Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men đồ án tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHI£N CøU THU NHËN ENZYME CHITINASE Từ CHủNG NấM TRICHODERMA HAZIANUM TRÊN MÔI TRƯờNG RắN Và KHảO SáT KHả NĂNG CHUYểN HóA CHITIN TRONG QUá TRìNH LÊN MEN Giỏo viờn hng dn: ThS o Thị Thanh Xuân Sinh viên thực hiện: Lê Thị Phƣơng Lớp: 49K - Công nghệ thực phẩm Mã số sinh viên: 0852040456 NGHỆ AN - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lê Thị Phƣơng Số hiệu sinh viên: 0852040456 Khóa: 49 Ngành: Cơng Nghệ thực phẩm Tên đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum môi trường rắn khảo sát khả chuyển hóa chitin q trình lên men” Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Họ tên cán hƣớng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày tháng năm Ngày hoàn thành đồ án: Ngày tháng năm Ngày tháng năm 2012 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm 2012 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lê Thị Phƣơng Số hiệu sinh viên: Khóa: Ngành: Cơng nghệ thực phẩm 49 0852040456 Cán hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ……………………………… …………………………………… Ngày tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lê Thị Phƣơng Số hiệu sinh viên: Khóa: Ngành: Công nghệ thực phẩm 49 0852040456 Cán hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ……………………………… …………………………………… Ngày tháng năm 2012 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân LỜI CẢM ƠN Đồ án thực phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Hóa thực phẩm, Trường Đại học Vinh Để hoàn thành đồ án cố gắng thân nhận nhiều động viên, giúp đỡ nhiều cá nhân tập thể Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên Khoa Hóa học, trường Đại học Vinh tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô giáo, người đem lại cho kiến thức bổ trợ, vơ có ích năm học vừa qua Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Hóa thực phẩm, Phịng Hóa vô tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, người ln bên tơi, động viên khuyến khích tơi q trình thực đề tài nghiên cứu Vinh, tháng 12 năm 2012 Sinh viên Lê Thị Phƣơng SVTH: Lê Thị Phương i Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân TÓM TẮT ĐỒ ÁN Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum môi trường rắn khảo sát khả chuyển hóa chitin q trình lên men Nội dung nghiên cứu:  Nuôi cấy nấm Trichoderma hazianum sinh tổng hợp enzyme chitinase môi trường rắn  Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian, độ ẩm, nhiệt độ,tỷ lệ chất, pH tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum  Nghiên cứu q trình đồng thời chuyển hóa chitin lên men để tạo Glucosamin xúc tác enzym chitinase Đề tài đạt số kết sau: Thu nhận enzyme chitinase từ trình nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường rắn Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp chitinase mơi trường rắn thu enzym có hoạt tính cao tại: - Thời gian nuôi cấy: ngày - Độ ẩm: 55 % - Nhiệt độ: 300C - Tỷ lệ chất: 1,6 % tổng khối lượng môi trường - pH: Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến q trình đồng thời lên men chuyển hóa chitin enzyme chitinase tạo hàm lượng đường amin nhiều điều kiện: - Thời gian chiết: 24 - Hàm lượng chất bổ sung vào q trình trích ly: 3g/ml - Bổ sung chất lần, lần ¼ tổng lượng chất tối ưu SVTH: Lê Thị Phương ii Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ĐỒ ÁN ii DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG v MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục tiêu, yêu cầu ý nghĩa đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Chủng nấm sợi Trichoderma hazianum 1.1.1 Giới thiệu chủng 1.1.2 Nguồn dinh dưỡng chủng Trichoderma hazianum 1.2 Enzyme Chitinase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Cấu trúc hệ enzyme Chitinase 1.2.4 Các đặc tính enzym chitinase 1.2.5 Các loại chất enzym Chitinase 11 1.2.6 Cơ chế tác dụng 13 1.2.7 Cơ chế cảm ứng 15 1.2.8 Nguồn thu nhận Chitinase 16 1.2.9 Ứng dụng chitinase 17 1.2.10 Tình hình nghiên cứu thu nhận chitinase từ Trichoderma 20 1.3 Glucosamin 22 1.3.1 Cấu trúc hóa học tinh chất hóa lý glucosamin 22 1.3.2 Tác dụng glucosamin 22 1.3.