Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam và bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách các hợp chất trong chè dây

Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ VỎ CAM VÀ BƯỞI, ỨNG DỤNG LÀM DUNG MÔI THÂN THIỆN CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT TRONG CHÈ DÂY Người hướng dẫn: TS ĐẶNG ĐỨC LONG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ ĐAN HUYỀN Số thẻ sinh viên: 107120253 Lớp: 12SH Đà Nẵng, 5/2017 i Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây LỜI CẢM ƠN Trên thực tế khơng có thành công không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt năm học giảng đường trường Đại học Bách Khoa - Đại học Đà Nẵng, em nhận nhiều quan tâm giúp đỡ q thầy cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô môn Công nghệ Sinh học với tri thức tâm huyết truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em thời gian học tập trường Em xin chân thành cảm ơn TS Đặng Đức Long tận tình hướng dẫn em suốt thời gian làm đề tài Giúp đỡ em vượt qua thời kì khó khăn đề tài Nếu khơng có giúp đỡ, chỉnh sửa tận tình thầy em nghĩ báo cáo khó hoàn thành Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cán phịng thí nghiệm môn ThS Võ Công Tuấn ThS Phạm Thị Kim Thảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành tốt thí nghiệm phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học Em đặc biệt cảm ơn ThS Võ Cơng Tuấn tận tình giúp đỡ, hỗ trợ hướng dẫn em thực thao tác với thiết bị phục vụ nghiên cứu Bên cạnh đó, em xin cảm ơn NCS Nguyễn Thị Xuân Thu hỗ trợ hóa chất phục vụ cho đề tài Con cảm ơn gia đình tài trợ tài động viên suốt trình học tập, trình thực đồ án tốt nghiệp Bước đầu vào nghiên cứu khoa học, kiến thức em cịn hạn chế khơng bỡ ngỡ Do vậy, không tránh khỏi thiếu sót điều chắn, em mong nhận thơng cảm ý kiến đóng góp q báu quý Thầy Cô để đề tài em hoàn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình, quý báu thầy cơ, gia đình bạn bè Đà Nẵng, ngày 25 tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Thị Đan Huyền ii Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết tính tốn đồ án tốt nghiệp trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực đồ án cảm ơn thơng tin trích dẫn đồ án rõ nguồn gốc rõ ràng phép công bố Đà Nẵng, ngày 25 tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Thị Đan Huyền iii Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây MỤC LỤC Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời nói đầu Lời cam đoan liêm học thuật i ii Mục lục Danh mục bảng biểu iii v Danh mục hình ảnh vi MỞ ĐẦU .1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Tổng quan dung môi tự nhiên thân thiện 1.2.1 Dung môi tự nhiên thân thiện môi trường 1.2.2 Sơ lược tinh dầu 1.2.3 Nguồn gốc, cấu trúc tên D – limonene 1.2.4 Tính chất D - limonene 1.2.5 Ứng dụng limonene .6 1.2.6 Một số loại tinh dầu có chứa hàm lượng limonene cao Việt Nam 1.3 Một số quy trình tách chiết sử dụng dung môi thân thiện 10 1.4 Tổng quan chè dây 11 1.4.1 Mô tả 12 1.4.2 Phân bố 13 1.4.3 Sinh thái 13 1.4.4 Tác dụng dược lý .13 1.5 Tổng quan phương pháp sắc ký mỏng 14 1.5.1 Sắc ký .14 1.5.2 Sắc ký mỏng 14 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Hóa chất 17 2.1.3 Dụng cụ 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Tách chiết tinh dầu hệ thống chưng cất kết hợp siêu âm .17 iv Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây 2.2.2.Tách chiết tinh dầu hệ thống cô quay chân không kết hợp siêu âm 18 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng mức độ siêu âm đến hàm lượng tinh dầu thu 19 2.2.4 Khảo sát tính làm dung mơi tinh dầu thu 19 2.2.5 Pha dung dịch thuốc thử vani 20 2.3 Phương pháp phân tích số liệu 20 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Tách chiết tinh dầu hệ thống chưng cất kết hợp siêu âm 21 3.2 Tách chiết tinh dầu hệ thống cô quay chân không kết hợp siêu âm 22 3.3 Khảo sát ảnh