Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme Cholinesterase từ huyết thanh ngựa

Cholinesterase đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ 20 từ những nghiên cứu tác động của este choline lên các mô khác nhau. Cholinesterase tập trung nhiều ở các mô thần kinh, trong máu của động vật có xương sống, chức năng chính của Cholinesterase là thủy phân liên kết của các hợp chất choline như axetylcholine tiết ra trong quá trình truyền xung thần kinh, thiếu giai đoạn này thì chức năng của hệ thần kinh sẽ bị tê liệt. Do đó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm chức năng, kit phát hiện nhanh dư lượng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp, môi trường v.v… Hiện nay chiết suất cholinesterase từ tự nhiên vẫn là chủ yếu. Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài : “ Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme Cholinesterase từ huyết thanh ngựa”.

1 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cholinesterase nghiên cứu từ năm đầu kỷ 20 từ nghiên cứu tác động este choline lên mô khác Cholinesterase tập trung nhiều mô thần kinh, máu động vật có xương sống, chức Cholinesterase thủy phân liên kết hợp chất choline axetylcholine tiết trình truyền xung thần kinh, thiếu giai đoạn chức hệ thần kinh bị tê liệt Do ứng dụng nhiều lĩnh vực: công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm chức năng, kit phát nhanh dư lượng thuốc trừ sâu nông nghiệp, môi trường v.v… Hiện chiết suất cholinesterase từ tự nhiên chủ yếu Vì lý thực đề tài : “ Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme Cholinesterase từ huyết ngựa” 1.2 Mục tiêu: Thu nhận tinh enzyme Cholinesterase từ huyết ngựa 1.3 Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu quy trình tách chiết làm enzyme ChE từ nguồn nguyên liệu nước, xác lập quy luật ảnh hưởng số yếu tố như: nồng độ chất, pH, nhiệt độ, chất hoạt hóa chất ức chế đến phản ứng xúc tác enzyme ChE 1.4 Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học: làm thuốc thử sinh hóa để chế tạo kít phát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thực phẩm số hợp chất phosphor hữu phân tích môi trường 2 Ý nghĩa thực tiễn: Giúp kiểm tra nhanh dư lược thuốc bảo vệ thực vật thực phẩm tiêu dùng phân tích môi trường PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học cholinesterase 1.1.1 Tổng quan enzyme cholinesterase 1.1.1.1 Định nghĩa 1.1.1.2 Cấu trúc cholinesterase  Cấu trúc protein • Cấu trúc bậc • Cấu trúc bậc • Cấu trúc bậc • Cấu trúc bậc  Trung tâm hoạt động enzyme Cholinesterase 1.1.1.3 Tính chất xúc tác Cholinesterase 1.1.1.4 Động học enzyme hiểu biết cỏ chế xúc tác Cholinesterase 1.1.2 Phân loại cholinesterase 1.1.3 Ứng dụng cholinesterase 1.1.4 Các phương pháp tách chiết tinh enzyme cholinesterase 1.1.4.1 Thu nhận huyết ngựa 1.1.4.2 Phương pháp tủa muối 1.1.4.3 Phương pháp thẩm tích 1.1.4.4 Phương pháp sắc ký  Sắc ký lọc gel  Sắc ký trao đổi ion 1.2 Tình hình nghiên cứu cholinesterase nước 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu huyết ngựa 3.1.2 Hóa chất - Choline chloride, 2,6-diclorophenolindopheno, tinh thể albumin (sigma Aldrich- USA), butyrylthiocholine iodide, màng thẩm tích xelophan (ICN biomedical- USA), DEAE sepharose fast flow (Amersham Biosciences- Đức) - Muối amonisunfat, Nacl…và hóa chất khác có độ tinh khiết cao 3.1.3 Thiết bị nghiên cứu STT Thiết bị Máy quang phổ tử ngoại- khả biến Hãng sản xuất Jasco- V530, Nhật Máy ly tâm lạnh Hettich- Đức Máy đông khô Thermo Savant- Mỹ Tủ ấm thường Jeio Tech- Hàn Quốc Máy đo pH Hanna Máy điện di Hoefer- Mỹ Hệ thống phân tích ảnh Biorad- Italia 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 3.2.1 Địa điểm: Viện Hóa Học Môi Trường Quân Sự 282 Lạc Long Quân- Tây Hồ- Hà Nội 3.2.2 Thời gian tiến hành: Từ ngày 18/03/2013 - / /2013 3.3 Nội dung nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp tách Cholinesterase từ huyết ngựa 3.3.2 Tinh Cholinesterase phương pháp sắc kí trao đổi ion sử