PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH ASPERGILLUS FLAVUS CÓ TRONG BẮP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƯỢC

TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài: “Phân lập, định danh Aspergillus flavus có trong bắp và khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng phân lập được”, thực hiện tại phòng thực hành vi sinh, kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

- X W -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH ASPERGILLUS FLAVUS CÓ TRONG

BẮP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN

CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƯỢC

Niên khóa : 2004 - 2009

2009

-PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH ASPERGILLUS FLAVUS CÓ TRONG

BẮP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN

CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƯỢC

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực hiện: Võ Thị Đan Trâm

Tên đề tài: “Phân lập, định danh Aspergillus flavus có trong bắp và khảo sát khả

năng sinh aflatoxin của các chủng phân lập được”

Đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và ý kiến nhận xét đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp khóa ngày 17 – 18/09/2009

Giáo viên hướng dẫn

TS Lê Anh Phụng

Trân trọng biết ơn các quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cùng những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian em học tập tại trường Xin cảm ơn các quý thầy cô thuộc bộ môn Vi sinh đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này

Cảm ơn các bạn lớp Dược Thú Y 30 đã cùng tôi chia sẻ những khó khăn, vui buồn trong cuộc sống sinh viên tại giảng đường Đại học Nông Lâm yêu dấu

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài: “Phân lập, định danh Aspergillus flavus có trong bắp và khảo sát khả năng

sinh aflatoxin của các chủng phân lập được”, thực hiện tại phòng thực hành vi sinh, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh trong thời gian

từ tháng 03/2009 đến tháng 07/2009 Qua quá trình khảo sát 30 mẫu bắp nguyên liệu được lấy ngẫu nhiên từ các đại lý và cửa hàng bán lẻ thức ăn gia súc, chúng tôi thu nhận được các kết quả sau:

• Tỷ lệ các mẫu bắp bị nhiễm nấm mốc là 100% với TSKL nấm mốc trung bình

có trong 1 g bắp là 42,66 x 104

• Tỷ lệ các mẫu bắp bị nhiễm A flavus/ parasiticus là 93% với TSKL A flavus/

parasiticus trung bình có trong 1 g bắp là 1,82 x 104

• Tỷ lệ khuẩn lạc A flavus/ parasiticus so với TSKL nấm mốc là 75,35%

• Sau khi phân lập: thu được 56 chủng nghi ngờ là A flavus/ parasiticus

• Sau khi định danh: có 100% chủng phân lập được đều là A flavus

• Có 20/56 chủng phân lập có khả năng sinh aflatoxin trên môi trường thạch nước cốt dừa, chiếm tỷ lệ 35,71%

• Trong 20 chủng có khả năng sinh aflatoxin, chúng tôi chọn ra 5 chủng được xem là có khả năng sinh độc tố mạnh để nuôi cấy trên môi trường tấm gạo và tiến hành định hàm lượng aflatoxin sinh ra của 5 chủng này Kết quả về hàm lượng aflatoxin sinh ra: cao nhất là 39.216 ppb (chủng 14) và thấp nhất là 3.367 ppb (chủng 52)

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt luận văn iv

Mục lục v

Danh sách các từ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các biểu đồ ix

Danh sách các hình x

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Nấm mốc và độc tố nấm mốc 3

2.1.1 Nấm mốc 3

2.1.2 Độc tố nấm mốc 3

2.2 Nấm mốc A flavus 3

2.2.1 Phân loại 3

2.2.2 Đặc điểm hình thái 4

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 5

2.2.4 Đặc điểm sinh thái 5

2.2.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 5

2.3 Độc tố aflatoxin 6

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo aflatoxin của nấm mốc 9

2.4 Bệnh nhiễm độc aflatoxin 10

2.4.1 Cơ chế gây bệnh 10

2.4.2 Aflatoxicosis 11

2.5 Các phương pháp phát hiện và định lượng aflatoxin 12

2.5.1 Phương pháp sinh vật học 12

2.5.2 Phương pháp lý hóa 13

2.5.3 Phương pháp miễn dịch học 14

2.6 Giải pháp nhằm hạn chế tác hại của aflatoxin 14

2.6.1 Phòng nấm mốc xâm nhập và phát triển 14

2.6.2 Biện pháp loại trừ, vô hiệu hóa tính độc hại của aflatoxin 15

2.7 Một số công trình nghiên cứu có liên quan 17

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 18

3.2 Vật liệu thí nghiệm 18

3.3 Nội dung đề tài 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.5 Chỉ tiêu khảo sát 25

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả đếm TSKL nấm mốc và TSKL nghi ngờ A flavus/ parasiticus 26

4.2 Phân lập – Định danh nhóm A flavus 30

4.3 Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng A flavus đã định danh 36

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 45

• CYA: Czapek Yeast extract Agar

• FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương Nông Quốc tế)

• IARC: International Agency for Research on Cancer

(Tổ chức về bệnh Ung thư Quốc tế)

• LD50: Lethal Dose – 50 (liều gây chết 50% tổng đàn)

• ppb: part per billion (phần tỷ)

• TAGS: thức ăn gia súc

• TSKL: tổng số khuẩn lạc

• UV: Ultra violet (tia cực tím)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin 7

Bảng 2.2: Các tính chất lý hóa của một số aflatoxin chính 8

Bảng 2.3: Liều gây chết LD50 của aflatoxin B1 cho uống 1 lần duy nhất 11

Bảng 2.4: Khả năng gây ung thư gan của aflatoxin B1 ở động vật thí nghiệm 12

Bảng 2.5: Hàm lượng tối đa độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm 16

Bảng 3.1: Bố trí số lượng mẫu 19

Bảng 4.1: TSKL nấm mốc và TSKL nghi ngờ A flavus/ parasiticus trong 1 g bắp 26

Bảng 4.2: Tỷ lệ phân lập các chủng nghi ngờ A flavus/ parasiticus từ các mẫu bắp 30