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất glucosamin giới Việt Nam 23 CHƢƠNG VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Vật liệu hóa chất, mơi trường 26 2.1.1 Vật liệu 26 2.1.2 Thiết bị hóa chất 26 SVTH: Lê Thị Phương iii Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 2.1.3 Các môi trường 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase 28 2.2.2 Phương pháp xác định đường amin theo Elson-Morgan 29 2.2.3 Phương pháp điều chế chitin từ vỏ tơm phương pháp hóa học 30 2.2.4 Phương pháp thu nhận enzym chitinase môi trường rắn 32 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đên sinh tổng hợp enzyme chitinase 33 2.2.6 Phương pháp nghiên cứu nâng cao hiệu suất thủy phân tạo đường amin chitinase 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Nghiên cứu trình sinh tổng hợp enzym từ chủng Trichodermar môi trường rắn 38 3.1.1 Nghiên cứu Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase mơi trường rắn 39 3.1.2 Nghiên cứu Ảnh hưởng độ ẩm đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase môi trường rắn 40 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng chất đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase môi trường rắn 42 3.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase môi trường rắn 43 3.2 Quá trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin 45 3.2.1 Nghiên cứu thời gian q trình đồng thời lên men chuyển hóa chitin 45 3.2.2 Nghiên cứu hàm lượng chất tối ưu cho trình đồng thời chiết enzym thủy phân chitin 46 3.2.3 Nghiên cứu cách bổ sung chất cho trình đồng thời chiết enzym thủy phân chitin 47 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 SVTH: Lê Thị Phương iv Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG Trang Hình: Hình 1.1 Bào tử thể nấm Trichoderma hazianum Hình 1.2 Bào tử nấm Trichoderma hazianum Hình 1.3 Vị trí thủy giải phân tử chitin enzyme chitinase Hình 1.4 Sơ đồ phân cắt chitin enzyme thuộc nhóm chitinase Hình 1.5 Mơ hình cấu trúc Khơng gian enzyme chitinase Serratia marcescens Hình 1.6 Mơ hình cấu trúc khơng gian chitinase Hodeum Vulgale Hình 1.7 Cấu trúc hóa học Allosamidin dẫn xuất Allosamidin 11 Hình 1.8 Cấu trúc hóa học chitin 12 Hình 1.9 Các dạng lập thể chitin 13 Hình 1.10 Cơ chế thủy giải trung tâm hoạt hóa enzyme chitinase 14 Hình 1.11 Các vị trí kết nối chất chitin enzyme chitinase trung tâm hoạt hóa 14 Hình 1.12 Cơng thúc cấu tạo glucosamin 22 Hình 2.1 Trichoderma phát triển môi trường PGA 26 Hình 2.2 Chitin 31 Hình 2.3 Chitin huyền phù 1% 32 Hình 3.1 Đường chuẩn Glucosamin nồng độ 300 ÷500 (µg/ml) 38 Hình 3.2 So sánh lên men môi trường rắn môi trường lỏng 38 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian ni cấy tới q trình sinh tổng hợp enzym chitinase 39 Hình 3.5 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase 41 Hình 3.6 Ảnh hưởng nguồn chất tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase 43 Hình 3.7 Ảnh hưởng yếu tố pH tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase 44 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian tới trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin 46 SVTH: Lê Thị Phương v Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9 GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Ảnh hưởng hàm lượng chất tới trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin 47 Hình 3.10 Ảnh hưởng cách bổ sung chất tới q trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin 48 Bảng: Bảng 2.1 Cách pha nồng độ glucosamin 300 - 500µg/ml 30 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt độ enzym chitinase 39 Bảng 3.2 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường tới hoạt độ enzym chitinase 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ chất tới hoạt độ enzym chitinase 42 Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH nuôi cấy tới hoạt độ enzym chitinase 44 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian tới trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin 45 Bảng 3.7 Ảnh hưởng hàm lượng chất tới trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin 47 Bảng 3.8 Ảnh hưởng cách bổ sung chất tới q trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin 48 SVTH: Lê Thị Phương vi Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu trình sinh tổng hợp enzym từ chủng Trichodermar môi trƣờng rắn Môi trường rắn lựa chọn bao gồm: khoáng + 2,5g cám gạo + 10g trấu + 12,5ml chitin huyền phù 5%, hấp khử trùng 1210C, 20 phút Tiếp giống từ môi trường M2(hút 5ml) vào môi trường rắn tuyển chọn Chủng T.Harzianum 095 TH nuôi nhiệt độ= 300C, sau ngày tiến hành thu dịch enzym đo xác định hoạt hoạt độ (kết hiển thị hình 3.2) Hoạt độ chitinase xác định cơng thức: Trong a hàm lượng N- acetyl- glucosamin hàm lượng đường amin định lượng dựa vào đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng sau: 0.7 y = 0.0011x + 0.122 R2 = 0.9992 Mật dộ quang (OD) 0.6 0.5 0.4 OD 0.3 Linear (OD) 0.2 0.1 0 100 200 300 400 500 600 Nồng độ glucos am in (m icrogam /m l) Hình 3.1 Đường chuẩn Glucosamin nng 300 ữ500 (àg/ml) Hot ca chitinase( IU/ml) Hoạt độ enzym ngày nuôi cấy thứ 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 MT rắn MT lỏng Mơi trường lên men Hình 3.2 So sánh lên men môi trường rắn môi trường lỏng SVTH: Lê Thị Phương 38 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Dựa vào hình 3.2 ta thấy hoạt độ enzym chitinase thu môi trường rắn cao hẳn so với môi trường lỏng Khả sinh tổng hợp chitinase từ vi sinh vật phụ thuộc thành phần dinh dưỡng mơi trường mà cịn chịu ảnh hưởng yếu tố ngoại cảnh khác nhiệt độ, pH, độ ẩm nghiên cứu tiến hành nhằm nghiên cứu số yếu tố tác động tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase 3.1.1 Nghiên cứu Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase mơi trƣờng rắn Thời gian dài lượng enzym tạo thành nhiều, nhiên điều xảy giới hạn định, lượng chất chitin hết khả sinh trưởng phát triển T.Harzianum giảm Tiến hành nghiên cứu thời gian nuôi cấy chủng T.Harzianum 095 TH môi trường rắn tuyển chọn M3 vòng 3,4,5,6,7 ngày Sau đủ số ngày nuôi cấy khảo sát trên, ta tiến hành chiết 50ml đêm acetat 4.5 1h Sau lọc dịch đưa xác định hoạt độ enzym Sau thu dịch enzym đo máy UV cho kết tính tốn sau: Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy tới hoạt độ enzym chitinase Mật độ quang OD 0.3325 0.6973 1.023 0.8981 0.5679 Hoạt độ chitinase (µmol /g/phút) 0.111 0.303 0.476 0.409 0.177 Hoạt độ chitinase (µmol /g/phút) Thời gian ni cấy (ngày) 0.476 0.5 0.45 0.4 0.409 0.35 0.3 0.303 0.25 0.2 0.15 0.177 0.111 0.1 0.05 Ngày nuôi cấy (ngày) Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian ni cấy tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase SVTH: Lê Thị Phương 39 