hưởng mức độ siêu âm đến hàm lượng tinh dầu thu 23 3.4 Khảo sát tính làm dung mơi tinh dầu 23 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 4.1 Kết luận 26 4.2 Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined v Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo limonene Hình 1.2 Cấu trúc không gian limonene Hình 1.3 Tinh dầu cam .9 Hình 1.4 Quy trình chiết mẫu có kết hợp siêu âm 10 Hình 1.5 Tách chất sử dụng chiết Soxhlet, kết hợp chiết Clevenger 11 Hình 1.6 Cây chè dây 12 Hình 1.7 Chè dây khô 13 Hình 1.8 Sắc ký mỏng 16 Hình 2.1 Sơ đồ tách chiết tinh dầu vỏ họ Cam 18 Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp cô quay chân không .19 Hình 3.1 Tinh dầu vỏ cam 21 Hình 3.2 Tinh dầu vỏ bưởi 21 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn thể tích tinh dầu cam, bưởi thu theo khối lượng mẫu vỏ đem chưng cất 22 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc lượng tinh dầu thu vào biên độ siêu âm 23 Hình 3.5 Bản mỏng với tỉ lệ dung môi n-hexan : etylaxetat 6:4 (v/v) trước sau nhuộm thuốc thử 24 Hình 3.6 Bản mỏng với tỉ lệ dung môi n-hexan : etylaxetat 5:5 (v/v) trước sau nhuộm thuốc thử 24 Hình 3.7 Bản mỏng với tỉ lệ dung mơi n-hexan : etylaxetat 4:6 (v/v) trước sau nhuộm 25 vi MỞ ĐẦU Việt Nam đất nước có khí hậu nhiệt đới, gió mùa, thích hợp cho phát triển, đa dạng sinh thái Với đa dạng đó, Việt Nam mọc nhiều loại dược liệu quý Hiện nay, hợp chất thiên nhiên chủ đề nhắc đến nhiều nơi, có Việt Nam Từ đây, việc tìm loại dược liệu nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, hợp chất quan trọng loại dược liệu hướng nghiên cứu nhiều người tìm đến Chè dây lồi dược liệu mọc tự nhiên vùng núi Việt Nam Gần đây, chè dây biết đến phổ biến nhờ khả chữa số bệnh, đặc biệt bệnh loét dày – hành tá tràng Trong trình nghiên cứu loại hợp chất bên trong, người nghiên cứu phải tiếp xúc với dung môi n – hexan, ethylacetate, toluen, Các dung mơi dung mơi độc hại, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người thao tác thí nghiệm, người hướng dẫn, nhân viên làm việc gần Mặt khác, số thí nghiệm môi trường học đường, việc sử dụng dung mơi độc hại có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe học sinh – sinh viên Đặc biệt, trường có điều kiện sở hạ tầng cịn hạn chế vấn đề cấp bách Vì vậy, việc tìm dung mơi thân thiện để thay dung môi độc hại vấn đề cần quan tâm trọng Dung môi thay phải dung mơi dễ tìm, khơng gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người, thân thiện với môi trường phải có tính chất tương đương với dung môi thay Từ yếu tố thực tiễn đó, em xin đề xuất đề tài: “Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây” SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Trên giới, trình chiết tách chất hầu hết sử dụng dung môi độc hại, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người thực thao tác thí nghiệm Trong trường học, đặc biệt trường có điều kiện vật tư sở hạn chế, việc dùng dung mơi độc hại thí nghiệm gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe giáo viên, học sinh, người làm việc gần Về tính tạm thời, người tiếp xúc với dung mơi thường đau đầu, chóng mặt, đau bụng, buồn nơn, Về tính lâu dài, hít nhiều dung mơi độc hại xảy việc tích tụ độc tố thể dẫn đến số bệnh lý khác Vì vậy, việc tìm dung mơi thân thiện mơi trường vừa dễ tìm, khơng gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người, gây hại đến mơi trường vừa phải có tính chất tương đương với dung môi truyền thống, để thay dung môi độc hại vấn đề quan tâm khoa học Từ trước đến nay, việc khai thác hợp chất tự nhiên có tính chất q hay khả phịng trừ bệnh ln đề tài nhà khoa học quan tâm Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam đất nước thích hợp cho phát triển nhiều loài dược liệu quý Từ đây, việc nghiên cứu khảo sát hợp chất dược liệu, hoạt tính sinh học chất quan tâm trọng Trong trình thực nghiên cứu tách chiết hợp chất thiên nhiên đó, nhà