dụng nhựa trao đổi DEAE sepharose fast 3.3.3 Nghiên cứu số tính chất Cholinesterase 3.3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.3.4.1 Tách ChE phương pháp kết tủa phân đoạn muối (sử dụng muối (NH4)2SO4 Sử dụng muối (NH4)2SO4 nồng độ khác để tách enzyme cholinesterase từ huyết ngựa Kết trình bày phần báo cáo 3.3.4.2 Tinh ChE phương pháp sắc ký trao đổi ion điều kiện pH khác Dựa khả tích điện phân tử protein, tùy thuộc pH dung dịch mà phân tử protein tích điện âm hay dương Do vậy, người ta tạo loại nhựa trao đổi ion mang điện tích âm dương để bắt giữ phân tử protein mong muốn, phân tử protein khác điện tích với nhựa chạy qua cột Sử dụng dung dịch rửa giải thích hợp (thường loại muối, phổ biến NaCl) phân tử protein mong muốn đẩy khỏi cột, tiến hành thu phân đoạn xác định phân đoạn có protein mong muốn Ta rửa giải nhiều lần dung dịch muối khác (sắc ký lần 2, lần 3) để thu protein mong muốn với độ cao 7 3.3.4.3 Xác định hoạt độ ChE sử dụng phương pháp pH – met theo quy trình H.O.Michel Xác định hoạt độ ChE sử dụng phương pháp pH – met Sử dụng công thức tính sau: ∆pH  pH − pH   t − t1 − b F = h pH1 pH2: giá trị pH ban đầu pH cuối t1: thời gian thêm chất vào t2: thời gian tương ứng xác định pH2 h: thời gian b: hệ số điều chỉnh mức độ thủy phân tương ứng pH2 F: hệ số tương ứng xác định đại lượng pH/h 3.3.4.4 Phương pháp xác định protein tổng số theo lowry Hàm lượng protein tổng số ChE bước trình tách tinh xác định theo phương pháp đo mật độ quang OD 280 phương pháp lowry với tinh thể albumin huyết bò làm đường chuẩn 3.3.4.5 Phương pháp xác định hoạt độ Cholinesterase theo tiêu chuẩn ukraina Cholinesterase phân hủy chất butyrylcholin iodua thành axit butyric choline iodua Axit butyric tạo thành làm giảm pH dung dịch phản ứng với chị thị màu phenol đỏ làm màu dung dịch chuyển sang màu gia cam giống với màu dung dịch chuẩn Tính thời gian chuyển màu xác định hoạt độ cholinesterase 3.3.4.6 Phương pháp điện di protein Chuẩn bị gel chạy điện di ChE tiến hành theo phương pháp Main cộng 3.3.4.7 Phương pháp thống kê toán học PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phương pháp tách Cholinesterase từ huyết ngựa Tách ChE từ huyết ngựa phương pháp kết tủa phân đoạn sử dụng muối amonisunphat gồm giai đoạn: Giai đoạn 1: Hòa tan 100g, 120g, 140g, 160g, 180g, 200g muối (NH4)2SO4 vào lít dung dịch huyết ngựa Giai đoạn 2: Dung dịch thu từ giai đoạn tiếp tục bổ xung (NH4)2SO4 vào cách: chuẩn bị dung dịch bão hòa (NH 4)2SO4 nhiệt độ phòng, sau đưa vào dung dịch với tỷ lệ 20g, 40g, 60g, 80g, 100g khuấy Giai đoạn 3: Dung dịch thu giai đoạn tiếp tục bổ xung (NH4)2SO4 với tỷ lệ 40g, 60g, 80g, 100g, 120g/ lít dịch, khuấy đều, để lắng nhiệt độ phòng 4.2 Tinh Cholinesterase phương pháp sắc kí trao đổi ion sử dụng nhựa trao đổi DEAE sepharose fast Sử dụng gel DEAE với điều kiện pH rửa giải khác nhau, giai đoạn gồm bước: Bước 1: Chạy sắc ký pH ÷ 4,5 đệm axetat Bước 2: Chạy sắc kí pH ÷ 8,5 đệm photphat 4.3 Nghiên cứu số tính chất Cholinesterase 4.3.1 Ảnh hưởng thời gian ly tâm vận tốc ly tâm 4.3.2 Ảnh hưởng pH 4.3.3 Xác định độ pH tối ưu 4.3.4 Xác định nhiệt độ thích hợp 4.3.5 Xác định đệm thích hợp sử dụng trình chạy sắc kí 10 4.3.6 Nghiên cứu điều kiện nâng cao họa độ ChE chạy sắc kí PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 11 5.2 Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO 12 Thái nguyên, ngày…tháng….năm 2013 Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực Trần Lê Nam ... hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu huyết. .. học enzyme hiểu biết cỏ chế xúc tác Cholinesterase 1.1.2 Phân loại cholinesterase 1.1.3 Ứng dụng cholinesterase 1.1.4 Các phương pháp tách chiết tinh enzyme cholinesterase 1.1.4.1 Thu nhận huyết. .. Hồ- Hà Nội 3.2.2 Thời gian tiến hành: Từ ngày 18/03/2013 - / /2013 3.3 Nội dung nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp tách Cholinesterase từ huyết ngựa 3.3.2 Tinh Cholinesterase phương pháp sắc kí trao