Bảng 4.3: Kết quả định danh xác định nấm mốc A flavus từ các mẫu bắp 31

Bảng 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc A flavus theo thời gian nuôi cấy 31

Bảng 4.5: Kích thước khuẩn lạc của các chủng A flavus theo thời gian nuôi cấy 32

Bảng 4.6: Kích thước các thành phần sợi nấm 33

Bảng 4.7: Tỷ lệ các chủng A flavus có khả năng phát huỳnh quang trên môi trường nước cốt dừa 36

Bảng 4.8: Hàm lượng aflatoxin thu được của các chủng A flavus sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường tấm gạo 38

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Trang Biểu đồ 4.1: Trung bình TSKL nấm mốc và TSKL nghi ngờ là

A flavus/ parasiticuscó trong 1 g bắp (tính theo log cơ số 10) 27

Biểu đồ 4.2: Kích thước khuẩn lạc của các chủng A flavus theo thời gian nuôi cấy 32 Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ các chủng A flavus phát huỳnh quang trên môi trường

thạch nước cốt dừa sau 5 ngày nuôi cấy 36

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 2.1: Cấu trúc hình thái của A flavus dưới kính hiển vi 4

Hình 2.2: Quá trình sinh trưởng và phát triển của A flavus 6

Hình 2.3: Cấu trúc hóa học của các aflatoxin chính 8

Hình 3.1: Giữ giống các chủng nghi ngờ A flavus/ parasiticus 22

Hình 4.5: Khuẩn lạc A flavus phát huỳnh quang dưới đèn UV 23

Hình 4.1: Khuẩn lạc nghi ngờ A flavus/ parasiticus trên môi trường AFPA 26

Hình 4.2: Khuẩn lạc A flavus trên môi trường Czapek sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy 32

Hình 4.4: Cuống sinh bào tử và thể bọng ở độ phóng đại 400 lần 34

Hình 4.5: Thể bình 1 lớp và 2 lớp trên cùng thể bọng 35

Hình 4.6: Khuẩn lạc A flavus và khả năng phát huỳnh quang trên môi trường thạch nước cốt dừa 37

Hình 4.7: Môi trường tấm gạo sau 7 ngày nuôi cấy A flavus 38

tố trong quá trình bảo quản và sử dụng các loại thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng

Aflatoxin là loại độc tố nấm mốc thường gặp nhất trong các nguyên liệu thức ăn cho chăn nuôi ở nước ta và trên thế giới Theo ước tính của tổ chức Lương Nông Quốc

tế (FAO: Food and Agriculture Organization) thì có khoảng 25% nông sản của thế giới chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các độc tố nấm mốc, chủ yếu vẫn là aflatoxins Đây

là độc tố do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra Aflatoxin

có độc tính rất mạnh, có thể gây độc cho tất cả các loài vật khác nhau với liều lượng khác nhau Aflatoxin gây tổn thất cho gia súc, gia cầm, làm suy giảm miễn dịch, làm giảm thấp sức đề kháng của cơ thể, tăng chỉ số chuyển biến thức ăn, tăng tỷ lệ chết…

Tổ chức về bệnh Ung thư Quốc tế (IARC – International Agency for Research on Cancer) đã xếp aflatoxin vào danh sách những tác nhân gây ung thư gan cho người (Dương Thanh Liêm, 2008)

Chính vì những tác hại nguy hiểm của aflatoxin, nên việc hiểu biết về nấm

A flavus và khả năng sản sinh độc tố của chúng trên nguyên liệu thực sự là một nhu

cầu rất cần thiết, để từ đó có các biện pháp phòng chống thích hợp, giúp tăng năng suất vật nuôi và mang lại hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi

Xuất phát từ yêu cầu này, được sự chấp thuận của Khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh cùng với sự hướng dẫn của TS Lê Anh

1.2 Mục đích

- Tìm hiểu về tình hình nhiễm A flavus trong nguyên liệu bắp và khả năng sản

sinh độc tố aflatoxin của các chủng phân lập được, nhằm giúp các nhà chăn nuôi có các biện pháp phòng chống thích hợp, làm giảm tác hại của độc tố trong thức ăn, nâng cao năng suất chăn nuôi

- Chọn ra các chủng A flavus có khả năng sinh aflatoxin cao nhằm ứng dụng

trong sản xuất độc tố aflatoxin để phục vụ cho các nghiên cứu về độc chất học

1.3 Yêu cầu

- Đếm tổng số khuẩn lạc nấm mốc và tổng số khuẩn lạc nghi ngờ A flavus/

parasiticus có trong 1 g mẫu bắp

- Phân lập và định danh các chủng A flavus từ các mẫu bắp

- Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng A flavus phân lập được

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Nấm mốc và độc tố nấm mốc

2.1.1 Nấm mốc

Là nhóm vi sinh vật có những đặc điểm cơ bản sau: tế bào có nhân thật, cơ quan sinh trưởng (sợi nấm) có cấu tạo đơn bào hay đa bào, không có diệp lục tố nên cơ thể sống dị dưỡng, sinh sản hữu tính hoặc vô tính bằng bào tử, đôi khi cũng có sinh sản sinh dưỡng do sợi nấm đứt ra hoặc bằng bào tử áo (Lê Lương Tề - Nguyễn Thị Trường, 2005)

2.1.2 Độc tố nấm mốc (mycotoxin)

Mycotoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của mỗi loài nấm mốc thậm chí của mỗi chủng nấm mốc nhất định, có trọng lượng phân tử thấp và có khả năng gây biến đổi bệnh lý trên người và động vật (FAO, 1990)

Hiện nay đã có trên 300 loại độc tố nấm mốc được xác định, trong đó có 5 loại độc tố quan trọng nhất vì tính chất độc hại cũng như tần số xuất hiện cao trong nông sản, thực phẩm là: aflatoxin (AF), deoxynivalenol (DON), zearalenon, ochratoxin và fumonisin (Dương Thanh Liêm, 2008)