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Dựa vào hình 3.3 ta nhận thấy rõ ràng chủng Trichoderma Harzianum 095 TH nuôi cấy môi trường rắn thu enzym chitinnase có hoạt lực cao ngày thứ 5(0.476 µmol /g/phút) nghiên cứu chủng tiến hành nuôi môi trường rắn M3 đến ngày thứ đo hoạt tính 3.1.2 Nghiên cứu Ảnh hƣởng độ ẩm đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase mơi trƣờng rắn Độ ẩm yếu tố cần thiết cho hoạt động vi sinh vật trình phát triển Độ ẩm ảnh hưởng đến sinh trưởng trao đổi chất vi sinh vật trình lên men rắn Ngồi độ ẩm cịn ảnh hưởng tới khuyếch tán O2 làm ảnh hưởng tới hoạt lực enzyme Để xác đinh độ ẩm, dịch nhân giống nuôi môi trường rắn tuyển chọn M3 Thao tác tiến hành mục 2.2.4 Sau thời gian= ngày nuôi cấy thu kết sau: Bảng 3.2 Ảnh hƣởng độ ẩm môi trƣờng tới hoạt độ enzym chitinase 50% 55% 60% 65% Mật độ quang OD 0.875 1.138 0.947 0.5973 Hoạt độ chitinase (µmol/g/phút) 0.398 0.537 0.436 0.251 Hoạt độ chitinase(µmol/g/phút) Độ ẩm (%) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 50% 55% 60% 65% Độ ẩm mơi trường (%) Hình 3.4 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase SVTH: Lê Thị Phương 40 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Trên hình 3.4: Cho thấy độ ẩm có ảnh hưởng khơng nhỏ tới trình sinh trưởng phát triển nấm Trichodermar Ở độ ẩm môi trường 55% độ ẩm thích hợp cho q trình sinh tổng hợp enzym chủng 095(2)TH nghiên cứu Nó cho hoạt tính cao nhiều so với khoảng độ ẩm khác, hoạt độ chitnase đạt 0.537 (µmol /g/phút) Hoạt độ thu từ chủng cao tương đương với chủng Trichoderma có hoạt tính chitinase cơng bố giới 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase mơi trƣờng rắn Mỗi lồi vi sinh vật sinh trưởng phát triển khoảng nhiệt độ định Nhiệt độ môi trường nuôi cấy thấp cao ảnh hưởng tới phát triển vi sinh vật ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp enzym chúng Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, ta thay đổi nhiệt độ môi trường nuôi cấy khoảng từ 250C đến 450C Tiến hành nuôi chủng T.Harzianum 095 TH môi trường rắn tuyển chọn M3 Sau ngày, trải qua giai đoạn sinh trưởng phát triển, tiến hành chiết 50ml đệm acetat 4,5 lọc đem xác định hoạt độ enzym Các mẫu nuôi cấy cho kết sau: Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ Nhiệt độ (0C) 25 30 35 40 45 Mật độ quang OD 0.7869 1.4887 0.9928 0.5679 0.4672 Hoạt độ chitinase (µmol /g/phút) 0.351 0.236 0.183 0.723 0.461 Hoạt độ chitinase(µmol/g/phút) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 25 30 35 40 45 Nhiệt độ Hình 3.5 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase SVTH: Lê Thị Phương 41 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Trên hình 3.5 Cho thấy nhiệt độ có tác động lớn tới trình sinh trưởng phát triển nấm Trichodermar Harzianum 095(2)TH Ở 300C nhiệt độ thích hợp cho q trình sinh tổng hợp enzym chủng nghiên cứu Nó cho hoạt tính cao nhiều so với khoảng nhiệt độ khác nhiệt độ hoạt độ chitnase 0.723(µmol /g/phút) Hoạt độ thu từ chủng cao tương đương với chủng Trichodermar Harzianum có hoạt tính chitinase cao công bố giới [10] Ta lấy nhiệt độ để khảo sát ảnh hưởng 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất đến q trình sinh tổng hợp enzyme chitinase mơi trƣờng rắn Cơ chất chitin chất cảm ứng trình sinh tổng hợp đồng thời nguồn dinh dưỡng cho sinh trưởng phát triển nấm mốc Nồng độ chất ảnh hưởng tới khả thẩm thấu màng tế bào vi sinh vật, mà ảnh hưởng tới q trình sinh trưởng trình sinh tổng hợp chitinase Để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chitin tới trình sinh tổng hợp chitinase, tiến hành nuôi cấy chủng môi trường rắn M3 thời gian= ngày, nhiệt độ= 300C Nghiên cứu thực với chủng Trichodermar 095(2)_ TH, có chất chitin điều chế từ vỏ tôm Nồng độ chitin thay đổi 0.97%, 1.6%, 2.3%, 3.2% so với tổng khối lượng môi trường rắn đưa vào Sau trích ly đo, xác định hoạt độ enzym chitinase tạo thành Kết thu sau: Bảng 3.