Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym luciferase từ vi khuẩn tái tổ hợp E. Coli MC 1061 (pT 0031)

Luciferase xúc tác phản ứng giữa luciferin, oxy và nước để tạo ra dung dịch phát quang. Enzym được biết đến với những ứng dụng rất rộng rãi trong hóa sinh và sinh học phân tử. Như phương pháp phát quang sinh học sử dụng hệ thống enzym – cơ chất. Luciferase chiết suất từ tự nhiên chưa đáp ứng được nhu cầu vì vậy việc tạo Luciferase từ vi khuẩn là hướng đi đầy triển vọng. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym luciferase từ vi khuẩn tái tổ hợp E. Coli MC 1061 (pT 0031)”

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Luciferase xúc tác phản ứng giữa luciferin, oxy và nước để tạo ra dung

dịch phát quang Enzym được biết đến với những ứng dụng rất rộng rãi trong hóa sinh và sinh học phân tử Như phương pháp phát quang sinh học sử dụng hệ thống enzym – cơ chất

Luciferase chiết suất từ tự nhiên chưa đáp ứng được nhu cầu vì vậy việc tạo Luciferase từ vi khuẩn là hướng đi đầy triển vọng Do đó chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym luciferase từ vi khuẩn

tái tổ hợp E Coli MC 1061 (pT 0031)”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu được quy trình tách chiết và tinh sạch luciferase từ vi

khuẩn tái tổ hợp E Coli MC 1061 và xác định đặc tính làm nền tảng

cho ứng dụng

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

- Tách tinh sạch thu chế phẩm luciferase

- Xác định một số đặc tính của luciferase

1.4 Ý nghĩa của đề tài

Tách chiết và tinh sạch được enzym luciferase có ý nghĩa trong việc

chế tạo test phát hiện nhanh dựa trên phương pháp phát quang sinh học sử dụng hệ thống enzym – cơ chất

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học

2.1.1 Tổng quan về luciferase

2.1.1.1 Đặc điểm, phân loại luciferase

2.1.1.2 Cấu tạo, tính chất và ứng dụng của luciferase

2.1.1.3 Luciferase từ đom đóm (Photinus pyralis)

2.1.1.4 Luciferase từ chủng vi khuẩn tái tổ hợp E.coli MC 1061 (pT

0031)

2.1.1.5 Các phương pháp tách và tinh sạch luciferase

a Tách luciferase bằng phương pháp kết tủa phân đoạn kết hợp với ly tâm, thẩm tích

b Tinh sạch luciferase bằng các phương pháp sắc ký

2.1.2 Phản ứng quang sinh học và các ứng dụng

2.1.2.1 Những kiểu phát quang chính

a Phát sáng theo từng nhịp (nhịp điệu)

b Phát sáng liên tục trong suốt đời sống của sinh vật

c Phát quang do cảm ứng

2.1.2.2 Cơ chế của quá trình phát sáng

2.1.2.3 Vai trò của phát quang sinh học trong tự nhiên

2.1.2.4 Ứng dụng của phát quang sinh học

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Chủng vi khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031) mang plasmid pT

0031 có gen mã hoá cho khả năng sản xuất luciferase

3.1.2 Môi trường sử dụng

- Môi trường LB chứa kháng sinh

- Môi trường Mac Conkey

3.1.3 Dung dịch và đệm sử dụng

Bảng 3.1.Danh sách các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm

1 Dung dịch Folin gốc 1N 10 Dung dịch rửa

5 Dung dịch C 14 Dung dịch (1): Đệm Tricin –

NaOH 50 mM, pH 7,8

6 Đệm điện di protein

(biến tính)

15 Dung dịch (2): Dung dịch ATP 40 Mm

7 Đệm của gel tách 16 Dung dịch (3): Dung dịch

D-luciferin 4 mM

8 Đệm của gel cô 17 Dung dịch (4): MgSO4

0,1 M

9 Dung dịch nhuộm

protein: (250 ml)