nghiên cứu thường phải sử dụng dung môi n – hexan, ethylacetate, toluene, Những dung môi sử dụng dung môi độc hại sức khỏe người, cần hạn chế sử dụng thay dung mơi khác độc hại Dung môi n – hexan thành phần xăng sản phẩm từ dầu mỏ Dung môi n – hexan sử dụng để chiết tách dầu thực vật dầu đậu nành, dầu lanh, dầu đậu phộng, dầu hướng dương Tuy nhiên, n – hexan chất vô độc hại sức khỏe người Theo vài nghiên cứu giới, D – limonene (có chủ yếu tinh dầu vỏ họ Cam) dùng làm dung mơi chiết tách hợp chất thiên nhiên từ thực vật [14 – 19] Bên cạnh đó, D – limonene xác định thay dung môi n – hexan việc chiết tách chất dầu từ tự nhiên [13, 16] Hơn nữa, loại vỏ cam, vỏ bưởi phế liệu ngành công nghiệp nước trái cây, giải khát Việc tận dụng nguồn phế liệu ngành nước giải khát làm nguyên liệu để sản xuất tinh dầu, D – limonene vừa giúp giảm lượng chất thải môi trường, vừa tạo lượng dung mơi lớn để thay SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long n – hexan ứng dụng chiết tách dầu Đối tượng cụ thể sử dụng để thử nghiệm khả làm dung mơi D – limonene đề tài chè dây Cũng nằm số dược liệu, chè dây biết đến vị thuốc hỗ trợ điều trị bệnh lý liên quan đến đường tiêu hóa Chè dây mọc hoang rừng sâu, tiếng Sa Pa, Cao Bằng, Lâm Đồng… Thời gian gần đây, chè dây người rừng lấy phơi khơ pha nước uống hàng ngày Vì điều đơn giản nước Chè dây rừng có mùi hương tự nhiên đậm chất thiên nhiên, không thuốc trừ sâu, khơng hóa chất độc hại Nhưng sau uống loại Chè dây rừng người cảm thấy thèm ăn, ăn ngon miệng hơn, điều sau uống khoảng vài ngày bị ngủ thèm ngủ, ngủ ngon hơn, giấc ngủ sâu hơn, có tinh thần sảng khối làm việc có hiệu Đặc biệt, người bệnh đau dày thun giảm nhanh chóng khơng ngờ Theo Vũ Nam (Đánh giá tác dụng chè dây điều trị loét dày – hành tá tràng lâm sàng, nội soi giải phẫu bệnh, Tạp chí nghiên cứu khoa học 59(6) – 2008, 54 -57), chè dây có tác dụng cắt đau loét dày – hành tá tràng, làm liền sẹo ổ loét dày qua kiểm tra nội soi đạt 79,55%, làm Helicobater pylori với tỉ lệ 42,5%, làm hết viêm niêm mạc dày, viêm dày giảm rõ rệt Chính lý đó, việc chiết tách tinh dầu để thu D – limonene dùng làm dung môi thân thiện để thay n – hexan công đoạn chiết tách chất tự nhiên, với đối tượng nghiên cứu cụ thể chè dây, vấn đề cấp thiết 1.2 Tổng quan dung môi tự nhiên thân thiện 1.2.1 Dung môi tự nhiên thân thiện môi trường Mục đích hóa học xanh giảm tác động liên quan đến hóa chất tới sức khoẻ người loại bỏ ô nhiễm môi trường thơng qua chương trình phịng ngừa bền vững Hóa học xanh tìm kiếm mơi trường phản ứng thay thế, thân thiện với môi trường đồng thời cố gắng tăng tỷ lệ phản ứng giảm nhiệt độ phản ứng thấp Dung môi thân thiện dung mơi vừa dễ tìm, vừa khơng gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người gây tác hại với môi trường Dung môi tự nhiên quan tâm để thay dung môi hữu độc hại áp dụng cho nhiều q trình chế biến hóa học chiết tổng hợp Dung môi thân thiện nhận nhiều ý lượng xanh Điều gán cho lượng lớn dung môi thường sử dụng phản ứng (đặc biệt giai đoạn làm sạch) công thức Mặc dù vậy, dung môi không trực tiếp chịu trách nhiệm thành phần sản phẩm phản ứng, SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long thành phần hoạt động cơng thức Do việc sử dụng dung mơi độc hại, dễ cháy, gây hại mơi trường khơng cần thiết đặc điểm khơng ảnh hưởng đến thành phần phản ứng Tuy nhiên hậu không may việc sử dụng dung môi thường liên quan đến thuộc tính có ích dung môi cần thiết cho ứng dụng Sự biến động dung môi cho phép thu hồi tinh chế dung môi cách chưng cất, tạo lượng khí thải khơng mong muốn nguy tiếp xúc người lao động Các dung mơi có độ phân cực cao cần thiết để hòa tan lượng lớn chất đẩy nhanh phản ứng, chức thường gây độc tính [15] Các dung môi thân thiện – dung môi xanh thu từ tự nhiên (nước CO2) chất phế liệu nơng nghiệp (terpene) nguồn dầu mỏ có tính chất hịa tan tốt dung mơi thơng thường Những tiến gần phương