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ chất tới hoạt độ enzym chitinase Cơ chất/ môi trường (%) 0.97% 1.6% 2.3% 3.2% Mật độ quang OD 0.9930 1.553 0.7272 0.3017 Hoạt độ chitinase (µmol /g/phút) 0.495 0.757 0.320 0.095 SVTH: Lê Thị Phương 42 Lớp 49K - CN thực phẩm Hoạt độ chitinase(µmol/g/phút) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.97% 1.60% 2.30% 3.20% % chất chitin/ tổng khối lượng mơi trường Hình 3.6 Ảnh hưởng nguồn chất tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase Qua kết ta khẳng định nguồn chất có tác động khơng nhỏ tới khả sinh trưởng phát triển chủng nấm Trichoderma Nếu q lượng enzym tạo không nhiều, lượng chất mà nhiều so với khả tiêu thụ chủng nấm hoạt độ enzym khơng khơng cao mà bị giảm Do lúc lượng enzym tạo thành quay lại sử dụng nguồn chất cịn dư mơi trường thời gian dài Và nồng độ chitin 5% tương ứng với 1.6% (lượng chitin/ tổng khối lượng môi trường rắn tuyển chọn), tỷ lệ tối ưu hoạt độ enzym đo lớn 0.757 (µmol /g/phút) 3.1.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến q trình sinh tổng hợp enzyme chitinase mơi trƣờng rắn Theo [Jolles.P, Muzzaralli.A.R (1999)] Giá trị pH tối ưu enzyme chitinase thường giao động khoảng từ - chitinase thực vật bậc cao tảo động vật 4,8-7,5 vi sinh vật 3,5-8,0 pH tối thích enzyme chitinase phụ thuộc vào chất sử dụng Tùy mục đích phân tích, chất hịa tan glycol chitin N- acetyl chitooligosacharid sử dụng thay cho chitin pH tối ưu nằm khoảng giá trị pH kiềm yếu Để nghiên cứu ảnh hưởng pH mơi trường chủng nấm sau trải qua giai đoạn sinh trưởng phát triển môi trường M3 Với tất điều kiện tối ưu nghiên cứu trên: nồng độ chitin 1.6% nhiệt độ nuôi cấy 300C, sau ngày nuôi cấy Tiến hành nuôi điều kiện pH khác từ 4-8 Sau thu dịch enzym xác định hoạt độ enzym mẫu nuôi cấy cho kết quả: SVTH: Lê Thị Phương 43 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Bảng 3.5 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy tới hoạt độ enzym chitinase Mật độ quang OD 1.1581 1.6993 1.0038 0.5923 0.2419 Hoạt độ chitinase (µmol /g/phút) 0.548 0.834 0.466 0.248 0.063 Hoạt độ chitinase (µmol/g/phút) pH 0.9 0.834 0.8 0.7 0.6 0.548 0.466 0.5 0.4 0.248 0.3 0.2 0.063 0.1 pH Hình 3.7 Ảnh hưởng yếu tố pH tới trình sinh tổng hợp enzym chitinase Qua bảng kết ta thấy hoạt độ enzyme chitinase cao giá trị pH 0.834 (µmol /g/phút) pH mơi trường cao hay thấp bị ức chế pH thấp hay cao làm cho chủng Trichodermar sinh tổng hợp enzyme chitinase có hoạt độ Từ tất kết nghiên cứu ta khẳng định nuôi cấy sinh tổng hợp chủng nấm Trichodermar mơi trường bán rắn thu enzym có hoạt lực cao hẳn (gấp lần)với môi trường lỏng Đây coi tiền đề tốt cho trình sinh tổng hợp, thu nhận enzym để ứng dụng vào lĩnh vự khác nhau, cụ thể để sản xuất glucosamin Việc sản xuất glucosamin thực nhiều phương pháp khác nhau, sản xuất theo đường sinh học ln đem lại lợi ích to lớn Vì nghiên cứu tập trung vào nâng cao hiệu suất thủy phân chất xúc tác enzym tương ứng SVTH: Lê Thị Phương 44 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xn 3.2 Q trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin Với môi trường nuôi cấy bề mặt, để thu enzym phải sử dụng đệm chiết enzym khỏi mơi trường rắn sau sử dụng enzym thu dịch chiết để thủy phân chất với phương pháp hàm lượng N-acetyl- glucosamin cao đạt 1,2g/l Tuy nhiên trình sinh tổng hợp enzym tiếp tục