18 Dung dịch (5): Dung dịch đệm cho luciferase

3.1.4 Thiết bị nghiên cứu

Box cấy an toàn cấp 2 Model: LCB 1801V (Daihan - Hàn Quốc),

Máy đo cường độ sáng cầm tay Lumitester PD-20 (Kikoman - Nhật Bản), Máy đo quang ABOATOX (Phần Lan), Tủ ấm nuôi cấy vi sinh IC 402 (YAMOTO - Nhật Bản), Máy nuôi lắc ổn nhiệt KS 4000 (KIA - Đức), Hệ

thống máy điện di protein và phân tích ảnh (Biorad - Mỹ), Cân phân tích

BL 150S (Thụy Sỹ), Nồi hấp khử trùng HV-110 (HIRAYAMA - Nhật Bản), Cột sắc ký His-trap columns (Armesham), Cột sắc ký XK 9/16 (Armesham)…

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

3.2.1 Địa điểm: Viện Hóa Học - Môi Trường Quân Sự

3.2.2 Thời gian: Từ ngày 18/03/2013 - / /2013

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Tăng sinh chủng vi khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031)

3.3.1.1 Hoạt hoá chủng vi khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031)

3.3.1.2 Đánh giá tính ổn định và xác định khả năng phát triển của chủng

vi khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031) trên các môi trường khác nhau.

3.3.1.3 Khả năng tổng hợp luciferase trên các môi trường khác nhau

3.3.2 Tách và tinh sạch luciferase từ E.coli MC 1061 (pT 0031)

3.3.2.1 Tách luciferase từ sinh khối chủng vi khuẩn E coli MC 1061

(pT 0031)

3.3.2.2 Tinh sạch luciferase bằng sắc ký lọc gel kết hợp sắc ký trao đổi ion

3.3.2.3 Tinh sạch luciferase bằng sắc ký trao đổi ion kết hợp sắc ký ái lực 3.3.3 Ảnh hưởng một số yếu tố đến hoạt độ luciferase

3.3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

3.3.3.2 Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng

3.3.3.3 pH phản ứng tối ưu

3.3.3.4.Độ bền nhiệt độ

3.3.3.5 Ảnh hưởng của một số chất hoạt động bề mặt

3.3.3.6 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ

3.3.3.7 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính luciferase

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Nuôi cấy vi sinh vật

Chủng vi khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031) do phòng thí nghiệm

Sinh học, Viện Hóa học – Vật liệu cung cấp dưới dạng đông khô Hoạt

hóa E coli MC 1061 (pT 0031) bằng cách đưa 01 lọ vi khuẩn vào 4 ml

dung dịch axit casamino 0,5% ở nhiệt độ 300C trong 18 giờ Tiến hành nuôi cấy trên môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycine 50 mg/l trong

24 giờ Sau đó cấy chuyển sang môi trường LB đặc, ủ 370C trong 48 giờ

3.4.2 Kết tủa phân đoạn thu luciferase bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4

Sau khi nuôi cấy chủng vi khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031), tiến

hành tách luciferase bằng phương pháp kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 với nồng độ thích hợp

3.4.3 Tinh sạch luciferase

Phân đoạn có hoạt độ enzym cao nhất được tiếp tục tinh sạch bằng phương pháp sắc ký phù hợp

3.4.3.1 Sắc ký lọc gel kếp hợp trao đổi ion

3.4.3.2 Sắc ký trao đổi ion kết hợp ái lực

3.4.4 Các phương pháp kiểm tra luciferase

3.4.4.1 Xác định hoạt tính luciferase

Hoạt tính của luciferase (RLU) được xác định theo công thức:

Trong đó:

+ df: tỷ lệ pha loãng của mẫu

+ C: nồng độ protein trong mẫu

3.4.4.2 Đánh giá độ sạch của luciferase

Độ sạch của enzym qua các công đoạn tinh sạch được đánh giá bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE

3.4.4.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry

Hoạt độ theo thể tích (RLU/ml) = (E0,1mls – E0)xdf

Hoạt độ riêng (RLU/mg) = RLU/mlx1/C

Protein tổng số thu được qua các bước của quá trình tách và tinh sạch enzym được xác định theo phương pháp Lowry sử dụng tinh thể Albumin huyết thanh bò (BSA) để xây dựng đường chuẩn

3.4.5 Xử lý số liệu thực nghiệm

Các số liệu thu được được xử lý bằng các hàm toán học và phần mềm

chuyên dụng

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Sinh trưởng của vi khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031)

4.1.1 Nuôi cấy

Chủng vi khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031) được hoạt hóa và nuôi

cấy tăng sinh trên môi trường LB lỏng, tiếp tục cấy chuyển sang môi trường LB đặc

Tiến hành xác định một số đặc điểm sinh hóa và hình thái chủng vi khuẩn vừa phân lập được

Khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung một số loại kháng sinh cũng là một dấu chuẩn chứng tỏ chủng vi khuẩn phân lập được chính

là E coli MC 1061 (pT 0031) Sử dụng phương pháp cấy vạch trên môi

trường LB bổ sung Kanamycine, Chloramphenicol, Ampicillin và hỗn

hợp cả 3 loại kháng sinh trên Đối chứng là vi khuẩn E coli thường, Bacillus subtilis.

Một đặc điểm nữa để nhận biết chủng vi khuẩn E coli MC 1061 (pT

0031) là khả năng sinh luciferase khi có As5+, với các nồng độ As5+ khác nhau được đưa vào môi trường nuôi cấy tiến hành thu nhận dịch sinh khối của E.coli MC 1061 (pT 0031), đưa vào phản ứng xác định hoạt độ luciferase, tiến hành làm thí nghiệm song song với một số chủng vi sinh khác

4.1.2 Đánh giá tính ổn định và xác định khả năng phát triển của chủng vi

khuẩn E coli MC 1061 (pT 0031) trên các môi trường khác nhau

Tiến hành thí nghiệm cấy chuyển liên tiếp giống sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa trên hai môi trường LB và MacConkey có

và không có Kanamycine 50mg/l

4.2 Khả năng tổng hợp luciferase trờn cỏc mụi trường khỏc nhau

Tiến hành nuụi lắc E.coli MC 1061 (pT 0031) trong điều kiện 180 vũng/phỳt ở 370C trong hai mụi trường LB và MacConkey, lấy dịch sinh khối cú OD600 từ 0,5 đến 2,5, tiến hành phõn tớch hoạt tớnh luciferase

4.3 Nghiờn cứu tỏch chiết, tinh sạch luciferase tới E.coli MC 1061

(pT 0031)

4.3.1 Tỏch chiết luciferase từ sinh khối chủng vi khuẩn E coli MC 1061

(pT 0031)

Thu nhận luciferase từ dịch sinh khối chủng E coli MC 1061 (pT

0031) bằng phương phỏp kết tủa phõn đoạn bằng muối (NH4)2SO4 kết hợp với phương phỏp thẩm tớch để thu nhận luciferase từ dịch sinh khối

để tỏch luciferase

4.2.2 Tinh sạch luciferase bằng sắc ký lọc gel kết hợp sắc ký trao đổi ion

Sau khi thu được dịch enzym qua cỏc bước đó trỡnh bày ở trờn, tiến hành chạy sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion để tinh sạch luciferase

4.2.3 Tinh sạch luciferase bằng sắc ký trao đổi ion kết hợp sắc ký ỏi lực

Sản phẩm của quỏ trỡnh thẩm tớch sử dụng để chạy sắc ký trao đổi ion và sắc ký ỏi lực với gel Chelating Sepharose

4.3 Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố đến hoạt độ và độ bền của luciferase tái tổ hợp

4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

4.3.2 Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng

4.3.3 pH phản ứng tối ưu

4.3.4 Độ bền nhiệt độ

4.3.5 Ảnh hưởng của một số chất hoạt động bề mặt

4.3.6 Ảnh hưởng của dung mụi hữu cơ

4.3.7 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tớnh luciferase

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận

5.2 Đề nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện