Tách chiết và tinh sạch enzym nattokinaza sinh ra bởi chủng bacillus subtilis

Luận văn thạc sỹ khoa học NGUYỄN THỊ HỒNG NGÂN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ HỒNG NGÂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYM NATTOKINAZA SINH RA BỞI CHỦNG BACILLUS SUBTILIS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2009-2011 Hà Nội – 2011 Nguyễn Thị Hồng Ngân Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ HỒNG NGÂN TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYM NATTOKINAZA SINH RA BỞI CHỦNG BACILLUS SUBTILIS Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN LAN HƯƠNG Hà Nội – 2011 LỜI CẢM ƠN Nguyễn Thị Hồng Ngân Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Lan Hương – Giảng viên Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, người có nhiều cơng sức tận tình hướng dẫn, theo dõi sát đóng góp ý kiến q báu cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tập thể cán Viện Đào tạo Bồi dưỡng Sau Đại học, Viện công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bách Khoa Hà nội nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập thực luận văn tiến độ Tơi xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè cổ vũ, động viện giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 29 tháng 11 năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Ngân Nguyễn Thị Hồng Ngân Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khóa học mà thân trực tiếp thực Tất số liệu kết trình bầy luận văn trung thực khách quan chưa cơng bố cơng trình khác `````````````````````` Hà Nội, ngày 29 tháng 11 năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Ngân Nguyễn Thị Hồng Ngân Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học MỤC LỤC MỤC LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 T 32T T T T 32T 32T T 1.1 Bệnh tim mạch 11 1.2 Đậu tương 12 1.3 Natto 14 1.3.1 Hiệu dinh dưỡng Natto-thực phẩm chức 14 1.3.2 Ngăn ngừa chứng tim mạch Natto: an toàn rẻ 15 1.4 Enzym Nattokinaza 16 1.4.1 Cấu trúc Nattokinaza 16 1.4.2 Cơ chất enzym nattokinaza 16 1.4.3 Cơ chế tác dụng enzym nattokinaza 17 1.4.3.1 Q trình đơng máu hịa tan cục máu đơng 17 1.4.3.2 Cơ chế tác dụng nattokinaza [23] 19 1.4.4 Nguồn vi sinh vật tổng hợp enzym Nattokinaza 19 1.4.5 Đặc điểm hóa sinh enzym thủy phân fibrin từ vi sinh vật [63] 22 1.5 Sản xuất enzym thủy phân fibrin từ nguồn vi sinh vật 24 1.5.1 Các phương pháp lên men thu nhận Nattokinaza 25 1.5.1.1 Phương pháp lên men bề mặt 25 1.5.1.2 Phương pháp len men lỏng 26 1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp enzym nattokinaza 27 1.5.3 Đặc điểm chế phẩm natto tạo từ phương pháp lên men 31 1.5.4 Các phương pháp tách chiết thu nhận enzym 33 1.5.4.1 Phương pháp chiết enzym từ canh trường lên men bề mặt 33 1.5.4.2 Phương pháp ly tâm 34 1.5.4.3 Phương pháp thu nhận enzym 34 1.5.4.3.1 Phương pháp kết tủa 35 1.5.4.3.2 Phương pháp lọc 36 1.5.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình thu nhận enzym nattokinaza 37 1.6 Tình hình nghiên cứu, sản xuất ứng dụng nattokinaza giới Việt Nam 38 T 32T T 32T T 32T T T T T T 32T T T T T T T 32T T 32T T T T T T T T T T 32T T 32T T T T T T T T 32T T 32T T 32T T 32T T 32T T T T T 32T CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 T 2.1 Nguyên vật liệu hóa chất 42 2.1.1 Nguyên liệu 42 2.1.2 Hóa chất 42 2.2 Thiết bị sử dung 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu 42 2.3.1 Phương pháp vi sinh 42 2.3.2 Phương pháp hóa sinh 43 2.3.2.1 Định tính hoạt tính nattokinaza phương pháp đo vịng thủy phân 43 2.3.2.2 Định lượng nattokinaza phương pháp so mầu 43 2.3.2.3 Phương pháp điện di SDS-PAGE 44 2.3.2.4 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford 45 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 46 T T T 32T T 32T T 32T T T T T T T 32T T 32T T 