Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym luciferase từ vi khuẩn tái tổ hợp E. Coli MC 1061 (pT 0031)

Luciferase xúc tác phản ứng giữa luciferin, oxy và nước để tạo ra dung dịch phát quang. Enzym được biết đến với những ứng dụng rất rộng rãi trong hóa sinh và sinh học phân tử. Như phương pháp phát quang sinh học sử dụng hệ thống enzym – cơ chất. Luciferase chiết suất từ tự nhiên chưa đáp ứng được nhu cầu vì vậy việc tạo Luciferase từ vi khuẩn là hướng đi đầy triển vọng. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym luciferase từ vi khuẩn tái tổ hợp E. Coli MC 1061 (pT 0031)”

1 PHN M U 1.1 t Luciferase xỳc tỏc phn ng gia luciferin, oxy v nc to dung dch phỏt quang Enzym c bit n vi nhng ng dng rt rng rói húa sinh v sinh hc phõn t Nh phng phỏp phỏt quang sinh hc s dng h thng enzym c cht Luciferase chit sut t t nhiờn cha ỏp ng c nhu cu vỡ vy vic to Luciferase t vi khun l hng i y trin vng Do ú chỳng tụi thc hin ti: Nghiờn cu tỏch chit v tinh sch enzym luciferase t vi khun tỏi t hp E Coli MC 1061 (pT 0031) 1.2 Mc ớch nghiờn cu Nghiờn cu c quy trỡnh tỏch chit v tinh sch luciferase t vi khun tỏi t hp E Coli MC 1061 v xỏc nh c tớnh lm nn tng cho ng dng 1.3 Mc tiờu nghiờn cu - Tỏch tinh sch thu ch phm luciferase - Xỏc nh mt s c tớnh ca luciferase 1.4 í ngha ca ti Tỏch chit v tinh sch c enzym luciferase cú ý ngha vic ch to test phỏt hin nhanh da trờn phng phỏp phỏt quang sinh hc s dng h thng enzym c cht 2 PHN TNG QUAN TI LIU 2.1 C s khoa hc 2.1.1 Tng quan v luciferase 2.1.1.1 c im, phõn loi luciferase 2.1.1.2 Cu to, tớnh cht v ng dng ca luciferase 2.1.1.3 Luciferase t om úm (Photinus pyralis) 2.1.1.4 Luciferase t chng vi khun tỏi t hp E.coli MC 1061 (pT 0031) 2.1.1.5 Cỏc phng phỏp tỏch v tinh sch luciferase a Tỏch luciferase bng phng phỏp kt ta phõn on kt hp vi ly tõm, thm tớch b Tinh sch luciferase bng cỏc phng phỏp sc ký 2.1.2 Phn ng quang sinh hc v cỏc ng dng 2.1.2.1 Nhng kiu phỏt quang chớnh a Phỏt sỏng theo tng nhp (nhp iu) b Phỏt sỏng liờn tc sut i sng ca sinh vt c Phỏt quang cm ng 2.1.2.2 C ch ca quỏ trỡnh phỏt sỏng 2.1.2.3 Vai trũ ca phỏt quang sinh hc t nhiờn 2.1.2.4 ng dng ca phỏt quang sinh hc 2.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cu nc v th gii 2.2.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cu trờn th gii 2.2.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cu nc PHN I TNG, NI DUNG V PHNG PHP NGHIấN CU 3.1 Nguyờn liu, húa cht v thit b nghiờn cu 3.1.1 i tng v phm vi nghiờn cu Chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) mang plasmid pT 0031 cú gen mó hoỏ cho kh nng sn xut luciferase 3.1.2 Mụi trng s dng - Mụi trng LB cha khỏng sinh - Mụi trng Mac Conkey 3.1.3 Dung dch v m s dng Bng 3.1.Danh sỏch cỏc dung dch v m s dng thớ nghim Dung dch Folin gc 1N Dung dch A Dung dch B1 Dung dch B2 Dung dch C 10 11 12 13 14 15 m in di protein (bin