Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu tính chất một vài endonucleaza giới hạn từ các nguồn vi sinh vật của việt nam

Đ Ạ■I H Ọ■ C Q U Ố C G I A H À NỘI ■ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN I i’ll đề tàỉ: TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VẢ NGHIÊN c ú n TÍNH CHẤT MỘT VÀI _ IỈNDONUCLEAZA GIỚI HẠN TỪ CÁC NGUỔN Ví SINH VẬT CỦA VIỆT NAM ■ I Mã s ố : ọ c 97.10 C hủ trì dề tài: P G S T S N gu yễn Viln Mùi 0/ HOC £■uOC GiA h/- rRUN-v THÕNG l l nội, lliáng 1-2000 Đ Ạ• I H Ọ■C Q U Ố C G I A H À NỘI • TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN Tên đề lài: TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT MỘT VÀI ENDONUCLEAZA GIỚI HẠN TỪ CÁC NGUỎN VI SINH VẬT CỦA VIỆT NAM Mã s ố : ỌG 97,10 C hủ trì đề tài: P G S TS N guyễn Vãn M ùi C ác t n tham gia: GS TSKH Nguyễn Đình Quyến TS Phan Tuấn Nghĩa TS Vũ Thị Minh Đức ThS Ta Thị Bình CN Phạm Hải Yến CN Nguvẽn Thị Bích Liên H nôi, tháng 1-2000 15ÁO C Á O T Ú M T Ắ T c ac e n ilonucleaza g iớ i hạn có khả phân cát phan III A D N Iiliững trình lự (lạc hiệu Vì “cơng c ụ ” dặc biệt cho sinh li"c phân lư côn g nghệ sinh học Hiện có 400 loại c n / i m giới liíin (lã (lượclinh SỊich Irong số hàng ngần loại đirơc pliát Các c n /im g iớ i hạn có mặt ỡ nhiều lồi vi khn, I1ƯOV ta r;ìl (ỈÍI dạng CÍÌC lồi vi sinh vật, chúng nguồn enzirn giới han tài phong phú Vì ch ún g lỏi tiến hành (tiều tra, lách chic) tinh I11ỘI vài cnzim giới hạn có Irong số vi sinh vậl phân lập (lược, (V Việt nam Cong Irình (lược 111ực (rong năm từ tháng 7-1997 đơn tháng - 1t?t>cí lim (lưực số kél quá: Trong chúng vi khuẩn phân lập được, plìál I chung có c n / i m giỏi hạn có hoạt tính lất cao (chiếm tỷ lệ 1/5) Troll*’ I } 1)1! x;i klniíin, cỏ cluing có biểu có enzim giới hạn (chiếm lý ]ệ l/í') íìn /.im g iớ i hạn clìủ n g vi k liu ẩ n Xíìc đ ịn li (lược ỈỈ.IC III m ol loại Cíli pliíln lư A D N \ cho đđu (đẩu tù) Đệm chiêì enzim Mac 111 chùng vi khuẩn lúiy có pM kliií I ík l \ lirn Ileparin Si'pliaroza CL-6 B c n / i m Mac III có độ c;to VÌI cu lM'1111 hr(f kDa - fj>ict! kiện pliỏn ứng tliícli họp cho enzim lỉae III cùa chung vi kliu;m nily hì 'lẹm NBB2, ion M g 3'1" nhiệt độ 37°c mội số chủng xạ khuẩn cíing Ị>1lát có e n / i m gioi h;m Chúng xạ khuẩn 18 Saclỉ (cnzim cát ADN ) lạo drill sh;tn ling cu;i cnzym giới hạn chúng vi sinh vật Bước đầu tinh enz.vin giới hạn (liều kiện có ctm phòng Ilì í nghiệm góp phồn vào nghiên cứu bán cnzym ịiiới han Cơng trình n a V thực Bộ mơn Hố sinh - Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Qu ốc eia Hà nội