,088 634,7013 6,429413 10 1,0012 0,8725 0,068 486,0128 4,923224 Bảng 8.3 Thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease CPT mM pH OD ΔOD HP (U/ml) HĐR (U/mg) tyrosine ĐC 0,1984 0,7988 0,6004 0,0399 287,2989 2,910288 1,0097 0,8113 0,06129 441,3186 4,47048 0,9985 0,8001 0,06016 433,1393 4,387625 1,0116 0,8132 0,06149 442,7062 4,484536 1,1865 0,9881 0,07923 570,4351 5,778408 1,1968 0,9984 0,08027 577,9572 5,854605 1,4388 1,2404 0,10482 754,6891 7,644868 1,2139 1,0155 0,08201 590,4453 5,981107 10 0,9928 0,7944 0,05958 428,9766 4,345457 Bảng 8.4 Bảng tổng hợp kết hoạt độ riêng protease CPT pH Trung bình HĐR (U/mg) Sai số Giá trị trung bình HĐR (U/mg) 3,20 0,158 3,02 ± 0,158a 4,76 0,155 4,76 ± 0,155b 4,56 0,178 4,56 ± 0,178b 4,66 0,149 4,66 ± 0,149b 5,99 0,137 5,99 ± 0,137c 6,16 0,161 6,16 ± 0,161c 7,98 0,182 7,98 ± 0,181d 6,17 0,135 6,17 ± 0,135c 10 4,57 0,177 4,57± 0,177b Bảng 8.5 Bảng phân tích Duncan HĐR (U/mg) CPT pH N P < 0,05 a b c d 3,20 4,56 10 4,57 4,65 3 4,76 5,99 6,15 6,17 7,98 17 Phụ lục Bảng số liệu kết khảo sát độ bền pH protease CPT Bảng 9.1 Thí nghiệm lần độ bền nhiệt protease CPT pH OD ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR HĐ tương đối (U/mg) (%) ĐC 10 0,1018 0,4079 0,4697 0,4803 0,6811 0,9007 0,9846 1,4001 0,8879 0,5702 0,3061 0,3679 0,3785 0,5793 0,7989 0,8828 1,2983 0,7861 0,4684 0,0101 0,0163 0,0174 0,0378 0,06 0,0685 0,1107 0,0587 0,0265 72,372 117,5 125,25 271,89 432,26 493,53 796,97 422,92 190,9 0,7331 1,1903 1,2687 2,7542 4,3787 4,9994 8,0732 4,2841 1,9338 23 25 28 59 73 81 101 69 42 Bảng 9.2 Thí nghiệm lần độ bền nhiệt protease CPT pH OD ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR HĐ tương đối (U/mg) (%) ĐC 10 0,2009 0,5109 0,5723 0,5891 0,7948 1,0028 1,0649 1,4962 0,9899 0,6709 0,31 0,3714 0,3882 0,5939 0,8019 0,864 1,2953 0,789 0,47 0,0104 0,0167 0,0184 0,0392 0,0603 0,0666 0,1104 0,059 0,0267 75,2206 120,061 132,33 282,552 434,454 479,805 794,782 425,033 192,068 0,762 1,2162 1,3405 2,8622 4,4009 4,8603 8,051 4,3055 1,9456 24 26 29 61 73 79 101 70 43 Bảng 9.3 Thí nghiệm lần độ bền nhiệt protease CPT ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR HĐ tương đối (U/mg) (%) 0,5003 0,5592 0,5992 0,7995 1,0079 1,0756 1,4806 0,9994 0,3004 0,3593 0,3993 0,5996 0,808 0,8757 1,2807 0,7995 0,0095 0,0154 0,0195 0,0398 0,061 0,0678 0,1089 0,0601 68,21 111,22 140,44 286,71 438,91 488,35 784,12 432,7 0,691 1,1267 1,4226 2,9044 4,4461 4,9469 7,943 4,3832 22 24 31 62 74 80 99 71 0,6603 0,4604 0,0257 185,06 1,8746 41 pH OD ĐC 0,1999 10 18 Bảng 9.4 Bảng tổng hợp kết tính hoạt độ tương đối (%) protease CPT Trung bình HĐ tương đối (%) 23 25 0,559 25 ± 0,559b 29 0,974 29 ± 0,974c 61 0,96 61 ± 1,96e 74 0,331 74 ± 0,331g 80 0,659 80 ± 0,659h 100 0,504 100 ± 0,504i 10 70 42 0,488 0,481 70 ± 0,488f 42 ± 0,481d pH Sai số Giá trị HĐ tương đối (%) 0,644 23 ± 0,644a Bảng 9.5 Bảng phân tích Duncan hoạt độ tương đối (%) protease CPT pH 10 N 3 3 3 3 a 23 b c d P < 0,05 e f g h i 25 29 42 61 70 74 80 100 Phụ lục 10 Bảng số liệu kết khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt độ protease CPT Bảng 10.1 Thí nghiệm lần ảnh hưởng ion kim loại đến HĐ protease CPT mM HĐR Tỷ lệ ảnh Ion kim loại OD ΔOD HP (U/ml) tyrosine (U/mg) hưởng % ĐC 0,6019 enzyme 1,2158 1,0207 0,08253 594,2428238 6,01957547 100 Ca 1,4071 1,212 0,10194 733,9486763 7,43477123 119,7 Mg 1,0759 0,8808 0,06834 492,0742469 4,98462572 82,2 Zn 1,0088 0,8137 0,06154 443,0713054 4,48823453 74,2 Cu 0,9599 0,7648 0,05658 407,3597728 4,12648298 70,0 Hg 0,5668 0,3717 0,01671 120,2799473 1,21841475 23,4 19 Bảng 9.2 Thí nghiệm lần ảnh hưởng ion kim loại đến HĐ protease CPT Ion kim loại ĐC OD ΔOD mM tyrosine HP (U/ml) HĐR (U/mg) Tỷ lệ ảnh hưởng % 0,6019 1,2158 1,0207 0,08253 594,2428238 6,01957547 100 Ca 1,4071 1,212 0,10194 733,9486763 7,43477123 123,5 Mg 1,0759 0,8808 0,06834 492,0742469 4,98462572 82,8 Zn 1,0088 0,8137 0,06154 443,0713054 4,48823453 74,6 Cu 0,9599 0,7648 0,05658 407,3597728 4,12648298 68,6 enzyme Hg 0,5668 0,3717 0,01671 120,2799473 1,21841475 20,2 Bảng 10.3 Thí nghiệm lần ảnh hưởng ion kim loại đến HĐ protease CPT ΔOD mM tyrosine 1,2089 1,0138 0,08183 589,2037732 5,96853077 100 Ca 1,3999 1,2048 0,10121 728,6905366 7,38150719 123,7 Mg 1,0863 0,8912 0,0694 499,6693377 5,06156266 84,8 Zn 1,0204 0,8253 0,06271 451,5427528 4,57404881 76,6 Cu 0,9798 0,7847 0,0586 421,8926869 4,27369884 71,6 Hg 0,601 0,4059 0,02017 145,2561112 24,7 Ion kim loại OD ĐC 0,6518 enzyme HP (U/ml) HĐR (U/mg) Tỷ lệ ảnh hưởng % 1,4714189 Bảng 10.4 Bảng tổng hợp kết hoạt độ riêng protease CPT Ion kim loại Trung bình tỷ lệ % Sai số Ca Mg Zn Cu Hg 122,3 83,3 75,1 70,1 22,8 1,301 0,786 0,742 0,867 1,337 Giá trị tỷ lệ ảnh hưởng % 122,3 ± 0,301e 83,3 ± 0,786d 75,1 ± 0,742c 70,1 ± 0,867b 22,8 ± 1,337a Bảng 10.5 Bảng phân tích Duncan Ion kim loại Hg Cu Zn Mg Ca N 3 3 a 22,8 b P < 0,05 c d e 70,1 75,1 83,3 122,3 [...]... dinh dưỡng của chúng là cần thiết Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) nuôi tại vùng biển Khánh Hoà” MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Mục đích: Tách chiết, tinh sạch và bước đầu xác định một số tính chất của protease nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm nuôi tại vùng biển Cam... biển Cam Ranh, Khánh Hoà  Nội dung nghiên cứu  Tách chiết protease từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm nuôi tại vùng biển Khánh Hòa  Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm enzyme protease thô được tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh + Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của protease + Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease + Khảo... dưỡng của tôm hùm, đặc biệt thức ăn cho tôm hùm xanh (Panulirus homarus) ở giai đoạn giống và nuôi thương phẩm Nên các 12 loại thức ăn tôm hùm sản xuất ở Việt Nam chưa đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của tôm Do vậy việc “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của protease nội tạng tôm hùm xanh nuôi tại vùng biển Khánh Hoà” là cần thiết nhằm góp phần làm cơ sở cho sản xuất thức ăn công nghiệp nuôi tôm hùm. .. thực tiễn của đề tài Đề tài cung cấp cơ sở dữ liệu về một số tính chất của protease nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm cho các nghiên cứu trong tương lai 3 Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học của tôm hùm xanh 1.1.1 Phân loại và hình thái Theo hệ thống phân loại của George và Holthuis (1965), tôm hùm