pháp tiếp cận "xanh" có động lực lớn ngành cơng nghiệp dầu nhờ dung môi xanh, terpene (d-limonene, p-cymene α-pinen) Terpene đơn vị isoprene (C5H8) thu từ nguồn nơng nghiệp Ví dụ, d – limonene có nguồn gốc từ vỏ họ cam sử dụng nhiều ứng dụng Tương tự, p-cymene α-pinene có nguồn gốc từ dầu rừng thơng Thật thú vị, dung mơi có tính chất hịa tan tốt phân tử giống Hansen đề xuất ba thuộc tính gọi đặc tính Hansen dựa lượng lực phân tán (δd), dipolar (δd) liên kết hydro (δh) phân tử Trong nghiên cứu, terpenes tìm thấy có đặc tính n – hexan chứng minh khả hòa tan phân tử tương tự Hơn nữa, terpene khơng an tồn có điểm tán xạ cao mà cịn có cơng suất phân ly cao chút khác biệt nhỏ số điện môi so với n-hexan [16] Tinh dầu khảo sát chất đáp ứng yếu tố dung môi thân thiện môi trường 1.2.2 Sơ lược tinh dầu Tinh dầu loại chất lỏng chứa hợp chất thơm dễ bay tan lẫn vào chiết xuất cách chưng cất nước ép lạnh, từ cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, phận khác thực vật Ở nhiệt độ thường, tinh dầu thường thể lỏng, có khối lượng riêng bé (trừ tinh dầu quế, đinh hương, ), khơng tan nước ít, tan tốt số dung môi hữu Tinh dầu bay với nước, có vị cay ngọt, nóng, bỏng, có tính sát trùng mạnh Thành phần hóa học tinh dầu gồm terpen dẫn xuất chứa oxy terpen (ancol, andehyte, ceton, este, ) Mặc dù có nhiều cấu tử thành phần tinh dầu, song có vài cấu tử có giá trị tạo nên mùi đặc trưng tinh dầu SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 1.5 Tổng quan phương pháp sắc ký mỏng 1.5.1 Sắc ký Là nhóm phương pháp hóa lý nhằm để phân tách thành phần hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa phân chia khác chất khác vào hai pha ln tiếp xúc khơng hịa lẫn vào nhau: pha tĩnh pha động Pha tĩnh trì hỗn di chuyển thành phần mẫu Khi thành phần di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng tách khỏi theo thời gian Mỗi thành phần qua hệ thống khoảng thời gian riêng biệt, gọi thời gian lưu Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp chuyên chở chất lỏng khí thành phần tách phân bố khác chất hòa tan chúng chảy qua pha tĩnh rắn lỏng Nhiều kỹ thuật khác dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa tính khác chất mơi trường động khí lỏng môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua giấy, gelatin hay gel magnesium silicate, Sắc ký phương pháp để phân tách tinh phân tử sinh học Sắc ký phương pháp nhanh, dễ dàng không ảnh hưởng đến protein, phương pháp đề nghị nghiên cứu định lượng protein hay phân tử 1.5.2 Sắc ký mỏng Sắc ký mỏng TLC (Thin Layer Chromatography) hay gọi sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào tượng hấp thu pha động dung mơi hỗn hợp dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin) Pha tĩnh tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên phẳng kiếng, nhôm hay plastic Do chất hấp thu tráng thành lớp mỏng nên phương pháp gọi sắc ký mỏng - Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy - Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, ) tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên kiếng, nhôm, hay plastic Chất hấp thu nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay lọai polymer hữu - Mẫu cần phân tích: thường hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác Sử dụng khoảng 1µl dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ vi quản để chấm thành điểm gọn pha tĩnh, vị trí phái cao chút so với mặt thoáng chất lỏng chứa bình SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 14 - Pha động: dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo lớp mỏng, lôi kéo mẫu chất theo Dung mơi di chuyển cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất di chuyển với vận tốc khác nhau, phía sau mực dung môi Vận tốc di chuyển phụ thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ mẫu chất lại pha tĩnh tùy thuộc vào độ hòa tan mẫu chất dung môi Ưu điểm: - Chỉ cần lượng mẫu để phân tích - Có thể phân tích đồng thời mẫu chất chuẩn đối chứng điều kiện phân tích - Tất hợp chất mẫu phân tích định vị sắc ký mỏng Các bước thực sắc ký mỏng: - Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính ống nhỏ, khỏang 1-2 mm, đầu vót nhọn, dài 10-20 cm Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác nhau, cần sau lần sử dụng, rửa vi quản dung môi hữu aceton - Chuẩn bị mỏng: mỏng thương mại 20x20 cm, dùng kéo cắt với kiách thước cần thiết, phải vừa bình giải ly Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát mức tiền tuyến dung môi - Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu chất lỏng, chấm trực tiếp mẫu lên mỏng, mẫu dung dịch q sễt, pha lỗng mẫu Với mẫu chất rắn phải hịa tan dung mơi hữu phù hợp, nồng độ 2-5% Nhờ vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt sắc ký mỏng cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt lớp mỏng Mỗi vết chấm khơng chứa nhiều 12 µg (10 µg tối ưu) mẫu chất - Sấy nhẹ để dung môi bay khỏi vết chấm, nhúng vào dung dịch giải ly - Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau bình bão hịa dung mơi, người ta đặt mỏng vào bình khai triển vết chấm mẫu bờ cạnh phía đáy bình Cạnh đáy lớp mỏng nậgp dung môi giải ly khỏang 0,5-1cm Các vết mẫu khơng ngập dung mơi giải ly, dung môi khuếch tán vào dung môi - Hiện hình vết sau giải ly: Các hợp chất có màu nhìn thấy mắt thường, phần lớn hợp chất hữu màu, nên SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 15 muốn nhìn thấy vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254 nm ánh sáng nhận hợp chất hấp thu tia UV, hợp chất có màu tối sẫm sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánh sàng phát nhữgn hợp chất có phát hùynh quang, vết sẫm chất mẫu có màu sáng mỏng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học (Bằng cách dung thuốc thử iod, 2,7-fluorescein phát đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát aldehyde hay caton, clorur antimony phát steroid hay vitamin hay carotenoid,…) - Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển chất phân tích hệ số di chuyển Rf tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung mơi: Rf = a/ b Trong đó: a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm, b khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo đường vết, tính cm Rf: Chỉ có giá trị từ đến l Hình 1.8 Sắc ký mỏng Đọc kết sắc ký đồ: Do số hóa chất sau tách khơng màu nên ta áp dùng vài phương pháp khác để phát hiện: - Thêm chất huỳnh quang( Mn hoạt hóa Zn silicate) cho thêm vào chất hấp thụ để quan sát vệt ánh sáng đèn (tia cực tím UV254) Lớp hấp thụ phát ánh sáng lục vệt mẫu làm tắt ánh sáng - Hơi iot thuốc thử cho màu giống - Trong trường hợp chất béo, sắc phổ di chuyển qua màng polyvinylideneflouride (PVDF) sau phân tích kỹ ví dụ khối phổ - Thuốc thử vani – H2SO4 SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 16 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu - Vỏ bưởi thu thập quầy bưởi đường Ơng Ích Khiêm, từ tháng 10/ 2016 bảo quản -20oC - Vỏ cam thu thập từ quầy nước ép trái – chợ Siêu thị, từ tháng 3/2017 bảo quản -20oC - Chè dây khô mua xã Ba, huyện Đông Giang, tỉnh Quảng Nam 2.1.2 Hóa chất - Dung dịch n – hexan (Trung Quốc) - Dung dịch D – limonene 90% (Merck, Đức) - Dung dịch etylaxetat (Trung Quốc) - Dung dịch H2SO4 (Trung Quốc) - Vani (phụ gia thực phẩm, Việt Nam) - Dung dịch metanol (Merck, Đức) - Axit axetic ( Trung Quốc) 2.1.3 Dụng cụ Các dụng cụ sử dụng: Bản mỏng TLC Silica Gel 60G F254, ống sừng bị, ống sinh hàn, bình cầu, nhiệt kế, ống đong, cốc thủy tinh, pipet, bình tam giác ( dung tích 100, 250, 500ml), bình penicillin, Máy móc thiết bị: - Thiết bị siêu âm dạng trục (Labsonic, B Braun Biotech International); - Bể siêu âm (Elmasonic 300H); - Hệ thống cô quay chân không (Heidolph); - Cân phân tích điện tử E1240 – OHAUS – Mỹ, 2001 - Cân kỹ thuật ARC 120 OHAU – Mỹ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết tinh dầu hệ thống chưng cất kết hợp siêu âm Sau tìm hiểu tham khảo vài phương pháp chiết tách tinh dầu, em đề xuất phương pháp đây: SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 17 - Vỏ cam bưởi thu thập lại sau rửa sạch; - Nghiền mịn vỏ (mẫu) máy xay; - Sử dụng thiết bị siêu âm dạng trục phá vỡ tế bào [12]; - Chưng cất lôi nước [12]; - Thu tinh dầu từ nước chưng cho vào ống đong để xác định thể tích Hình 2.1 Sơ đồ tách chiết tinh dầu vỏ họ Cam 2.2.2.Tách chiết tinh dầu hệ thống cô quay chân không kết hợp siêu âm Phương pháp đề xuất thực để so sánh hiệu suất chiết tách với phương pháp chưng cất lôi nước - Vỏ cam bưởi thu thập lại sau rửa sạch; - Nghiền mịn vỏ (mẫu) máy xay; - Sử dụng thiết bị siêu âm phá vỡ tế bào không sử dụng siêu âm; - Cô quay chân không với dung môi nước; - Thu tinh dầu từ nước chưng SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 18 Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp quay chân khơng 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng mức độ siêu âm đến hàm lượng tinh dầu thu Phần khảo sát khảo sát với tinh dầu vỏ cam - Các bước tiến hành việc tách chiết tinh dầu phương pháp chưng cất lôi nước thực mục - Thời gian chu kỳ siêu âm giữ nguyên - Thay đổi biên độ siêu âm 50, 60, 70, 80, 90 - Tiến hành song song mẫu không siêu âm 2.2.4 Khảo sát tính làm dung mơi tinh dầu thu - Nghiền mịn chè dây; - Cho dung môi vào bột chè dây; - Siêu âm bể siêu âm 60 phút, 35oC; - Hút lớp dịch chiết lỏng phía trên; - Cho bay dung môi, thu cao chiết; - Dùng sắc ký mỏng kiểm tra khả chiết dung môi: + Hòa tan lại cao chiết cồn 96, + Dùng mao dẫn chấm cao chiết hòa tan lên mỏng, + Đặt mỏng vào cốc có chứa pha động, với hệ dung môi pha động khảo sát gồm hexan etylaxetat SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 19 + Sấy khô mỏng, + Đọc kết quả, + Nhuộm màu mỏng với thuốc thử vani để màu + Đọc kết sau nhuộm Bảng 2.1 Tỉ lệ dung môi pha động theo thể tích (v/v) Hexan Etylaxetat Thí nghiệm thực với dung môi tinh dầu thu n – hexan để so sánh tính chất 2.2.5 Pha dung dịch thuốc thử vani - Dùng ống đong, đong cẩn thận 50ml dung dịch metanol đổ vào bình chứa tối màu - Thêm vào bình 6,25ml axit axetic - Cân xác 0,3g vani cho vào bình, lắc nhẹ - Hút cẩn thận 2,75ml dung dịch H2SO4 96% cho vào bình, lắc cẩn thận, tránh bị bắn axit ngồi 2.3 Phương pháp phân tích số liệu Mọi kết quả, số liệu đồ thị xử lý tính tốn phần mềm Microsoft Excel SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 20 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết tinh dầu hệ thống chưng cất kết hợp siêu âm Xây dựng thành cơng quy trình tách tinh dầu vỏ cam hệ thống chưng cất lôi nước với ống sinh hàn, có kết hợp siêu âm Trong phần nước chiết thu được, phân lớp rõ ràng, lớp dầu nằm phía nước phía Lượng dầu thu nhiều đáng kể Kết thực nghiệm, từ 1500g vỏ cam thu 60ml tinh dầu cam Hình 3.1 Tinh dầu vỏ cam Quy trình tách tinh dầu vỏ bưởi hệ thống chưng cất lơi nước, có kết hợp siêu âm không thành công Lượng tinh dầu thu không đáng kể, hiệu suất thu hồi tinh dầu bưởi thấp Hình 3.2 Tinh dầu vỏ bưởi SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 21 Em tiến hành thử nghiệm song song hai loại mẫu vỏ cam vỏ bưởi, với khối lượng Tuy nhiên, lượng tinh dầu thu từ việc chưng cất mẫu vỏ bưởi thấp lượng tinh dầu thu từ chưng cất mẫu vỏ cam Kết biểu diễn trog đồ thị sau: Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn thể tích tinh dầu cam, bưởi thu theo khối lượng mẫu vỏ đem chưng cất Theo phần tổng quan viết, hàm lượng tinh dầu vỏ bưởi (0,3-0,9%) thấp hàm lượng tinh dầu vỏ cam (1,3-3,5%), dẫn đến việc chiết tách tinh dầu theo điều kiện phương pháp cho lượng tinh dầu vỏ cam cao Từ thực nghiệm, em chứng minh điều vỏ bưởi tươi cho hàm lượng tinh dầu cao vỏ bưởi chín vàng/ héo 3.2 Tách chiết tinh dầu hệ thống cô quay chân không kết hợp siêu âm Trong phương pháp này, em sử dụng