2.2 Nấm mốc A flavus

2.2.1 Phân loại

Giới: Mycotae (Fungi) Ngành: Amastigomycota (Deuteromycota) Lớp: Deuteromycetes (Fungi imperfecti) Bộ: Plectascales (= Eurotiales = Aspergillales)

Giống Aspergillus là một nhóm lớn gồm hơn 100 loài theo khóa phân loại thông

dụng của Raper và Fennell (1965) đã được bổ sung bởi Samson và Gams (1986), Kozakievics (1994) (Bùi Xuân Đồng và ctv, 2003)

2.2.2 Đặc điểm hình thái

Hình 2.1: Cấu trúc hình thái của A flavus dưới kính hiển vi

Loài A flavus rất dễ nhận diện bởi khuẩn lạc có màu vàng hơi lục Cuống sinh

bào tử trong suốt, bề mặt thô, xù xì, chiều dài dưới 1 mm Thể bọng hình cầu hay hơi cầu, đường kính 10 – 65 µm Thể bình thường có 2 lớp (40 – 100% số chủng) hoặc 1 lớp hoặc đôi khi cả 2 kiểu cùng có mặt trên 1 bọng Các bào tử đính có kích thước khá lớn (đường kính 5 – 7 µm), hình cầu, màu vàng nâu đến hơi lục, vách trơn láng hoặc hơi nhăn Hạch nấm thường có màu nâu đỏ cho đến đen, có thể gặp ở một số chủng (Lê Anh Phụng, 2001)

Dựa vào hình thái chúng ta có thể phân biệt A flavus và A parasiticus tuy hơi khó nhưng theo Pitt và Hocking (1997) thì bào tử của A parasiticus có bề mặt nhăn

đều, đường kính thể bọng ít khi quá 30 µm và thể bình thường chỉ có 1 lớp khi xem dưới kính hiển vi (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Minh Tần, 2004)

Thể bọng

Bào tử

Thể bình 2 lớp Thể bình 1 lớp

Cuống sinh bào tử

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

A flavus là loài hiếu khí, nhiệt độ cần cho sự phát triển vào khoảng 6 – 540C (tốt nhất là ở 30 – 350C), thích hợp ở ẩm độ tương đối 80 – 85% và pH = 3,9 – 9,1 (tối ưu

là 5,5) Chúng phát triển mạnh trên môi trường có hàm lượng saccharose cao (30 – 200 g/l) và nitrat cao (3 – 6 g/l) Điều kiện nuôi cấy giàu O2 kích thích hệ sợi nấm phát triển, trong khi CO2 kích thích sự hình thành bào tử (Moreau, 1974)

Khi nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt AFPA (48 – 60 giờ ở 300C), A flavus

cho khuẩn lạc có màu vàng cam sáng ở mặt dưới, mặt trên trắng mịn như nhung Chú

ý tránh nhầm lẫn với A niger vì trên môi trường AFPA, A niger cũng có thể mọc và mặt sau khuẩn lạc A niger cũng có màu vàng nhưng các sợi mang bào tử đính lại có màu đen hay nâu sậm Ngoài ra, khuẩn lạc A ochraceus cũng có màu vàng nhưng mọc

rất chậm (sau 4 – 5 ngày)

2.2.4 Đặc điểm sinh thái

A flavus phân bố ở khắp nơi (đất và nông sản), đặc biệt thích hợp trên các loại

hạt cốc, hạt có dầu như bắp, đậu phộng, hạt gòn… Trên lúa mì, gạo, cùi dừa, cám, hạt

kê: xâm nhiễm ít Đặc biệt, A flavus không phát triển nhiều trên đậu tương (Moss,

1991; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

Ở các vùng nhiệt đới, bào tử A flavus thường gặp trong đất quanh năm (Siraicha,

1991) làm nguồn nhiễm thường xuyên cho cây trồng Loài nấm mốc này có thể xâm nhiễm các loại hạt và xác thực vật ở ngoài đồng, trong quá trình thu hoạch, trong giai đoạn bảo quản và giai đoạn chế biến (Lillehoj, 1975; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

2.2.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Hình 2.2: Quá trình sinh trưởng và phát triển của A flavus

2.3 Độc tố aflatoxin

2.3.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin

Năm 1960, tại Anh xuất hiện một bệnh lạ (được gọi là bệnh X vì chưa rõ nguyên nhân) gây chết 10 vạn gà tây con với các tổn thương gan rất nặng nề (hoại tử, chảy máu trong gan, tăng sinh ống dẫn mật…) Bệnh còn được tìm thấy trên vịt con, gà lôi,

bê và heo Những thiệt hại to lớn do bệnh X gây ra đã thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu tìm ra nguyên nhân gây bệnh Các nghiên cứu này cũng mở đầu cho lĩnh vực khoa học nghiên cứu về nấm mốc và độc tố nấm mốc Thành công đầu tiên trong lĩnh vực khoa học còn khá non trẻ này là việc phát hiện ra độc tố aflatoxin (cũng chính

là nguyên nhân gây ra căn bệnh X) bởi Sargeant và ctv vào năm 1961 (trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001) Bệnh sau đó được gọi tên chính thức là Aflatoxicosis (Asplin, 1962; Auswich, 1963; Harvey, 1963; Butler, 1965; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

Ở Việt Nam, thông báo khoa học đầu tiên về phát hiện aflatoxin (từ các chủng

thuộc loài A flavus dùng trong một cơ sở lên men sản xuất nước chấm bằng đậu

tương) có từ năm 1970 do Phạm Văn Sổ thực hiện (Bùi Xuân Đồng, 2003)

2.3.2 Các loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin

Các loài nấm mốc có vai trò quan trọng nhất trong sản sinh aflatoxin là A flavus

và A parasiticus Ngoài ra, một số loài nấm mốc khác như Penicillium spp., Rhizopus

spp cũng có khả năng sinh aflatoxin nhưng ít có vai trò gây bệnh trong thực tế (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Văn, 2000)

Bảng 2.1: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin

Aflatoxin Loài nấm mốc

Aspergillus flavus + + Sargeant và ctv, 1961

Aspergillus parasiticus + + + + Coduer và ctv, 1963

Aspergillus nomius + + + + Kurtzman và ctv, 1987

Aspergillus oryzae + Basappa và ctv, 1967

Aspergillus niger + Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus wentii + Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ruber + Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ostianus + + Scott và ctv, 1968

Aspergillus ochraceus + Van Walbeck và ctv, 1968

Penicillium puberulum + + + + Kulik và Holaday, 1967

Penicillium variabile + Kulik và Holaday, 1967

Penicillium frequentans + Kulik và Holaday, 1967

Penicillium citrinum + Kulik và Holaday, 1967

Rhizopus sp + Van Walbeck và ctv, 1968

(Nguồn: IARC, 1993)

2.3.3 Đặc điểm của aflatoxin

Hiện nay được biết là đã có đến 20 loại aflatoxin Trong đó, cần đặc biệt chú ý đến các aflatoxin B1, B2, G1, G2 vì các aflatoxin này có độc tính cao nhất, đồng thời cũng là các aflatoxin được tạo thành với số lượng nhiều nhất cả trong các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm cũng như trong môi trường lên men (Bùi Xuân Đồng, 2003)

Hình 2.3: Cấu trúc hóa học của các aflatoxin chính 2.3.3.2 Tính chất lý hóa

Aflatoxin có dạng tinh thể màu vàng nhạt, trọng lượng phân tử thấp, dễ bị hủy bởi những chất kiềm nhưng tương đối bền với nhiệt (nhiệt độ cao hơn 1000C chỉ khử được phần nào)

Aflatoxin tan trong một số dung môi hữu cơ như chloroform, acetonitril, methanol, ethanol, aceton, benzen…nhưng không tan trong một số dung môi béo: hexan, ether ethylic, ether dầu hỏa

Bảng 2.2: Các tính chất lý hóa của một số aflatoxin chính

Aflatoxin Công thức phân tử Trọng lượngphân tử nóng chảy Nhiệt độ

(0C)

Màu huỳnh quang dưới tia UV (λ = 365 nm)

(Nguồn: Jone, 1977; trích dẫn Lê Anh Phụng, 2001)

2.3.3.3 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin

Aflatoxin là chất biến dưỡng thứ cấp được tổng hợp theo con đường polyketid Theo Payne và Brown (1998), có 17 gen mã hóa cho 12 enzym tham gia trong các phản ứng sinh tổng hợp aflatoxin và có mối liên hệ rõ ràng giữa sự sinh trưởng của

nấm mốc và khả năng sản xuất aflatoxin Ở A flavus, gen Alf-2 chịu trách nhiệm

chính trong sinh tổng hợp aflatoxin B1 và B2 Có 5 giai đoạn trong quá trình tổng hợp

aflatoxin (sơ đồ chuyển hóa được trình bày ở phần phụ lục):

(1) Giai đoạn tổng hợp từ hexanoyl CoA tạo thành norsolorinic acid do 1 polyketid

synthase xúc tác

(2) Chuỗi bên của norsolorinic acid được chuyển hóa tạo thành averufin

(3) Giai đoạn tổng hợp dihydrofuran: bao gồm versiconal acetat làm trung gian và

dẫn đến hình thành versicolorin A

(4) Giai đoạn chuyển từ versicolorin A thành sterigmatocystin (STG)

(5) Giai đoạn methyl hóa: chuyển từ sterigmatocystin thành cumarin

(Townsend, 1992; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

2.3.3.4 Tác động sinh học của aflatoxin trong cơ thể động vật

Aflatoxin xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường tiêu hóa (đôi khi qua các

đường khác như hô hấp, da…) Sau đó, độc tố này sẽ liên kết với tế bào máu hoặc

thành phần protein của huyết tương (chủ yếu là albumin) và được vận chuyển vào

máu Sau khi qua hệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủ yếu ở các cơ quan đích

là gan, thận, mề.… Tiếp theo, tại các cơ quan đích (mà nhất là gan) sẽ hoạt hóa AFB1

thành AFB1- epoxide Chất này có thể liên kết với DNA tế bào gan và protein tạo ra cơ

chế gây bệnh trên động vật Tùy thuộc vào lượng AFB1- epoxide mà thú sẽ có biểu

hiện nhiễm độc cấp tính hay mãn tính AFB1 không được hoạt hóa sẽ được bài thải ra

ngoài qua phân, nước tiểu hay qua sữa, trứng… (Campbell, 1976; trích dẫn bởi Lê

Anh Phụng, 2001)

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo aflatoxin của nấm mốc

Nhìn chung các điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng của nấm mốc cũng thuận lợi

cho sự sản sinh aflatoxin (Northolt, 1979; Lê Anh Phụng, 2001)

2.3.4.1 Loài nấm mốc

Khả năng sinh aflatoxin của các loài nấm mốc, thậm chí của các chủng nấm mốc

trong một loài cũng rất khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2003) Theo Klich và Pitt (1998)

2.3.4.2 Loại cơ chất

Aflatoxin thường được tìm thấy trên các nguyên liệu có hàm lượng carbonhydrate cao như bắp, gạo, hạt kê, đậu phộng, cùi dừa, hạt hướng dương… nhưng chủ yếu là các loại hạt có dầu, đặc biệt đậu phộng là loại cơ chất thuận lợi nhất cho sản xuất aflatoxin (Lê Anh Phụng, 2001)

Theo một số tác giả (Ambrecht, 1963; Diener và David, 1969), các chủng

A flavus nuôi cấy lâu trên môi trường tổng hợp sẽ bị giảm hoặc mất khả năng sinh

aflatoxin, trong khi nuôi cấy lâu trên môi trường tự nhiên lại làm tăng khả năng sản xuất aflatoxin (trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