xanh (tôm hùm đá) có vị trí phân loại như sau: Ngành chân đốt: Arthropoda... Sơ đồ quá trình nghiên cứu tổng quát 27 2.3.2 Tách chiết protease từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) Quá trình tách chiết thu chế phẩm enzyme protease thô từ nội tạng tôm hùm xanh được tham khảo từ các nghiên cứu của Ponnuswamy Vijayaraghavan (2011) và Nguyễn Lệ Hà (2011), các bước tiến hành được trình bày trong sơ đồ ở hình 2.3 Nội tạng tôm hùm xanh Nghiền trong Phosphate buffer (0,1 M, pH... - Thời gian: đề tài tiến hành từ tháng 2/2013 đến 02/2014 2.2 Vật liệu Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm (loại 150 – 200 g/con) được nuôi lồng bè tại vùng biển Cam Ranh, Khánh Hoà; tôm được bắt sống và đưa về phòng thí nghiệm để thu hồi nội tạng và chiết rút enzyme protease Hình 2.1 Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) dùng trong nghiên cứu (Hình ảnh do học viên tự chụp trong quá trình... hưởng của các ion kim loại hoá trị II đến hoạt độ của protease  Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel  Xác định trọng lượng phân tử của protease bằng điện di SDS – PAGE Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI  Ý nghĩa khoa học của đề tài Các số liệu nghiên cứu của đề tài bổ sung cho sự hiểu biết về hệ enzyme tiêu hoá protein của tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm  Ý nghĩa thực tiễn của đề... các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm protease thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh (Ponnuswamy Vijayaraghavan, 2011) 2.3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chế phẩm protease thô được nghiên cứu bằng cách xác định hoạt độ của protease ở những nhiệt độ khác nhau:10, 20, 30, 40, 50, 60 và 70oC với cơ chất là casein 1% pH 8,0 trong 10... (DGC) và tỷ lệ sống của tôm hùm xanh thí nghiệm khi cho ăn thức ăn có hàm lượng 10 protein và lipid khác nhau Kết quả phân tích cũng cho thấy thức ăn có hàm lượng protein 52% và lipid 11% là thích hợp nhất cho sự phát triển của tôm hùm xanh giai đoạn nuôi thương phẩm Tác giả Lê Xuân Sơn cũng đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ DHA/ EPA trong thức ăn tổng hợp đến sự phát triển của tôm hùm xanh. .. tốc độ phát triển và tỉ lệ sống của tôm hùm thấp khi chỉ ăn thức ăn tổng hợp của tôm Smith và cs (2005) thử nghiệm các mức protein từ 33 - 61% làm thức ăn cho tôm hùm bông (Panulirus ornatus) thấy rằng, tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống cao hơn so với cho tôm ăn bằng vẹm xanh và càng tăng mức protein trong thức ăn thì tốc độ tăng trưởng của tôm càng tăng, tuy nhiên tỷ lệ sống cao và ổn định (79 - 84%) ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRỊNH THỊ KIM LIÊN TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus) NUÔI TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HOÀ LUẬN... (Panulirus homarus) nuôi vùng biển Khánh Hoà” MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Mục đích: Tách chiết, tinh bước đầu xác định số tính chất protease nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai... thương phẩm nuôi vùng biển Cam Ranh, Khánh Hoà  Nội dung nghiên cứu  Tách chiết protease từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm nuôi vùng biển Khánh Hòa  Nghiên