tớnh) m ca gel tỏch m ca gel cụ 17 Dung dch nhum protein: (250 ml) 18 16 Dung dch Dung dch I Dung dch II Dung dch III Dung dch (1): m Tricin NaOH 50 mM, pH 7,8 Dung dch (2): Dung dch ATP 40 Mm Dung dch (3): Dung dch Dluciferin mM Dung dch (4): MgSO4 0,1 M Dung dch (5): Dung dch m cho luciferase 3.1.4 Thit b nghiờn cu Box cy an ton cp Model: LCB 1801V (Daihan - Hn Quc), Mỏy o cng sỏng cm tay Lumitester PD-20 (Kikoman - Nht Bn), Mỏy o quang ABOATOX (Phn Lan), T m nuụi cy vi sinh IC 402 (YAMOTO - Nht Bn), Mỏy nuụi lc n nhit KS 4000 (KIA - c), H thng mỏy in di protein v phõn tớch nh (Biorad - M), Cõn phõn tớch BL 150S (Thy S), Ni hp kh trựng HV-110 (HIRAYAMA - Nht Bn), Ct sc ký His-trap columns (Armesham), Ct sc ký XK 9/16 (Armesham) 3.2 a im v thi gian tin hnh 3.2.1 a im: Vin Húa Hc - Mụi Trng Quõn S 3.2.2 Thi gian: T ngy 18/03/2013 - / /2013 3.3 Ni dung nghiờn cu 3.3.1 Tng sinh chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) 3.3.1.1 Hot hoỏ chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) 3.3.1.2 ỏnh giỏ tớnh n nh v xỏc nh kh nng phỏt trin ca chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) trờn cỏc mụi trng khỏc 3.3.1.3 Kh nng tng hp luciferase trờn cỏc mụi trng khỏc 3.3.2 Tỏch v tinh sch luciferase t E.coli MC 1061 (pT 0031) 3.3.2.1 Tỏch luciferase t sinh chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) 3.3.2.2 Tinh sch luciferase bng sc ký lc gel kt hp sc ký trao i ion 3.3.2.3 Tinh sch luciferase bng sc ký trao i ion kt hp sc ký ỏi lc 3.3.3 nh hng mt s yu t n hot luciferase 3.3.3.1 nh hng ca nng c cht 3.3.3.2 Nhit ti u cho phn ng 3.3.3.3 pH phn ng ti u 3.3.3.4. bn nhit 3.3.3.5 nh hng ca mt s cht hot ng b mt 3.3.3.6 nh hng ca dung mụi hu c 3.3.3.7 nh hng ca mt s ion kim loi n hot tớnh luciferase 3.4 Phng phỏp nghiờn cu 3.4.1 Nuụi cy vi sinh vt Chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) phũng thớ nghim Sinh hc, Vin Húa hc Vt liu cung cp di dng ụng khụ Hot húa E coli MC 1061 (pT 0031) bng cỏch a 01 l vi khun vo ml dung dch axit casamino 0,5% nhit 300C 18 gi Tin hnh nuụi cy trờn mụi trng LB lng cú b sung Kanamycine 50 mg/l 24 gi Sau ú cy chuyn sang mụi trng LB c, 370C 48 gi 3.4.2 Kt ta phõn on thu luciferase bng mui (NH4)2SO4 Sau nuụi cy chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031), tin hnh tỏch luciferase bng phng phỏp kt ta bng mui (NH 4)2SO4 vi nng thớch hp 3.4.3 Tinh sch luciferase Phõn on cú hot enzym cao nht c tip tc tinh sch bng phng phỏp sc ký phự hp 3.4.3.1 Sc ký lc gel kp hp trao i ion 3.4.3.2 Sc ký trao i ion kt hp ỏi lc 3.4.4 Cỏc phng phỏp kim tra luciferase 3.4.4.1 Xỏc nh hot tớnh luciferase Hot tớnh ca luciferase (RLU) c xỏc nh theo cụng thc: Hot theo th tớch (RLU/ml) = (Es E0)xdf 0,1ml Hot riờng (RLU/mg) = RLU/mlx1/C Trong ú: + df: t l pha loóng ca mu + C: nng protein mu 3.4.4.2 ỏnh giỏ sch ca luciferase sch ca enzym qua