2.3.4.3 Điều kiện ngoại cảnh

Nhiệt độ thích hợp cho sự sản sinh aflatoxin dao động trong khoảng 25 – 300C, tối ưu là 280C (Moreau, 1974)

Độ ẩm hạt tốt nhất cho sản xuất aflatoxin là 15 – 30% Độ ẩm tăng sẽ làm tăng sản xuất aflatoxin nhưng nếu độ ẩm trên 50% thì lại làm giảm sản xuất aflatoxin vì lúc

đó giữa các hạt có quá nhiều nước sẽ gây ra sự thiếu thoáng khí và làm tăng CO2 trong môi trường (Moreau, 1974)

Ngoài ra, các yếu tố sinh vật như sâu mọt, gặm nhấm… thường mở đường cho nấm mốc xâm nhập, phát triển và sinh độc tố Sự cạnh tranh của nhiều loài nấm mốc trên một cơ chất cũng ảnh hưởng làm tăng hoặc làm giảm lượng độc tố tạo thành (Widstrom, 1990; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

2.4 Bệnh nhiễm độc aflatoxin

2.4.1 Cơ chế gây bệnh

Aflatoxin liên kết với DNA trong nhân của tế bào vật chủ gây ức chế enzyme polymerase của DNA, làm hạn chế sự tổng hợp RNA, nên việc tạo ra enzyme polymerase t-RNA cũng giảm, hậu quả là làm giảm sút sự tổng hợp protein trong tế bào Từ đó làm rối loạn sự tăng trưởng bình thường của tế bào, dẫn đến một số bệnh trên người và gia súc (Nexterin và Viarinova, 1971; trích dẫn bởi Dương Thanh Liêm, 2008)

2.4.2 Aflatoxicosis

2.4.2.1 Aflatoxicosis trên động vật

Nhiễm độc cấp tính

Bệnh xảy ra khi động vật ăn vào một lượng khá lớn độc tố Tính gây độc cấp tính

thường được thể hiện qua liều gây chết LD50 Triệu chứng trúng độc không rõ ràng,

thường có biểu hiện thần kinh như nằm liệt, co giật; chết có thể xảy ra sau một thời

gian ngắn (thường dưới 72 giờ) Bệnh tích chủ yếu xảy ra trên gan (nhạt màu, hoại tử

nhu mô, tăng sinh ống dẫn mật…) Nhìn chung các loài gia cầm mẫn cảm hơn so với

gia súc Thứ tự mẫn cảm như sau:

Gia cầm: vịt > gà tây > ngỗng > ngan > gà

Gia súc: chó > heo > bò > ngựa > cừu

(Allcroft, 1962; trích dẫn Nguyễn Hữu Nam, 1997)

Bảng 2.3: Liều gây chết LD50 của aflatoxin B1 cho uống 1 lần duy nhất

Loài động vật (xếp theo thứ tự mẫn cảm)

LD50(mg/kg thể trọng)

Heo 0,6 Chó 1,0 Cừu 2,0 Khỉ 2,2

Gà 6,3 Chuột bạch 9,0

(Nguồn: Ciegler, 1975; trích dẫn bởi Dương Thanh Liêm, 2008)

Nhiễm độc mãn tính

Bệnh xảy ra do thú tiếp nhận một lượng thấp độc tố trong thời gian dài; thường

xảy ra hơn so với nhiễm độc cấp tính do thú không chỉ ăn duy nhất một loại thức ăn

Ức chế miễn dịch: Khi tiêu thụ lượng thấp độc tố sẽ làm cho thú giảm sức đề

kháng, suy giảm hệ miễn dịch do aflatoxin làm giảm tổng hợp protein, giảm khả năng

thực bào của tế bào đơn nhân ngoại vi (trích dẫn bởi Trần Bắc Vi, 2005) Trên gia

Bảng 2.4: Khả năng gây ung thư gan của aflatoxin B1 ở động vật thí nghiệm

Loài vật thí nghiệm Liều cho ăn

(ppb)

Thời gian nuôi dưỡng

(tháng)

Tần suất (%) Vịt con

2.4.2.2 Aflatoxicosis trên người

Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10 mg), độc tố aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan Người ta đã biết aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất tác động qua đường miệng – nếu hấp thu một tổng lượng 2,5 mg aflatoxin trong thời gian 89 ngày có thể dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau (Vũ Hướng Văn, 2009)

Aflatoxin ảnh hưởng rất nhiều đến miễn dịch trung gian tế bào (Pestka và Bondy, 1994; trích dẫn bởi Dương Thanh Liêm, 2008) Nó còn ảnh hưởng xấu lên những đứa trẻ bị bệnh suy dinh dưỡng protein và năng lượng (PEM – Protein Energy Malnutrition) ở các nước kém và đang phát triển (Dương Thanh Liêm, 2008)

2.5 Các phương pháp phát hiện và định lượng aflatoxin

2.5.1 Phương pháp sinh vật học

Phương pháp này dựa vào tác động sinh học của aflatoxin trên một số loài sinh vật (vịt con, gà con, chuột nhắt, chuột bạch, phôi gà, chó, khỉ, ấu trùng giáp xác ) Thông thường người ta dùng vịt con 1 ngày tuổi để phát hiện aflatoxin vì phương pháp này cho độ nhạy cao (0,1 ppm) và thời gian thí nghiệm tương đối ngắn (7 – 10 ngày) với các triệu chứng bệnh rõ rệt ở gan (Bùi Xuân Đồng, 2004)

Tuy nhiên hiện nay phương pháp sinh học ít được dùng do kém tính chuyên biệt

và mất nhiều thời gian; hơn nữa lại chỉ có thể định tính, không thể định lượng

2.5.2 Phương pháp lý hóa

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào tính tan hay không tan của aflatoxin trong một số dung môi hữu cơ thích hợp để chiết tách aflatoxin từ mẫu, sau đó xác định aflatoxin nhờ vào khả năng phát huỳnh quang của aflatoxin qua thực hiện kỹ thuật sắc ký (Lê Anh Phụng, 2002)