từ 7/19^7 (lèn 7/1999 V NỘI DUNG 1.1 N < ỈU V Ê N L I Ệ U VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P N í ỉ H I È N C Ủ I ỉ 1.1.1 N G U Y Ê N L I Ê U Đối lượng: Chúng vi khuẩn xạ khuẩn dể đici! tra cn/.ym giới hạn (lược phan )â|> lừ Bộ môn Vi Sinh học, Trung ỉílin Vi sinh vàl học ứng clụiiịi Khoa Sinh học- Trường đại học Khoa học lự nhiên Đại hục Quốc gia Hà nội Các nòi vi sinh vật để thử hoạt lirih lizozym dơ phòng sinh học philii tử Viện Vệ sinii dịch tễ cung cấp ÍT I Nuôi cấy 1rên môi Irường dịch thể O TBI5 IV k)CD 10 Ni Irên mơi trường dĩa thạch (ÌB4 MBA ;> n ) i ( >2 I ỉố chai: I p.nym a ịói hạn chuẩn: Soc lí ỉlu n l 111, ĩ:('()/ỉ\' Hi/Iiỉỉỉ I A/ir'l, l i (1C ĩ ỉ I cua hãng BioLabs (Mỹ) -! Lizoxyin cua hãng SIGMA (Mỹ) - - + ÀDN chuẩn: AL)N X, (|>X174, AN D T7 hãng Bin! ,;ihs + Acrylamit, Bis-acrylamit, Tris-HCI, Tris-bazcf Eliđium Bromil Ỉ E M E D , EDTA, 2-Mercaptoetanol, Trixton X-I) ScpliíicIVI S-200, Heparin Sepharo7a C L B hãng Phaim;icia ( lliụy Điển) + Pcpton, cao nấm men, DHAE-Xenluiiva, BSA cùa hãng Sigma (Mỹ) I l i ic l hi m a y : + Ly !Ain lạnh: Sorvall RC - 5B Refrigerated SU|H’I speed Centrifuge (Mỹ) \- Máy siêu âm: Soniprep 150 (Anh) -f Máy soi: Hoefcr - Macro Vue UVis - 20 (Mỹ) + M áy quang phổ: Sliimadzu Speclrophotomclcr 11V + Bỏ chạy diện di nằm nhỏ lớn Bio - Ratl í Mỹ) VIS(NI)àl) + Bọ chạy điện di dứng: Hocíer - Pharmacia (Tluiỵ Điên) Cíìc liố chít! dụng cụ Ihí nghiệm khấc phòng thí nghiệm cua Bơ mòn Hố sinh học-Trường (.lại học Khoa học (ự nhiên - Đại học (,)|| li/(>/\ in CliLiii’n bị ít' hào phrin xác định độ (lục- Hti! loŨML! tc b;H> (V ii\c nong Lay 990 Ị.IỈ nước Cíìt, cho lliêm 10 ụl (licỉi lè l'hn (a) pha lìng (Ill'll a cách lâv 99(1 fil inrớc Cell roi cho them in Ịìl (lit h II (h) liòp lục pha lỗng, làv l>-)0 ụl mrớc cài cho thêm 10 Ịil dịch b (ci l.;ì\ ^ ||| (lịch c ( I r') câ\ tlcn lên dĩa thạch, II 37 (’c Đế m sơ’ lượng lẽ bìm -56- E N Z N u Y ố M i c ấ G I Ớ I y t ế b H Ạ N T Ừ C H Ủ N G X Ạ K H U Ẩ N n o o Chủng xạ khuấn N 018 phân lập Việt Nam tiến hành nuôi đĩa thạch Isp4 (hình 27) H ì n h : K h u ẩ n l c n ò i x k h u ẩ n N n u ô i c ấ y t r ê n m ỏ i t r n g I s p Sau nuôi cấy, khuẩn lạc chuyển vào môi trường dịch thê LB, thu sinh khối tế bào để điều tra có mặt enzim giới hạn có nòi xạ khuẩn Đ i ề u t r a s ụ c ó m t c ủ a e n z i m g i i h n Ly tâm dịch thể LB ni cấy thu tế bào Hồ tế bào đệm pha loàng A theo tỷ lệ l g tế bào : 5ml đệm Siêu âm phá tế bào đến m A , phút - ‘’c để tránh làm hoạt tính enzim Dịch tế bào ly tâm 15000 vò n " /phút 30 phút 0°c Loại bỏ kết