hệ thống cô quay kèm máy bơm/ hút chân không để chiết tinh dầu song song với hệ thống chưng cất lơi nước Tuy nhiên, nhiệt độ sôi tinh dầu lớn nhiều so với nước lực hút chân không máy bơm mạnh nên sản phẩm cô quay không thấy có xuất dầu Tách chiết tinh dầu hệ thống cô quay chân không không phù hợp Mặc dầu, so với phương pháp chưng cất lôi nước phương pháp giúp tiết kiệm thòi gian, hiệu suất chiết tách tinh dầu thấp không áp dụng SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 22 3.3 Khảo sát ảnh hưởng mức độ siêu âm đến hàm lượng tinh dầu thu Sau giữ cố định thời gian chu kỳ, mức biên độ dao động thay đổi từ 50 đến 90 để khảo sát - Lượng tinh dầu thu biên độ 80 90 tích xấp sỉ - Ở mức biên độ 50, 60 70, lượng tinh dầu thu tích tăng dần - Mẫu khơng siêu âm cho lượng thể tích tinh dầu thấp Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc lượng tinh dầu thu vào biên độ siêu âm Kết thu chứng tỏ hàm lượng tinh dầu cam (D – limonene chiếm ưu thế) thu mẫu có siêu âm cao mẫu khơng dùng siêu âm Việc siêu âm mẫu phá vỡ tế bào giúp tạo lượng dầu cao hơn, có hiệu hỗ trợ chiết tách tinh dầu 3.4 Khảo sát tính làm dung mơi tinh dầu Bột chè dây cân xác cho vào bình penicillin khác nhau, đánh dấu Cho thêm thể tích tinh dầu vào bình thứ thể tích n – hexan vào bình thứ Sau đó, đặt bình penicillin chứa mẫu vào bể siêu âm Sau 60 phút, bình chứa mẫu lấy ngồi để n phút Bên bình penicillin có phân lớp lỏng – rắn, hút phần dịch lỏng phía – dịch chiết bình penicillin tiến hành chưng cách thủy để đuổi dung môi - Tinh dầu cam dung dịch suốt, có màu vàng Sau tiến hành chiết mẫu, dịch chiết mẫu sử dụng tinh dầu để chiết có màu xanh lục SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 23 - n – hexan dung dịch suốt, không màu Sau tiến hành chiết mẫu, dịch chiết mẫu sử dụng n – hexan để chiết có màu xanh lục, nhạt màu dịch chiết mẫu sử dụng tinh dầu để chiết Sau đuổi dung môi, cân lượng chất chiết thu thấy khối lượng mẫu sau đuổi dung môi mẫu chiết tinh dầu (0,04g) cao mẫu chiết n – hexan (0,03g) Kết mỏng sau chấm sắc ký cho mẫu cao chiết hệ dung môi n-hexan – etylaxetat: Hình 3.5 Bản mỏng với tỉ lệ dung mơi n-hexan : etylaxetat 6:4 (v/v) trước sau nhuộm thuốc thử Hình 3.6 Bản mỏng với tỉ lệ dung môi n-hexan : etylaxetat 5:5 (v/v) trước sau nhuộm thuốc thử SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 24 Hình 3.7 Bản mỏng với tỉ lệ dung môi n-hexan : etylaxetat 4:6 (v/v) trước sau nhuộm Sau tiến hành chấm sắc ký mỏng nhuộm thuốc thử em nhận thấy hệ dung môi sử dụng chưa phải hệ dung môi tối ưu cho sắc ký mỏng Tuy nhiên, vệt chạy chất chiết dùng tinh dầu n – hexan tương đương nhau, chứng tỏ chất chiết dung môi tương đương Kết cho thấy rằng, khả làm dung môi chiết tinh dầu vỏ cam tương đương với dung môi n – hexan SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 25 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài: “Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây”, dựa vào kết thu em rút số kết luận sau: Xây dựng thành cơng quy trình chiết tách tinh dầu vỏ cam, sử dụng phương pháp chưng cất lôi nước kết hợp siêu âm Khảo sát ảnh hưởng biên độ siêu âm đến hàm lượng tinh dầu thu sau chưng cất Trong khoảng biên độ khảo sát, biên độ lớn hiệu suất thu nhận tinh dầu cao Khảo sát khả làm dung môi chiết tách hợp chất chè dây tinh dầu thu tinh dầu có khả chiết tách tương đương với n – hexan 4.2 Kiến nghị Vì thời gian làm thí nghiệm có hạn, để phát triển mở rộng đề tài, em xin kiến nghị hướng nghiên cứu tiếp sau: Tối ưu hóa quy trình chiết tách tinh dầu vỏ cam để tăng hiệu suất thu nhận tinh dầu nghiên cứu lại quy trình tách chiết tinh dầu vỏ bưởi Khảo sát ảnh hưởng thời gian siêu âm mẫu trước chưng cất chu kỳ dao động trục quay siêu âm đến lượng tinh dầu thu Khảo sát ảnh hưởng thời gian siêu âm mẫu chiết chè dây đến lượng chất chiết tinh dầu cam Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột, HPLC, để