32T T 32T T T T CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 T Nguyễn Thị Hồng Ngân T Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinaza cao 48 3.2 Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu đến khả sinh tổng hợp nattokinaza 49 3.2.1 Lựa chọn nguyên liệu đậu thích hợp cho q trình sinh tổng hợp nattokinaza 49 3.2.2 Phân tích thành phần hóa học đậu tương 51 3.2.3 Ảnh hưởng vỏ đậu phương pháp lên men đến khả sinh tổng hợp NK 51 3.4 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sinh tổng hợp NK chủng D 54 3.4.1 Ảnh hưởng lượng dịch hàm lượng đậu tương 54 3.4.2 Ảnh hưởng pH ban đầu lên khả sinh tổng hợp NK 55 3.4.3 Ảnh hưởng nguồn Nitơ bổ sung lên khả sinh tổng hợp NK 56 3.4.4 Ảnh hưởng muối khoáng lên khả sinh tổng hợp NK 57 3.4.4.1 Ảnh hưởng CaCl lên khả sinh tổng hợp NK chủng D 57 3.4.4.2 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO 58 3.4.4.3 Ảnh hưởng hàm lượng K2HPO4 59 3.4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ giống 59 3.4.6 Ảnh hưởng phương pháp xử lý nhiệt bột đậu tương 60 3.5 Lên men chìm sinh tổng hợp nattokinaza quy mơ phịng thí nghiệm 60 3.5.1 Động thái sinh sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp nattokinaza chủng Bacillus subtilis natto D quy mơ bình tam giác 60 3.5.2 Lên men quy mơ lít 62 3.6 Tách chiết thu nhận enzym nattokinaza sinh tổng hợp chủng D theo phương pháp lên men chìm 62 3.6.1 Thu dịch enzym thô 62 3.6.2 Kết tủa enzym 62 3.6.3 Thu nhận chế phẩm kỹ thuật 63 3.7 Tách chiết thu nhận enzym nattokinaza sinh tổng hợp chủng M1 theo phương pháp lên men bề mặt 64 3.7.1 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất enzyn 64 3.7.2 Tối ưu điều kiện tách chiết 65 3.7.3 Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ phương pháp lên men bề mặt chủng M1 72 3.8 Một số đặc điểm chế phẩm nattokinaza 72 3.8.1 pH thích hợp cho enzyme hoạt động 72 3.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động 73 8.3 Kiểm tra độ tinh chế phẩm thu SDS-gel 74 KẾT LUẬN 75 KIẾN NGHỊ 75 T T T T T 32T T T T 32T T 32T T T T T T T T T 32T R R T 32T R 32T R T R R R3 T R3 T T T T T T T T T T T 32T T 32T T 32T T T T T T T T T T 32T T T T T T T T T T 32T T 32T TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC 83 T T 32T 32T Nguyễn Thị Hồng Ngân Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Bảng 1.1 Mối nguy hiểm bệnh tim mạch 11 Bảng 1.2 Giá trị dinh dưỡng 100 g đậu tương 13 Bảng 1.4.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp enzym fibrinaza 20 Bảng 1.4.4.2 Các chủng thuộc loài Bacillis phân lập từ nguồn thực phẩm 21 Bảng 1.4.5 Đặc điểm hóa sinh enzym thủy phân fibrin có nguồn gốc từ vi sinh vật [47] 23 Bảng 1.5.2 Thành phần điều điện lên men số chủng 28 Bảng 1.6 Giá số chế phẩm nattokinaza thị trường 41 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc chủng vi khuẩn 48 Bảng 3.2.2 Một số thành phần hóa học đậu tương 51 Bảng 3.6 Thu hồi enzym nattokinaza thô phương pháp kết tủa muối amon sulfat 63 Bảng 3.7.1 Ảnh hưởng dung môi đến khả thu nhân enzym nattokinaza 65 Bảng 3.7.2.1 Giá trị mã hóa thực nghiêm 66 Bảng 3.7.2.2 Thiết kết kết thí nghiệm 67 Bảng 3.7.2.3 Bảng phân tích hồi quy hoạt lực nattokinaza sau kết tủa 68 U T T U U T T U U T T U U T T U U T U T T U U T T U U T T U U T T U U T U T T U U T T U U T T U U T T U Hình 1.3 Natto lên men từ đậu tương 14 Hình 1.4.1 Cấu trúc tâm hoạt động enzym nattokinaza 16 Hình 1.4.3.2 Có chế tác dụng enzym nattokinaza lên fibrin 19 Hình 2.1 Bố trí điểm mơ hình CCD 46 Hình 2.2 Bố trí điểm loại CCD RSM 47 Hình 3.1 Khả sinh tổng hợp enzym nattokinaza chủng vi khuẩn 49 Hình 3.2.1 Khả sinh tổng hợp NK chủng vi khuẩn loại đậu khác 50 Hình 3.2 Ảnh hưởng vỏ phương pháp lên men đến khả sinh tổng hợp enzym nattokinaza hai chủng M1, D 52 Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng chủng D môi trường nhân giống 53 Hình 3.4 Ảnh hưởng lượng dịch lượng đậu lên khả sinh tổng hợp NK 54 Hình 3.4.1 Ảnh hưởng lượng dịch đến khả sinh tổng hợp enzym NK 55 Hình 3.4.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp enzym NK 56 Hình 3.4.3 Ảnh hưởng nguồn Nitơ bổ sung 57 Hình 3.4.4.1 Ảnh hưởng hàm lượng CaCl 58 Hình 3.4.4.2 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO 58 Hình 3.4.4.3 Ảnh hưởng hàm lượng K HPO 59 Hình 3.4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ giống bổ sung 59 Hình 3.4.6 Ảnh hưởng xử lý nhiệt bột đậu tương 60 Hình 3.5.1 Đường cong sinh trưởng sinh tổng hợp nattokinaza chủng D bình tam giác 61 Hình 3.7.2.1 Biến mã hóa 69 Hình 3.7.2.2 Đường đồng mức hoạt lực 70 Hình 3.7.2.3 Bề mặt đáp ứng hoạt lực 70 Hình 3.8.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt lực nattokinaza chế phẩm 73 Hình 3.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho chế phẩm nattokinaza hoạt động 73 Hình 3.8.3 Hình ảnh điện di enzyme 74 U T T U U T T U U T T U U T T U U T T U U T T U U T T U U T T U U T U T T U U T T U U T T U U T T U U T R U R3 T U T R U U T R U RU R3 T R U U T R3 T T U U T T U U T U T 32T U U T U T T U T U U T T U U T T U U T Nguyễn Thị Hồng Ngân T U Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NK Nattokinaza WHO World health organization CVDs Cardiovascular deaseas t-PA Tissue plasminogen activator SDS Sodium dodecyl sulfate Tris-HCl SDS-PAGE Tris(hydroxymethyl)aminomethane sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Ser Serin His Histidin Asp Aspartic pI Point isoelectric FU Fibrin degradation unit TCA EDTA Triclorua axetat Ethylenediaminetetraacetic acit Nguyễn Thị Hồng Ngân Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học MỞ ĐẦU Công nghệ enzym hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho nhiều ngành nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y tế, dược… Trên giới, việc nghiên cứu ứng dụng enzym sản xuất triển khai từ lâu Ở Việt Nam, việc nghiên cứu công nghệ Enzym triển khai nhiều nơi, nhìn chung, nghiên cứu dừng lại quy mơ phịng thí nghiệm, số quy mô thử nghiệm Về ứng dụng, nhiều doanh nghiệp chưa mặn mà với việc ứng dụng công nghệ enzym Nguyên nhân thay đổi công nghệ nghĩa địi hỏi đầu tư vốn - điều mà khơng phải doanh nghiệp đáp ứng Để công nghệ ứng dụng rộng rãi, đòi hỏi cần phải có liên kết trường, viện nghiên cứu doanh nghiệp nước đời sản phẩm công nghệ giá thành phù hợp với doanh nghiệp Việt Nam Nattokinaza enzym hoạt huyết mạnh có nguồn gốc từ ăn truyền thống Nhật Bản hàng nghìn năm có tên Natto (có nghĩa đậu nành lên men) Đây loại gia vị dân gian phương thuốc cổ truyền chữa bệnh tim mạch Hạt đậu nành nấu chín ủ ấm với Bacillus subtillius sau lên men tạo enzym Nattokinaza Bác sỹ Hyroyuki Sumi nghiên cứu thời gian dài Enzym hoạt huyết khám phá Nattokinaza vào năm 1980 ơng giảng dạy khoa Hóa Sinh trường Đại học Chicago Ông nghiên cứu 173 loại thực phẩm tự nhiên có hoạt tính hoạt huyết giới, Nattokinaza có tác dụng kép vừa phịng vừa làm tan huyết khối (cục máu đơng) hình thành với hiệu mạnh kéo dài, lại khơng có tác dụng phụ Hiện số nước Nhật, Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc nghiên cứu nhiều thực phẩm lên men truyền thống không natto Tofuyo, Chungcook-jang, Douchi có khả phịng chữa bệnh tim mạch chúng chứa vi khuẩn sinh enzym nattokinaza Trên giới, nattokinaza đưa vào sản xuất thương mại mang lại lợi ích kinh tế đáng kể Vào năm 1998, công ty Japan Bio Science laboratory Co Ltd công ty giới tách chiết tung thị trường sản phẩm Nguyễn Thị Hồng Ngân Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Nattokinaza NSK SD sau mở rộng phát triển sang thị trường Mỹ, châu Âu, Hàn Quốc, Đài Loan Trung Quốc NSK SD chiếm tổng lượng thị phần nattokinaza lớn giới Công