2.5.2.1 Sắc ký vi cột (minicolumn)

Phương pháp này gồm một cột thủy tinh có đường kính 5 – 6 mm, dài khoảng 20

cm được nhồi các chất hấp phụ độc tố như alumina, silicagel và florisil; calcium sulfat giữ nước ở hai đầu Cho mẫu được chiết bằng chloroform chảy qua cột nhờ trọng lực, lớp hấp phụ sẽ giữ aflatoxin lại và ta sẽ phát hiện được khi chiếu dưới ánh đèn UV (Lê Anh Phụng, 2002)

2.5.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC – Thin Layer Chromatography)

Là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất vì vừa có độ tin cậy tương đối cao, vừa không cần có trang thiết bị đắt tiền

Thực hiện với một bản mỏng kích thước 20 x 20 cm đã phết sẵn một lớp mỏng chất silicagel Nhỏ dịch chiết tinh sạch (đã được cô cạn trước khi pha loãng bằng chloroform, aceton, methanol) và dịch chuẩn với những lượng tương đương nhau (thường là 1, 2, 5, 10 µl) lên bản mỏng Sau đó triển khai bản mỏng trong bình tối chứa hỗn hợp dung môi (thường dùng chloroform và aceton) để tách rời các đơn chất Quan sát vị trí, cường độ ánh sáng của các đốm mẫu và các đốm chuẩn dưới ánh sáng đèn UV để xác định loại độc tố, hàm lượng độc tố (Lê Anh Phụng, 2002)

2.5.2.3 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC – High Pressure Liquid Chromatography)

Dùng một cột đã được nhồi sẵn các hạt chất hấp phụ rắn như silicagel, alumina, chất trao đổi ion… Dịch chiết được bơm vào cột dưới áp suất cao Các đơn chất được hấp phụ ở các mức độ khác nhau sẽ tạo ra sự phân tách vật lý giữa chúng, kết quả là thời gian tách ra khỏi cột (RT – Retention Time) của mỗi chất cũng khác nhau Các chất này sẽ được nhận biết nhờ một công cụ thích hợp (đầu dò) Căn cứ vào RT tương ứng của mẫu và chuẩn để xác định mẫu Dựa vào chiều cao đỉnh (peak) của mẫu trên

Một số phương pháp miễn dịch học được sử dụng trong những năm gần đây: miễn dịch phóng xạ (RIA – Radio Immuno Assay), hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Các kỹ thuật này có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp, phát hiện nhanh và các mẫu thử không cần phải làm sạch kỹ, nhưng kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi thao tác chính xác, nên chưa được dùng phổ biến

2.6 Giải pháp nhằm hạn chế tác hại của aflatoxin

2.6.1 Phòng nấm mốc xâm nhập và phát triển

Đây là công việc có ý nghĩa đặc biệt quan trọng, vì nếu nông sản không có sự xâm nhập của nấm mốc thì sẽ không có độc tố nấm mốc Để thực hiện được điều này, cần có sự phối hợp đồng bộ từ khâu trước thu hoạch, trong thu hoạch và sau thu hoạch

(1) Giai đoạn trước thu hoạch: chuẩn bị tốt đất trồng trọt, chọn giống cây trồng có

sức kháng bệnh cao, sử dụng hóa chất để bảo vệ cây trồng chống lại sự tấn công của nấm mốc, sâu rầy gây bệnh…

(2) Giai đoạn trong thu hoạch: tránh thu hoạch trong những điều kiện thời tiết bất

lợi cho cây trồng, cần tập trung thu hoạch nhanh và đưa về sấy khô nhanh để tránh sự phát triển của nấm mốc Giảm thiểu tối đa sự tồn đọng cây trồng trên đồng ruộng, hạn chế sự trầy xước, dập bể nông sản khi thu hoạch

(3) Giai đoạn sau thu hoạch: ngoài biện pháp vệ sinh đồng ruộng thì kỹ thuật bảo

quản nông sản sau thu hoạch như phơi, sấy khô, quạt sạch, bao gói kín, kho dự trữ sạch sẽ cũng là yếu tố góp phần quyết định chất lượng của nông sản (Dương Duy Đồng, 2006) Cần kiểm tra, đánh giá tình trạng nguyên liệu trước khi dự trữ Nơi dự trữ phải có cấu trúc hợp lý để duy trì môi trường khô, mát, ổn định Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt trong kho Định kỳ kiểm tra lại nông sản, xử lý thêm nếu cần (Dương Thanh Liêm, 2008)

2.6.2 Biện pháp loại trừ, vô hiệu hóa tính độc hại của aflatoxin

2.6.2.1 Phương pháp vật lý

- Loại bỏ những nguyên liệu nhiễm nấm mốc rõ ràng, sử dụng những phần không nhiễm nấm Để phân biệt nguyên liệu nhiễm, ta quan sát ở phần phôi của hạt như bắp nếu thấy có màu khác thường (vàng, đen, đỏ) thì loại bỏ

- Loại bỏ aflatoxin trong dầu nhờ hệ thống tinh lọc bằng cột hấp phụ than hoạt tính

- Xử lý nhiệt: hiệu quả thường kém vì aflatoxin bền với nhiệt

- Sử dụng tia sáng tử ngoại (UV): tác dụng không triệt để, chỉ xử lý lớp trên mặt; hơn nữa nếu chiếu lâu sẽ làm hư hại vitamin Phơi nắng là biện pháp rẻ tiền, được nông dân sử dụng phổ biến

2.6.2.2 Phương pháp hóa học

- Sử dụng tác nhân oxy hóa mạnh: có thể phá hủy được mạch nối C – C của cấu trúc mạch vòng làm cho mycotoxin trở nên ít độc hơn Khí Ozone: có làm giảm độc lực nhưng không đáng kể, phá hủy nhiều vitamin

- Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi NH3: áp suất ammoniac 2 bars, thời gian 1 giờ, phá hủy > 90% aflatoxin Nhược điểm: giá thành cao, hư hại acid amin chứa lưu huỳnh, làm cho thức ăn có mùi khai