chứng minh lại khả chiết tách tinh dầu vỏ cam, D – limonene SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Phạm Thanh Kỳ, Nghiên cứu chè dây làm thuốc điều trị bệnh loét dày – hành tá tràng, Bộ Y tế, Trường Đại học Dược Hà Nội, 1995 [2] Đỗ Huy Bích, Thuốc từ cỏ động vật, Nhà xuất Y học – Hà Nội, 1995 [3] Viện Dược liệu, Đỗ Huy Bích cộng sự, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập I, Nhà xuất Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội, 2006 [4] Vương Thị Hồng Vân, Nghiên cứu chè dây Sapa, Hà Nội 2002 [5] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển II, Nhà xuất trẻ, 2003 [6] Văn Đình Vệ, Sản xuất chất thơm thiên nhiên tổng hợp, Nhà xuất Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội,2002 [7] Nguyễn Tiến Công, Nghiên cứu chuyển hóa limonene tinh dầu Việt Nam, Trường Đại học Sư phạm, Tp Hồ Chí Minh, 2004 [8] Vũ Nam, Nguyễn Khánh Trạch, Đánh giá tác dụng chè dây điều trị loét dày – hành tá tràng lâm sàng, nội soi giải phẫu bệnh, Bệnh viện Y học Cổ truyền Trung ương, Tạp chí nghiên cứu khoa học 59(6) – 2008 [9] Vũ Ngọc Lộ Nguyễn Thái An, Tác dụng sinh học tinh dầu, Tạp chí dược học – 10/2010 (số 414 năm 50), 2010 Tài liệu tiếng Anh [10] Yu Qiao, Bi Jun Xie, Yan Zhang, Yun Zhang, Gang Fan, Xiao Lin Yao and Si Yi Pan, Characterization of Aroma Active Compounds in Fruit Juice and Peel Oil of Jinchen Sweet Orange Fruit (Citrus sinensis (L.) Osbeck) by GC-MS and GC-O, 2008 [11] W M Haynes, CRC Handbook of Chemistry and Physics 95th Edition, 2014 – 2015 [12] Muhammad Kamran Khan, Maryline Abert-Vian, Anne-Sylvie FabianoTixier, Olivier Dangles, Farid Chemat, Ultrasound-assisted extraction of polyphenols (flavanone glycosides) from orange (Citrus sinensis L.) peel, 2009 [13] Matthieu Virot, Vale´rie Tomao, Christian Ginies, Farid Chemat, Total lipid extraction of food using D – Limonene as an alternative to n – Hexane, 2008 [14] Mohamed Aissou, Zoubida Chemat-Djenni, Edinson Yara-Varón, AnneSylvie Fabiano-Tixier, Farid Chemat, Limonene as an agro - chemical building block SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 27 for the synthesis and extraction of bioactive compounds, 2016 [15] Fergal P Byrne, Saimeng Jin, Giulia Paggiola, Tabitha H M Petchey, James H Clark, Thomas J Farmer, Andrew J Hunt, C Robert McElroy and James Sherwood, Tools and techniques for solvent selection: green solvent selection guides, Byrne et al Sustain Chem Process, 2016 [16] S P Jeevan Kumar1, S Rajendra Prasad1, Rintu Banerjee, Dinesh K Agarwal1, Kalyani S Kulkarni and K V Ramesh, Green solvents and technologies for oil extraction from oilseeds, Kumar et al Chemistry Central Journal, 2017 [17] Chahrazed Boutekedjiret, Maryline Abert Vian, and Farid Chemat, Terpenes as green solvents for natural products extraction, 2014 [18] Li Duan, Li-Li Dou, Long Guo, Ping Li, and E-Hu Liu, Comprehensive evaluation of deep eutectic solvents in extraction of bioactive natural products, 2016 [19] G Brusotti, I Cesari, A Dentamaro, G Caccialanza, G Massolini, Isolation and characterization of bioactive compounds from plant resources:The role of analysis in the ethnopharmacological approach, 2013 Tài liệu Internet [20] http://yhocbandia.vn/che-day.html [21] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/ _-Limonene#section=Top SVTH: Nguyễn Thị Đan Huyền GVHD: TS Đặng Đức Long 28 ... chất tương đương với dung môi thay Từ yếu tố thực tiễn đó, em xin đề xuất đề tài: ? ?Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây? ?? SVTH: Nguyễn... Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài: ? ?Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây? ??, dựa vào kết thu em rút... Nguyễn Thị Đan Huyền iii Tách chiết tinh dầu từ vỏ cam bưởi, ứng dụng làm dung môi thân thiện chiết tách hợp chất chè dây MỤC LỤC Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời nói đầu Lời cam đoan liêm học thuật