ty Contex Life Science (Đài loan) sản xuất với suất 30 tấn/năm bán cho 24 quốc gia lãnh thổ Ở nước nay, nhu cầu mức độ tiêu thụ ngày tăng bệnh tim mạch có xu hướng tăng cao, theo thống kê Bộ Y tế, hàng năm có khoảng 100 nghìn người mắc phải vấn đề tim mạch Tuy nhiên nguồn nattokinaza chủ yếu nhập nước nên giá thành tương đối cao Để đáp ứng nhu cầu đặt tìm quy trình tách chiết thu hồi tối ưu enzym này, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách chiết tinh enzym nattokinaza sinh chủng Bacillus subtilis” Nguyễn Thị Hồng Ngân 10 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Độ bão hòa muối = 71,5 Tỷ lệ chiết = 71,76% pH = 7,21 Hình 3.7.2.2 Đường đồng mức hoạt lực Hình 3.7.2.3 Bề mặt đáp ứng hoạt lực Nguyễn Thị Hồng Ngân 70 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Ở vùng đỏ bề mặt đáp ứng vùng mà cho giá trị hoạt lực nattokinaza cao cả, vùng màu xanh cho hoạt lực thấp Đường đồng mức hình cho thấy, pH =7,21, giá trị hoạt lực nattokinaza cao 8546.47 FU/g nằm vùng có giá trị độ bão hòa muối 71,1-75,6, tỷ lệ chiết từ 70,2-77,67% Khi tỷ lệ chiết =71,76%, giá trị hoạt lực enzym cao 8546,45 FU/g vùng có pH=7-7,3 Các kết phân tích đường đồng mức bề mặt đáp ứng cho thấy, hoạt lực nattokinaza đạt giá trị cao điểm pH=7,21, tỷ lệ chiết 71,76% độ bão hòa muối 71,5% Kết gần tương thích với kết kiểm tra lại thực nghiệm điểm tối ưu Để tạo chế phẩm có độ tinh cao đồng thời loại muối khỏi dịch enzym, tiến hành cắt phân lớp 10Kda cột lọc 10Kda hệ thống lọc dọc ngang Benchop system Từ 250g đậu tương lên men bổ sung 635 ml nước, khuấy 30 phút thu dịch, đem ly tâm 12000 vòng/phút tủa để loại bỏ cặn sinh khối, ta thu 580 ml dịch màu màu vàng nâu, tủa muối 75% để lắng 2h ly tâm lấy cặn, hòa vào nước cất, đem lọc dọc ngang qua màng lọc 10Kda, sau sấy đơng khơ, ta thu chế phẩm enzym kỹ thuật Chế phẩm enzym kỹ thuật có màu vàng, hoạt lực 11600FU/g, hàm lượng protein 90.18% Như vậy, dựa vào trình tối ưu ta lựa chọn điều kiện thích hợp mà giá trị hoạt lực nattokinaza thu cao nhất: Công đoạn Lên men rắn Điều kiện thích hợp Hoạt lực nattokinaza 37oC, 60% độ ẩm, chiều cao lớp đậu 1,5 P P 120 FU/g chế phẩm lên men cm Tách chiết pH= 7,21; Tỷ lệ chiết = 71,76%; Độ bão 8547 FU/g hòa muối =71,5% Lọc dọc ngang Cut off 10Kda Nguyễn Thị Hồng Ngân 11600 FU/g 71 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 3.7.3 Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ phương pháp lên men bề mặt chủng M1 Dựa kết chúng tơi đưa quy trình tách chiết tinh enzyme NK từ phương pháp lên men bề mặt sau: Đậu tương lên men Hòa đệm photphat pH7,21, tỷ lệ chiết 71,76 Ly tâm 12000 vòng/phút Dịch Kết tủa enzyme với 71,5% Muối Lọc 10KDa Sấy đông khô 3.8 Một số đặc điểm chế phẩm nattokinaza 3.8.1 pH thích hợp cho enzyme hoạt động pH ảnh hưởng lớn đến mức độ ion hóa có chất enzym, từ có ý nghĩa quy trình tối ưu điều kiện để enzym có hoạt lực cao Từ ý nghĩa ta tiến hành khảo sát pH thích hợp cho enzym nattokinaza hoạt động cách thay đổi pH khác chất fibrin dung dịch đệm phản ứng, tiến hành điều kiện 37oC 1h Khoảng pH khảo sát từ 5-8 Kết thể qua biểu đồ P P Nguyễn Thị Hồng Ngân 72 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Hoạt lực enzyme Nattokinase (FU/g) Luận văn thạc sỹ khoa học 12000 10000 8000 Lên men lỏng Lên men rắn 6000 4000 2000 pH pH pH pH 7.2 pH 7.4 pH 7.6 pH pH Hình 3.8.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt lực nattokinaza chế phẩm Kết từ hình cho thấy pH mơi trường có ảnh hưởng đến hoạt độ enzym, pH môi trường 7,2 hoạt độ enzym đạt giá trị cao Điều phù hợp với nghiện cứu trước Kim H K cộng (1997) chứng pH tối ưu enzym nattokinaza hoạt động pH=7,2 3.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động Khảo sát dải nhiệt độ từ 30-70oC để tìm nhiệt độ thích hợp cho enzym P P Hoạt độ enzyme nattokinase (FU/g) hoạt động Kết thể hình dưới: 12000 10000 8000 Lên men lỏng 6000 Lên men rắn 4000 2000 30°C 37°C 45°C 60°C 70°C Nhiệt độ Hình 3.