- Sử dụng chất hấp phụ bề mặt để kết dính độc tố ngăn chặn không cho mycotoxin hấp thu vào cơ thể Chất được sử dụng phổ biến hiện nay trên thế giới là sodium calcium aluminosilicate (HSCAS) đưa vào khẩu phần ăn của động vật Ngoài

ra còn có chất hấp phụ là các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp (Dương Thanh Liêm, 2008)

Hiện nay trên thị trường Việt Nam có bán các sản phẩm là chất hấp phụ độc tố do các hãng nước ngoài cung cấp và phân phối như:

Mycofix của hãng Biomin, nước Áo sản xuất

Mycosorb của hãng Alltech, USA sản xuất

Novasil-p của Mỹ, do hãng Suchiang – Đài Loan phân phối

2.6.2.3 Phương pháp sinh học

Sử dụng các chủng vi sinh vật không có độc tính và có tính năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin hoặc hấp phụ aflatoxin Một số thử nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng

hợp aflatoxin của một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã được thực hiện đối với

A flavus và A parasiticus (R.Mann và ctv, 1977; N.Kimura, 1988) Theo Gegler

(1966), khả năng phá hủy aflatoxin của vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum là đầy

hứa hẹn (Bùi Xuân Đồng, 2003)

2.6.2.4 Biện pháp dinh dưỡng

- Chuyển đổi thức ăn: đưa loại thức ăn đã nhiễm độc tố cho các đối tượng thú ít nhạy cảm như bò thịt, heo thịt, dê thịt đã lớn

- Pha loãng thức ăn: giảm tỷ lệ sử dụng của các thức ăn có nhiễm aflatoxin (bằng cách trộn với thức ăn tốt theo tỷ lệ thích hợp) để cho hàm lượng độc tố bằng hoặc dưới mức cho phép của nhà nước

- Điều chỉnh khẩu phần ăn theo hướng giúp cơ thể giải độc, ví dụ như: tăng Cholin, Methionin, vitamin C (góp phần nâng cao sức chống chịu của cơ thể với độc tố)… trong khẩu phần ăn của thú

Bảng 2.5: Hàm lượng tối đa độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số trong thức ăn hỗn

hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm

Hàm lượng độc tố (μg/kg) Loài vật nuôi

Aflatoxin B1

Aflatoxin tổng số (B1 + B2 + G1 + G2)

2.7 Một số công trình nghiên cứu có liên quan

- Tại trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Lê Anh Phụng, Dương Thanh Liêm và Lê Văn Thọ (2002) đã tiến hành khảo sát mức độ hấp thu độc tố aflatoxin B1

ở những vịt được cắt bỏ manh tràng và đưa đến kết luận: vịt càng ăn nhiều aflatoxin thì lượng hấp thu qua niêm mạc tiêu hóa càng cao, ngược lại tỷ lệ hấp thu lại giảm đi khi mức độ độc tố tăng lên Ngoài ra, việc khảo sát vịt thí nghiệm được giết mổ lúc 8 tuần tuổi cho thấy việc cắt bỏ manh tràng không ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý bình thường của hệ thống tiêu hóa của vịt, tuy nhiên tác động của độc tố thấy rõ trên gan vịt

so với đối chứng

- Tống Vũ Thắng, Đặng Ngọc Hào (2005) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa ô

nhiễm nấm mốc, Escherichia coli, Salmonella, Clostridium perfringens trong thức ăn

hỗn hợp và tỷ lệ heo bị tiêu chảy trong mùa khô, mùa mưa tại 6 cơ sở chăn nuôi heo sinh sản ở Tp Hồ Chí Minh (http://www.vnast.gov.vn)

- Tại trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội, Phạm Văn Tự, Huỳnh Thị Mỹ Lệ

và Trương Quang (2006) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của aflatoxin B1 có trong thức ăn đến đáp ứng miễn dịch của gà công nghiệp đối với bệnh Newcastle và Gumboro Kết quả chứng tỏ: aflatoxin B1 có ảnh hưởng rõ rệt (làm giảm) đến khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể chống bệnh Newcastle và Gumboro

- Năm 2007, tại Viện Dinh dưỡng Quốc gia, Nguyễn Lan Phương và cộng sự đã

tiến hành khảo sát sự ô nhiễm nấm mốc A flavus và định lượng độc tố aflatoxin bằng

kỹ thuật ELISA trong một số thực phẩm tại Hà Nội (http://www.ykhoanet.com)

- Nguyễn Thùy Châu (Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch)

đã tiến hành nghiên cứu sản xuất một số chế phẩm vi sinh để phòng chống nấm mốc sinh độc tố và độc tố nấm mốc aflatoxin, ochratoxin A trên bắp, đậu phộng, cà phê Sau 2 năm thực hiện (2007 – đầu 2009), nghiên cứu đã thu được một số kết quả: tuyển

chọn được một số chủng A niger – vi nấm đối kháng có khả năng cạnh tranh cao với

A flavus sinh aflatoxin, bước đầu xác định nhanh các chủng sinh độc tố và không sinh

độc tố bằng kỹ thuật sinh học phân tử và đánh giá được mức độ nhiễm các loài

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

- Thời gian: từ tháng 03/2009 đến tháng 07/2009

- Địa điểm:

y Lấy mẫu: Tp Biên Hòa và huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai

y Phân tích mẫu: phòng thực hành vi sinh, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Đối tượng khảo sát

- Các mẫu bắp xay nhỏ dùng làm thức ăn cho gia súc được lấy ngẫu nhiên từ các đại lý và cửa hàng bán lẻ thức ăn gia súc (TAGS)

- Số lượng mẫu: 30 mẫu, khối lượng 0,5 kg/mẫu

3.2.3 Hóa chất

- Hóa chất dùng nuôi cấy và phân lập nấm mốc: saccharose, NaNO3, KH2PO4, KCl, MgSO4, FeSO4, ferric amamonium citrate, chloramphenicol, agar, dichloran

- Hóa chất dùng để định danh: xanh cotton

- Hóa chất dùng để phân tích aflatoxin: aceton, NaOH 0,2N, FeCl3, CuCO3,

H2SO4 25%, KOH 0,2N, tinh thể Na2SO4, aflatoxin chuẩn có nguồn gốc từ hãng Sigma Co (USA), benzen, acetonitril, chloroform

3.2.4 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường thạch khoai tây: dùng đếm tổng số khuẩn lạc nấm mốc

- Môi trường AFPA (Aspergillus Flavus and Parasiticus Agar): dùng đếm tổng

số khuẩn lạc nghi ngờ là A flavus/ parasiticus

- Môi trường Czapek: dùng nuôi cấy để định danh các chủng A flavus

- Môi trường CYA (Czapek Yeast extract Agar): nhân giống và giữ giống các

chủng A flavus

- Môi trường thạch nước cốt dừa: định tính khả năng sinh aflatoxin của các

chủng A flavus phân lập được

- Môi trường tấm gạo: định hàm lượng aflatoxin của các chủng đã xác định sơ

bộ là có khả năng phát huỳnh quang trên môi trường thạch nước cốt dừa

(Thành phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục)

3.3 Nội dung đề tài

- Đếm tổng số khuẩn lạc nấm mốc có trong 1 g mẫu bắp

- Đếm tổng số khuẩn lạc nghi ngờ là A flavus/ parasiticus trong 1 g mẫu bắp

- Định danh xác định các chủng phân lập được từ mẫu và khảo sát các đặc điểm hình thái (kích thước cuống, thể bọng, thể bình, bào tử)

- Định tính khả năng sinh aflatoxin của các chủng A flavus đã định danh

- Định lượng aflatoxin được sản xuất từ các chủng A flavus có khả năng sinh

Thông thường ít có sự phân bố đồng đều của độc tố do sự phát triển tùy chỗ của nấm mốc xâm nhiễm trên nông sản, nên mẫu cần được lấy ở nhiều vị trí khác nhau (thường là trên, giữa và dưới) của lô hàng để có thể đảm bảo tính đại diện cho lô hàng Mẫu được trộn đều, lấy 0,5 kg cho vào bao nylon sạch, ghi ký hiệu mẫu và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm

3.4.3 Chuẩn bị mẫu phân tích

Mỗi một mẫu đem về được chia thành 2 phần (một phần đem phân tích, một phần đem bảo quản lạnh phòng khi kiểm tra lại), mỗi phần 250g được làm như sau:

- Xay nhuyễn mẫu

- Trộn và dàn đều mẫu ra trên mặt khay rồi chia làm nhiều ô vuông nhỏ

- Lấy mẫu ở mỗi ô một ít cho đến khi đạt khối lượng 25g

- Đem chứa trong bao nylon sạch

- Dùng giấy dán ghi chú ký hiệu mẫu tránh nhầm lẫn

3.4.4 Pha loãng mẫu

25g mẫu + 225 ml nước muối sinh lý 0,9% chứa trong bình thủy tinh màu nâu đã được hấp tiệt trùng, cho lên máy lắc ngang trong 30 phút để thu được huyễn dịch 10-1 Dưới ngọn lửa đèn cồn, dùng micropipet hút lấy 1 ml huyễn dịch 10-1 cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước muối sinh lý 0,9% đã được hấp tiệt trùng, ta thu được huyễn dịch có nồng độ 10-2

Tiếp tục tiến hành như vậy ta thu được các huyễn dịch có nồng độ lần lượt

9 Công thức tính tổng số khuẩn lạc nấm mốc có trong 1 g mẫu ở mỗi nồng độ pha

loãng

X = A x (1/h) x (1/V)

X : tổng số khuẩn lạc nấm mốc có trong 1 g mẫu nguyên liệu

A : số khuẩn lạc trung bình có ở hai đĩa trong cùng một nồng độ pha loãng

h : hệ số pha loãng

V : thể tích mẫu cấy vào đĩa (0,1 ml)

9 Công thức tính số khuẩn lạc nấm mốc trung bình trong 1 g mẫu ở ba nồng độ pha

loãng

Y = (X1 + X2 + X3) / 3 Y: số khuẩn lạc nấm mốc trung bình trong 1 g mẫu nguyên liệu

X1, X2, X3: số khuẩn lạc trung bình có trong 1 g mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng

3.4.5.2 Đếm tổng số khuẩn lạc nghi ngờ A flavus/ parasiticus

Dưới ngọn lửa đèn cồn, dùng micropipet hút 100 µl (0,1 ml) huyễn dịch mẫu ở

mỗi nồng độ pha loãng cho vào đĩa môi trường chuyên biệt AFPA đã vô trùng, mỗi

nồng độ cấy được lặp lại trên hai đĩa Sau đó, dùng que thủy tinh trang đều huyễn dịch

trên mặt thạch và nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Thực hiện liên tục ở ba nồng độ pha

loãng thích hợp Sau 3 ngày, chỉ chọn đếm những khuẩn lạc nào có màu vàng cam ở

mặt dưới, mặt trên trắng mịn như nhung Dựa vào trung bình tổng số khuẩn lạc đếm

được trên hai đĩa của mỗi nồng độ, ta tính được tổng số khuẩn lạc nghi ngờ là

A flavus/ parasiticus có trong 1 g mẫu bắp và được tính tương tự như tính tổng số

khuẩn lạc nấm mốc

3.4.6 Phân lập và định danh A flavus

3.4.6.1 Phân lập khuẩn lạc nghi ngờ A flavus trên môi trường AFPA

Trên môi trường AFPA, ta dùng que cấy móc lấy một vài sợi nấm của khuẩn lạc

nghi ngờ là A flavus/ parasiticus đem cấy vào ống môi trường CYA đã tiệt trùng, nuôi

cấy ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày để nhân giống và giữ giống trước khi tiến hành định

danh