tua, thu lấy dịch để điều tra có mật enzim giới hạn -57- A D N À sử dụng để phát hoạt tính cắt enzim giới hạn |il dịch chiết thô {dịch ly tâm ) pha loãng nồng độ khác đệm phản ứng ủ với A D N X 37°c Hỗn hợp sau phản ứng điện di gel agaroza 0,5% Kết thu hình 28 H e ì n n z h i m t : P x h ổ k đ h u i ệ n ẩ n d N i A D N t r ê n g e l a g a r o z a d i t 1- A D N Ả chuẩn 2- A D N Ả cắt Sac ỉ ỉ 3- A O N Ầ + dịch chiết pha loãng y/9 4- A D N Ả + dịch chiết pha lỗng ÌỈ27 5- A O N Ả + dịch chiết p loãng I /81 ỏ- A D N Ả + dịch chiết pha loãng I /243 c d ụ n g c ủ a d ị c h c h i ế t -58- Hình 28 cho thủy co khác cách lõ lệt VC CÍÍC hăntí ADN cột gcl lượng ADN X làm phán ứng Ỏ CỘ I gel tlịc-li cliiủì pha lỗng 1/9 nên hàm lượng nucleaza dịch chièl có thó nhiều khiên A D N hị cắt nho (nái) Vì vậv chạy diện (li khơng nhìn Iluìv băng ADN cột gcl mà vệt sáng u v Ó cột gel thứ ứng với nồng độ pha loãng 1/27, hàm lượng nuclea /a không dặc hiệu bị giám đáng ké nén xuất hăng ADN không dược sắc Iicl Khi pha ■lỗng dịch chiêt tới i/81 kết cho thấy hoạt tính c n /i m giới hạn cua chung xạ khuẩn Nn I thể lố! (cộl gel thứ 5), VỊich ÀDN tương line với vạch ADN Ằ cắl bàng Sac II chuẩn Riêng (lộ pha loãng C |iiá CỘ I gcl thư '1(1 none lớn 1/243 nên hàm lượng enzim khơng chí liu kê Vì vộy hn;i! tính cùa e n / i m cắl ADN ) rõ ràng Do (1(1 cn/iin lách dược lù nòi xạ kluiắn N0 18 có hoạt lính tương lự Sơ( II tál /\l >N } giống như,S'í/f 1! lức cắt ADN Ằ đoạn nucỉeolil có !rình tự: y ccG C G G :v V GGCGCC 5' Ọua (16 cliíinu tơi thấy hoạt lính enziin giới han 1hê lơt nliỉìl l;ú nồng (lộ dịch chiCì pha lỗng 1/8! -59- E N Z N u Y M i c ò G ấ I y Ĩ I t ế b H Ạ N T Ừ C H Ủ N G X Ạ K H U A N n o o C hủng xạ khuán N fJ20 trung tâm vi sinh học ứng dụng cung cấp Chúng xạ khuân tiến hành nuôi cấy đĩa thạch mỏi trường Isp để thu khuẩn lạc H ì n h : C c t ế b o x k h u ẩ n N n u ó i c ấ y t r ẽ n m ó i t r n g t h c h I s p Sau xạ kh uẩn m ọc đĩa thạch, khu khuẩn lạc ch uyển vào môi trường lỏng LB Các tế bào xạ khuẩn N(j20 nuôi môi trường dịch lỏng LB sử dụng làm ng uồn cung cấp enzim Đ i ề u t r a s ự c ó m ặ t c ủ a e n z i m g i ó i h n C hú ng xạ khuẩn N (l 20 môi trường dịch đem li tâm , 5.000 v/p 4°c 10 phút đê thu nhận tế bào Tiến hành phá vỡ tế bào siêu âm nhiệt đô - 4" c phút Quá trình siêu ám tiến hành khơng liên tục, kh ốn g 15 - 20 giây lại ngừng thời gian tương đương để đảm báo k h n g có sư tăng nhiệt đáng kế -60T ế bào phá vỡ đem ly tâm 15.000 v/p 0°c 30 phút để loại bỏ mảnh vỡ tế bào thu dịch phía để điều tra có mặt enzim giới Dịch chiết thô làm phản ứng với ADN X ủ phản ứng 37"c giờ, sau bất hoạt enzim 65° ] phút dừng phán ứng Điện di sản phẩm phản ứng gel agaroza 0,5 % Kết thu hình 30 H ì n h c h i ế t t h ỏ : P t h ổ c đ h ủ i ệ n g n d x i A k h D u X N ẩ n N t r ê n g e l a g a r o z a d i t c d ụ n g c u a d ị c I: M arker: A D N Ả ỉ H in d III 3: RES p h a loãng lần + A D N Ã * 5: RES p h a loãng 81 lần + A D N Ả 2: A D N Ầ dược cắt XỈU) Ị chuẩn 4: RES p loãng lần + A D N Ả 6: RES p h a loãng 243 ỉ án + A D N Ả h -61Qiiíi kC’t qua nhân tlưực chúng toi thí\ỵ (rong dịch cliiot Ic bỉm rt' c;íc en/im-cắt ADN X thành nliiều băng Irong dó hăng ADN có độ di động diện 9I I() 17: 4781 24 Karyagina As Levchenko IY Nikolskaya II.: A new melhoil lor isolaiion and purification of restriction endonuclease Biot'hcmislry, Russia, Ỉ993 58(6): 622- 62.6 25 Katsutoshi Misc and Katsuhsia Nakajima: Puri l ie ill inn of a new reslTiclion encionuclcasc, Sly I, from Esclicrichia col i carrying the hsd+ miniplasmicl Gene, 1958, 33 , 357 - 361 26 Kelly T i, Smith H.O.: A lesticlion enzyme from I fomophihis influenzae II., Base sequence of the recognition silc J.mol Biol 1970 51: 409 27 La emmli U.K.: Cleavage of structural protein during the assembly ol I 28 he head of bacteriophage T4 Nature, 1970, 277: 680 John sto ne A., Robin Thorpe: Basic techniques Immunochc misiiy in practice, m1 Blackwell scientific publication 1-2 1987 29 La Lie F Evans L.R Jarsch M Brown N.L and Kessler Pulsed field gel electrophoresis, Biotechniqucs 1991, 7.1: 34 - 42 30 L'V.VCI C.R.: Topics in Enzvmes and Fermentation Biotechnology, W ise m an A., ed Biles I lot wood, cliicheslcr UK 1984, l) 78- IM - 66- 31 Luhert Slryer: Restriction enzymes split DAN into specific IYii»mcnl Biochemistry, 4'h, W.H Freeman and Com pany Ncwyork IW.f 120- 122 32 Mamatis r., Fritch E F., Sambrook J.: Enzymes used in molcrcubu cloning, M ole cular cloning, A laboratory manual 2ml eel Vol I Cold Sprin, Harbor laboratory Press, USA, 1989 33 Mchara R.S., M alholra V.P., Rem bholkar G.W.: Rapid pi.rificalinii of ii restriction en nu clea se from Escherighia coli R Y I Biotechnology techniques, 1993 Vol (6): 41 1-414 34 Meselon M and Yuan: DNA restriction enzyme from Escherichia coli Nature Í 96,S 217: I I 10 35 Nathan D and Smith H.O.: Restriction endonuceasc in Ihc analysis ami restructuring o f DNA molecules, Ann Rev Biocheni., 1975, 46: 273293, 36 New England Biolabs: Catalog of restriction endonuclease 1997 37 Patricia J Green, Herbert L.: A general method for the pm i I K ill ion pf restriction enz ym es , Nuclease Acid - Res, 1978, vol - 7, 1978 237.1 2379 38 Peler A Luke and Stephen E Halford: Solubility of the IxoRI restriction en nuclea se and its purification from an over - pii'iliicinii strain, Gene, 1985, 37: 241-246 w Phillip A S., Bill S and Joe s.: Detection of two rcsiiiclion endonuclease activities ill Haemophilus parainflucnzac using analyticiit aiiiirosc- Ethidium bromide eleclrophoresisl Two icsiiiciinn en donuclcas , ill H Para influenzae, Biochemistry, 1973 Vol 1056-3063 12, 16 -6740 Pocli M.T., isoschizomer Somkuli G.A.: from Isolation of Sag agalactiae., Applied Í, a new Mac Microbiology ill and Biotechnology, 1995, 43 (2): 282- 284 41 Pristas p., Vanat I., Javorskyp.: Isolation and characterization OÍ a new restriction endonuclease, SlU 30DI, from Selenomonas ruminanliitm Gene, 1995, 158: 139-140 42 Ọiang B.Q., Schildkraut I.: Two unique restriction entlonuclcasc from Neisseria lactamica, Nucl, Acid Res, 1986, 14: 1991-1999, 43 Rcaslon j., Duyvesíeyn M.G.C and Dewaard A.: Acyanobaclcium which contains five sequence specific deoxyribonuclease Gene 1982 20: 103-1 10 ịậ Schilclkraiil I.: Screening endonucleases., Gene Eng , i 984, 6: 117- 140 15 Smith H i).: Nucleoticl Sequence specificity of restriction endoniK leave Scicucc, 1979, 205, 4405: 455 - 462 t6 Smith M.o and Wilcox R.W: A restiction enzyme from Haemophilus influenzae, !.Purification anti general properties J Mol Biol 1970 SI: 379 17 Smith H.O., Nathans, D.: A suggested nomenclature lor biictcria! host modification and restriction systems ant! their enzyme I Mt’l Riol 1973, 81: 4! 18 Sonani L.L a::d Bhandari S.C.: Soil microorganisms and crop growth Indian, 1990, 10-31 Ỉ9 William J.G Palicnl, R.K.: Cicnetic engineering, E D Rickw.unl l> IRL press USA, 1991 '0 Wilson G.B and Murray N.E.: Restiction and modification systems, Ann Rev (icnel., 1991 25: 585- 627 for -Ố85I Winnackt'i F I From genes to clones: Introduction 1(1 gene lt't hiiol(ig\, T r a n s i t i o n from German by Horst Ibeganfls, VCM, Ncwyoik 1987 52 Zc'haznaya EV Nikiforow w Zheleznaya LA Matvienko Nl.: Specific enclonuclcase Aba I from Azospirillum brasilcnse IJQ 1976 is an isos ochisomer o f endonuclease B cl , Biochemistry - Russia 1^97, 62 (4): 343- 349 P K Ế T Q U H Ả I Ế N U G Đ H Ẫ I Ê N N G K Ý cứu K H - C N 'lên dề lài: Điểu tra, tinh nghiên cứu tính chất vài endonucleaza ciới han lừ c Iiguổn vi sinh vạt cùa Viêt nam MA sô: ỌG.97.10 ( 'm’ h;tn ling cu;i cnzym giới hạn chúng vi sinh vật Bước đầu tinh enz.vin giới hạn (liều kiện có ctm phòng Ilì í nghiệm góp phồn vào nghiên cứu bán cnzym