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho chế phẩm nattokinaza hoạt động Nguyễn Thị Hồng Ngân 73 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Hình cho thấy dải nhiệt độ khảo sát nhiệt độ 37oC hoạt lực P P enzym hai chế phẩm cho cao hoạt động enzym giảm dần nâng nhiệt độ Điều tương tự với báo cáo năm 1997 Kim H K [6] cho dải nhiệt độ tối ưu enzym nattokinaza 37-40oC P P 8.3 Kiểm tra độ tinh chế phẩm thu SDS-gel Các phân đoạn dùng làm mẫu để chạy SDS nhằm xác định phân tử lượng enzym kiểm tra độ tinh enzym dựa vào xuất băng Kết điện di thể qua hình sau: Hình 3.8.3 Hình ảnh điện di enzyme 2T Nguyễn Thị Hồng Ngân 74 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Lựa chọn chủng có khả sinh tổng hợp enzyme nattokinaza có hoạt lực cao chủng Bacillus subtilis M1 D Trong chủng M1 thích hợp cho lên men bề mặt, chủng D thích hợp cho lên men lỏng Tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men lỏng chủng D quy mơ bình tam giác: thể tích dịch 30ml/250ml, nồng độ bột đậu 4% (w/v), pH ban đầu 7,5, nồng độ pepton bổ sung 0,5%, K2HPO4 0,01%, CaCl2 0,01%, MgSO4 0,01% (w/v) Lựa chọn điều kiện tách chiết dịch lên men lỏng điều kiện 75% độ bão hòa muối Đưa quy trình tách chiết enzyme NK từ trình lên men lỏng Tối ưu điều kiện tách chiết enzyme NK từ trình lên men rắn chủng M1: pH đệm chiết 7,21, nồng độ muối bão hoàn 71,76%, tỷ lệ chiết 71,5% Đưa quy trình tách chiết enzyme NK từ trình lên men rắn Nghiên cứu điều kiện pH nhiệt độ thích hợp cho enzyme NK từ chủng M1 D hoạt động: pH thích hợp 7,2, nhiệt độ hoạt động thích hợp 37oC P P KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu thành phần cần bổ sung vào môi trường lên men để tạo môi trường tối ưu khả sinh tổng hợp enzyme lẫn giá thành môi trường Tiếp tục nghiên cứu tiếp điều kiện lên men lỏng chủng D quy mô lớn hơn, 1L, 10 L 50L làm sở để xây dựng quy trình ứng dụng vào sản xuất thực tế Nghiên cứu tiếp điều kiện tách chiết tinh enzyme NK sản phẩm tinh ứng dụng vào sản phẩm dược chất lượng cao Nguyễn Thị Hồng Ngân 75 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đặng Thị Thu, Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Đặng Thu Hương (2006), Nghiên cứu đặc điểm enzyme fibrinaza sinh chủng Bacillus subtilis NT5 quy trình thu hồi, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Đào Thu Hằng, Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Bacillus subtilis M1 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin nattokinaza, Đồ án tốt nghiệp, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Hà Phương (2009), Nghiên cứu đặc điểm enzyme fibrinaza sinh chủng Bacillus subtilis NT5 quy trình thu hồi, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội Lê Ngọc Tú (1990), Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Phạm Quốc Luận, (2009), Phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme fibrinaza ứng dụng vào quy trình chế biến sản phẩm thực phẩm truyền thống làm từ đậu tương, Đại Học Bách Khoa Hà Nội Ngạc Văn Dậu (1983), Chế biến đậu nành lạc thành thực phẩm giầu protein, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (1996), Công nghệ vi sinh vật–Công nghệ lên men truyền thống, tập Đại Học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Lan Hương, Phạm Thu Thủy, Vương Nguyệt Minh, Lê Phương Thanh (2009), “Tối ưu hóa điều kiện vịng hóa tạo gamma cyclo dextrin trạng thái tự phương pháp bề mặt đáp ứng”, Tạp chí khoa học Công nghệ trường đại học kỹ thuật, 70, tr 101-105 10 Nguyễn Thượng Chánh, Đậu nành, Tofu, Phytoestrogen, tạp chí Y dược ngày 11 Nguyễn Văn Tuấn, Phytoestrogen sức khỏe người, (Y dược ngày nay) Nguyễn Thị Hồng Ngân 76 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 12 Nguyễn Ý Đức, Đậu nành Giá trị dinh dưỡng, trị liệu,Y dược ngày 13 Phạm Gia Khải (2008), "Bệnh Tim mạch trở thành nguyên nhân gây tử vong hàng đầu", Hội tim mạch quốc gia Việt Nam Tài liệu Tiếng Anh 14 Batomunkueva BP, Egorov NS (2001)," Isolation, purification and resolution of the extracellular proteinase complex of Aspergillus ochraceus 513 with fibrinolytic and anticoagulant activities", Microbiology 70(5), pp.519–522 15 Bao Yan xia, Ni Meng xiang, Qian Zhi yu, Chen Jun ,Wang Ping, "The Optimization on Fermentation of Natto-Kinase in Shake-Flask", 16 Broze, G.J (1995), “Tissue factor pathway inhibitor and the revised theory of coagualtion”, Annual Review of Medicine, 46, pp 103-122 17 Chitte RR, Dey S (2000), "Potent fibrinolytic enzyme from a thermophilic Streptomyces megasporus strain SD5", Lett Appl Microbiol, 31(6), pp 405–410 18 Collen D, Lijnen HR (1994), "Staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen activator with therapeutic potential?", Blood 84(3), pp 680– 686 19 Design expert 7.1 User’s guide 20 Dong Mingsheng Jiang Xiao Liu Cheng Jiang Hanhu, "Screening of Extracellar Fibrinolytic Strain NK-5 and Its Enzyme Production Conditions" 21 El-Aassar SA, El-Badry HM, Abdel-Fattah AF (1990), "The biosynthesis of proteases with fibrinolytic activity in immobilized cultures of Penicillium chrysogenum H9", Appl Microbiol Biotechnol 33(1), pp 26– 30 Nguyễn Thị Hồng Ngân 77 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 22 Fujita M, Nomura K, Hong K, Ito Y, Asada A, Nishimuro S (1993) "Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan", 23 Fujita M., Hong K., Ito Y., Fujii R., Kariya K., Nishimuro S (1995), “Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat", Bio Pharm Bull, 10, pp 1387-1391 24 Gao Zhuhu, Zheng Guangnan, "Nattokinase powders with super hight activity and producing method thereof." 25 Hahn, B.S.; Cho S.J.; Wu, I.M.; Chang, K.H.; Baek, Y.C; Halkier, T (1991), "Mechanisms in blood coagulation, Fibrinolysis and the complement system", Cambridge University Press, 13, pp 978-980 26 Hayashi T., Takahashi C., and Y Kikuchi (2002), “Effect of the dried filtrate of natto bacilli culture "NKCP" on blood fluidity”, Journal of the Japanese Society of Hemorheology, 5, pp 43-45 27 Hong Le Tho, "Natto - traditional fermented soybean", Tạp chí kỹ thuật 28 http://www.jbsl-net.com/english/products/index.html 29 Http://www.who.int 30 Itaya, M., Matsui, K (1999), "Conversion of Bacillus subtilis 169: natto producing Bacillus subtilis with mosaic genomes", Biosci Biotechnol Biochem., 63, pp 2034-2037 31 Kada, S., Nanamiya, H., Kawamura, F., Horimouchi, H (2004), "A glutamate racemase, supplies d-glutamate to both peptidoglycan synthesis and poly-y-glutamate production in y-PGA-producing Bacillus subtilis.", FEMS Microbiol Lett., 236, pp 13-20 32 Kang et al (2009) "Levan: Applications and Perspectives" Microbial Production of Biopolymers and Polymer Precursors Caister Academic Press ISBN 978-1-904455-36-3 33 Kim SH, Choi NS (2000), "Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp strain DJ-4 screened from Doen-Jang", Nguyễn Thị Hồng Ngân 78 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Biosci Biotechnol Bioche, 64, pp.1722–1725 34 Kim, H.; G Kim D Kim, W Choi, S.; park, Y Jeong, I Kong (1997), “Purification and Characterization of a Novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp KA38 originated from fermented fish”, Journal of fermentation and bioengineering, 4, pp 307-312 35 Kim, W.; Choi, K.; Kim, Y.; Park, H.; Choi, J.; Lee, Y.; Oh, H.; Kwon, I Lee, S (1996), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp Strain CK 11-4 screemed from ChungkookJang”, Applied and Environmental, Microbiology, 62, pp 2482-2488 