cỏc cụng on tinh sch c ỏnh giỏ bng k thut in di SDS-PAGE 3.4.4.3 Xỏc nh hm lng protein theo phng phỏp Lowry Protein tng s thu c qua cỏc bc ca quỏ trỡnh tỏch v tinh sch enzym c xỏc nh theo phng phỏp Lowry s dng tinh th Albumin huyt bũ (BSA) xõy dng ng chun 3.4.5 X lý s liu thc nghim Cỏc s liu thu c c x lý bng cỏc hm toỏn hc v phn mm chuyờn dng 7 PHN KT QU V THO LUN 4.1 Sinh trng ca vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) 4.1.1 Nuụi cy Chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) c hot húa v nuụi cy tng sinh trờn mụi trng LB lng, tip tc cy chuyn sang mụi trng LB c Tin hnh xỏc nh mt s c im sinh húa v hỡnh thỏi chng vi khun va phõn lp c Kh nng phỏt trin trờn mụi trng cú b sung mt s loi khỏng sinh cng l mt du chun chng t chng vi khun phõn lp c chớnh l E coli MC 1061 (pT 0031) S dng phng phỏp cy vch trờn mụi trng LB b sung Kanamycine, Chloramphenicol, Ampicillin v hn hp c loi khỏng sinh trờn i chng l vi khun E coli thng, Bacillus subtilis Mt c im na nhn bit chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) l kh nng sinh luciferase cú As5+, vi cỏc nng As5+ khỏc c a vo mụi trng nuụi cy tin hnh thu nhn dch sinh ca E.coli MC 1061 (pT 0031), a vo phn ng xỏc nh hot luciferase, tin hnh lm thớ nghim song song vi mt s chng vi sinh khỏc 4.1.2 ỏnh giỏ tớnh n nh v xỏc nh kh nng phỏt trin ca chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) trờn cỏc mụi trng khỏc Tin hnh thớ nghim cy chuyn liờn tip ging sau 48 gi nuụi cy trờn mụi trng thch a trờn hai mụi trng LB v MacConkey cú v khụng cú Kanamycine 50mg/l 8 4.2 Kh nng tng hp luciferase trờn cỏc mụi trng khỏc Tin hnh nuụi lc E.coli MC 1061 (pT 0031) iu kin 180 vũng/phỳt 370C hai mụi trng LB v MacConkey, ly dch sinh cú OD600 t 0,5 n 2,5, tin hnh phõn tớch hot tớnh luciferase 4.3 Nghiờn cu tỏch chit, tinh sch luciferase ti E.coli MC 1061 (pT 0031) 4.3.1 Tỏch chit luciferase t sinh chng vi khun E coli MC 1061 (pT 0031) Thu nhn luciferase t dch sinh chng E coli MC 1061 (pT 0031) bng phng phỏp kt ta phõn on bng mui (NH 4)2SO4 kt hp vi phng phỏp thm tớch thu nhn luciferase t dch sinh tỏch luciferase 4.2.2 Tinh sch luciferase bng sc ký lc gel kt hp sc ký trao i ion Sau thu c dch enzym qua cỏc bc ó trỡnh by trờn, tin hnh chy sc ký lc gel v sc ký trao i ion tinh sch luciferase 4.2.3 Tinh sch luciferase bng sc ký trao i ion kt hp sc ký ỏi lc Sn phm ca quỏ trỡnh thm tớch s dng chy sc ký trao i ion v sc ký ỏi lc vi gel Chelating Sepharose 4.3 Nghiên cứu ảnh hởng số yếu tố đến hoạt độ độ bền luciferase tái tổ hợp 4.3.1 nh hng ca nng c cht 4.3.2 Nhit ti u cho phn ng 4.3.3 pH phn ng ti u 4.3.4 bn nhit 4.3.5 nh hng ca mt s cht hot ng b mt 4.3.6 nh hng ca dung mụi hu c 4.3.7 nh hng ca mt s ion kim loi n hot tớnh luciferase PHN KT LUN V NGH 5.1 Kt lun 5.2 ngh 10 TI LIU THAM KHO Thỏi Nguyờn, ngy thỏng nm 2013 Giỏo viờn hng dn Sinh viờn thc hin