36 Lee J, Park S, Choi WA, Lee KH, Jeong YK, Kong IS, Park S (1999), "Production of a fibrinolytic enzyme in bioreactor culture by Bacillus subtilis BK-17 J", Microbiol Biotechnol, pp 443–449 37 Liang Shu-wa1, Huang Xiao-man, Xia Feng-geng, Peng Zhong-jian , Tan Ying-chang, “Study on Liquid Fermentation of Nattokinase” 38 Liu, L., Xing, T Chang, Z Ma, and H Liu (2005), “Otimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental method", Process Biochemistry, 40, pp 2757-2762 39 Ming Fei-ping, Zhao Pei-jing, Liao Chun-fang, LIANG Shu-wa, Xia Feng-geng, "Optimization of Liquid Fermentation of Bacillus natto" 40 Mu Guang-qing, Sun Yuan, Huo Gui-cheng, "Optimization on production conditions of fibrinolysin by Bacillus subtilis SY-3" 41 Nattokinase liquid fermentation, http://www.cnki.net 42 Niu Shu-min1, Yuan Hong-shui, Li Shu-na, Wang Shi-ying, Zang Ailian, Zhu Bao-cheng, "Optimization of fermentation process on the fibrinolytic enzyme producing strain BS-26" 43 P Yong, H Qing, Z Ren-huai, Z Yi-zheng (2003), "Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus Nguyễn Thị Hồng Ngân 79 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food", Comp Biochem Physiol 134, pp 45–52 44 P.N Bryan (2000), "Protein engineering of subtilisin", Biochim Biophys Acta 1543, pp 203–222 45 Peng Y, Zhang YZ (2002a), "Isolation and characterization of fibrinolytic enzyme-producing strain DC-4 from Chinese douchi and primary analysis of the enzyme property", Chin High Technol Lett 12, pp 30–34 46 Peng Yong, Zhang Yizheng, , "Optimization of Fermentation Conditions of Douchi Fibrinolytic Enzyme Production by Bacillus amyloliquefaciens DC 4", Lab of Molecular Biology, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu, 610064 47 Peng, Y.; X Yang (2005), "Miocrobial fibrinolytic enzyme: an overview of source, production, properties, and thrombolytic in vivo", Microbiol Biotechnol, 69, pp 126-132 48 Pnesmus K Ashipala, Qian He, (2008), “Optimization of fibrinolytic enzyme production by Bacillus subtilis DC-2 I aqueous two phase system (poly-ethylene glycol 4000 and sodiu, sulfate”, Bioresourse Technology, 99, pp 4112-4119 49 San Lang Wang, Pe Yi Yeh (2008), "Purification and characterization of a chitosannase from a nattokinase producting strain Bacillus subtilis TK007", Process Biochemistry, 43, pp 132-138 50 Seong Bo Kim, Dong Woo Lee, chang Ick Cheigh (2006), "Purification and characterization of a fibrinolytic subtilisin like protease of Bacillus subtilis TP-6 from an Indonessian fermented soybean, Tempeh", Microbioal biotechnol, 30, pp 436-444 51 Shi Xu-dong, Sun Dan, Han Ji-fu, "The optimum of culture medium producing Nattokinaza by liquid fermentation of Bacillus natto I" 52 Shigeki Kada, Masahiro Yabusaki, Takayuki Kaga, Hitoshi Ashida, Kenichi Yoshida (2008), "Identification of two major ammonia releasing reaction involved in secondary natto fermentation", Biosci Biotechnol Nguyễn Thị Hồng Ngân 80 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Biochem., 72, pp 1869-1876 53 Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, Muraki H (1987), "A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet", Experientia 43(10), pp 1110–1111 54 Sumi, H., M Maruyama, T Yoneta, H Mihara (1983), "Activation of plasma fibrinolysis after intrarectal administration of high molecular weight urokinase and its derivative." Acta Haematol, (70), pp 289-295 55 Sun T, Liu BH, Li P, Liu DM, Li ZH (1998), "New solid-state fermentation process for repeated batch production of fibrinolytic enzyme by Fusarium oxysporum", Process Biochem 33 (4), pp 419–422 56 Tanaka, T., Muramatsu, K , Kim, H., Watanabe, T., Takeyasu, M Kanai, Y., Kiuchi, K (1998), "Comparison of volatile compounds from chungkuk-jang and itohiki natto, Biosci Biotechnol Biochem., 67, pp 1440-1444 57 Williams Shurtleff and Akiko Aoyagi—Soyinfo LaFayette, California, History of Soybeans and Soyfoods: 1100 B.C to the 1980 58 Xiao-Lan L, Lian-Xiang D, Fu-Ping L, Xi-Qun Z, Jing X (2005), "Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis", Appl Microbiol Biotechnol 67 (2), pp.209–214 59 Xiaoxang, X Wang, S Xiong, J Zhang, L Cai, Y Yang (2007), “Expression and purification of recombinant nattokinaza in Spodoptera frugiperda cells”, pp.1459-1464 60 Xie Qiuling Guo Yong , "The optimization of fermentation conditionl of nattokinase", College of Food & Biotech., South China Univ of Tech.,Guangzhou 510640 61 Xue Jian, Zang Xue-li, Chen Guang, Wang Gang, Gao Jun-peng, "Optimization of Liquid Fermentation Conditions of Nattokinase", College of Biotechnology, Jilin Agricultural University, Changchun Nguyễn Thị Hồng Ngân 81 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 130118,China 62 Yong Peng, Qing Huang, Ren-Huai Zhang (2003), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amiloliquefaciens DC-4 screened from douche, a traditional Chinese soybean food”, Comparative Biochemistry and Physiology part, 134, pp 45-52 63 Yong Peng, X Yang (2005), "Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties and thrombolytic in vivo", Microbiol Biotechnol, 69, pp 126-132 64 Yoo, C K., W S Seo, C.S Lee, and S M Kang (1998), “Purification and characterization of fibrinolytic enzyme excreted by Bacillus subtilis K-54 isolated from chung Guk Jang”, Appl Microbial Biotechnol, 26, pp 507-514 65 Yoshinori Mine, Ada Ho Kwan Wong, Bo Jiang (2005), “Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods”, Food research International, 38, pp.243-250 66 Zhang Ai-lian,Yuan Hong-shui, Li Shu-na, Zhou Zhi-jun, Niu Shu-min, Zhu Bao-cheng, “The optimization of liquid fermentation conditions of fibrinolytic enzyme producing strain S-05” 67 Zhong liang Zheng, Zhen uo Zuo, Zhi gang Liu, Keng-chang Tsai, Ai-fu Liu, Guo-lin Zou (2004), "Construction of a 3D model of nattokinase, a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus natto A novel nucleophilic catalytic mechanism for nattokinase", Journal of molecular graphics and modelling, 23, pp 373-380 68 Zhou Fu-zhong, Jia Yun-li, Chen Guo-can, Xie Bao-en, Wang Hong-yun, “Study on Strains Selection and Liquid Fermentation Conditions of Fibrinolytic Enzyme” 69 Zhu Jian-hui, Du Lian-xiang, Lu Fu-ping, Liu Xiao-lan, Wang Ping, “Optimization of fermentation conditions for high-production NK” Nguyễn Thị Hồng Ngân 82 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học PHỤ LỤC Đường chuẩn bradford Nồng độ BSA (mg/ml) OD 0.1 0.015 0.28 0.117 0.4 0.165 0.543 0.266 0.8 0.403 0.512 0.6 y = 0.5555x - 0.0428 R2 = 0.9984 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Hình: Đồ thị đường chuẩn BSA theo phương pháp Bradford Hình ảnh khuẩn lạc chủng D Nguyễn Thị Hồng Ngân 83 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Đường chuẩn Tyrozin Nồng độ tyrozin (µg/ml) OD 0 0.0185 0.037 0.059 0.086 0.095 10 0.1 0.12 0.1 0.08 OD OD 0.06 Linear (OD) 0.04 0.02 -0.02 Nguyễn Thị Hồng Ngân Nồng độ tyrozine (mg/l) 84 10 12 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ HỒNG NGÂN TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYM NATTOKINAZA SINH RA BỞI CHỦNG BACILLUS SUBTILIS Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH. .. tương 60 3.5 Lên men chìm sinh tổng hợp nattokinaza quy mơ phịng thí nghiệm 60 3.5.1 Động thái sinh sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp nattokinaza chủng Bacillus subtilis natto D quy mô bình... khuẩn sinh enzym nattokinaza Trên giới, nattokinaza đưa vào sản xuất thương mại mang lại lợi ích kinh tế đáng kể Vào năm 1998, công ty Japan Bio Science laboratory Co Ltd công ty giới tách chiết