xảy bổ sung chất, chúng tơi tiến hành q trình lên men đồng thời với chuyển hóa chitin, nhằm tích lũy sản phẩm glucosamin cao Để tiến hành nghiên cứu: chủng nấm Trichodermar 095 TH ni bình tam giác 500ml chứa mơi trường rắn tuyển chọn M3, sau ngày ta bổ sung 50ml đệm chiết acetat 4,5 với lượng chất định Do bổ sung chất vào nên lúc bình tam giác 500ml xảy đồng thời trình: - Quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase tiếp tục diễn - Enzym chitinase liên tục chiết vào đệm - Diễn trình thủy phân chitin thành đường amin Để trình diễn hiệu quả, thu hồi hàm lượng N-acetyl- glucosamin nhiều tiến hành khảo sát yếu tố: thời gian trình đồng thời lên men chuyển hóa chitin, lượng chất bổ sung vào cách bổ sung cho hợp lý 3.2.1 Nghiên cứu thời gian trình đồng thời lên men chuyển hóa chitin Sau ngày ni cấy môi trường rắn tuyển chọn M3, tiến hành khảo sát thời gian trích li enzym chitinase đồng thời chuyển hóa chitin thành glucosamin thời điểm: giờ, giờ, 24 giờ, 29 giờ, 48 Sau tiến hành lọc dịch đưa xác định hàm lượng đường amin Kết sau: Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian tới trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin Thời gian (h) 24 29 48 Mật độ quang OD 1.2038 1.9978 3.9767 3.7829 3.6977 Hàm lượng glucosamin (g /l) 0.9835 1.7053 3.5043 3.3281 3.2506 SVTH: Lê Thị Phương 45 Lớp 49K - CN thực phẩm Hàm lượng glucosamin (μg /ml) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 1h 5h 24 h 29 h 48 h Thời gian ( giờ) Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian tới trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin Nhìn vào hình vẽ ta thấy, thời gian trích ly kéo dài hàm lượng đường amin dịch trích ly mơi trường lên men tăng Nhưng tới lúc khả tạo đường amin khơng cịn tích lũy dừng lại việc để thời gian q trình trích ly q dài, khơng khơng nâng cao hàm lượng đường mà gây tốn tiền thời gian Như thời gian trích ly 24 thời gian tối ưu cho trích ly kết hợp với chuyển hóa chitin thành đường amino hòa tan 3.2.2 Nghiên cứu hàm lƣợng chất tối ƣu cho trình đồng thời chiết enzym thủy phân chitin Để đạt tỷ lệ chuyển hóa chitin thành đường amin cao, sử dụng phương pháp thêm chất cho trình đồng thời lên men chuyển hóa chitin Sau ngày ni cấy môi trường rắn tuyển chọn M3 tiến hành khảo sát nồng độ chitin khác trình đồng thời chiết enzym thủy phân chitin diễn tốt Tiến hành thí nghiệm bổ sung chất chitin với lượng bổ sung dải: 2,5g/ml, 3g/ml, 4,5g/ml, 6,75g/ml Sau tiến hành lọc dịch đưa xác định hàm lượng đường amin Kết sau: SVTH: Lê Thị Phương 46 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Bảng 3.7 Ảnh hƣởng hàm lƣợng chất tới q trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin Hàm lượng chất (g/ml) 4.5 6.75 Mật độ quang OD 3.8775 5.0021 3.0123 2.6397 Hàm lượng glucosamin (g /l) 3.4141 4.4365 2.6275 2.341 Hàm lượng glucosamin (μg /ml) 2.5 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 2.5 g/ml g/ml 4.5 g/ml 675 g/ml Hàm lượng chất ( g/ml) Hình 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng chất tới trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin Kết khảo sát thí nghiệm cho thấy: hàm lượng glucosamin trích li thời điểm 24 nồng độ chất bổ sung g/ml đạt cao (4.4365g /l) chứng tỏ sau nuôi môi trường rắn tuyển chọn tiến hành chiết bổ sung lượng chất g/ml vào thúc đẩy q trình chuyển hóa chitin cách nhanh chóng tạo hàm lượng glucosamin nhiều sau 24 chiết Việc tăng hàm lượng chất vào môi trường tới mức 4.5g/ml khơng làm tăng chuyển hóa đường, mà ngược lại hàm lượng đường amin đạt 2.6275 (g /l) nguyên nhân tượng chất bổ sung vào môi trường nhiều gây ức chế hoạt động enzym chitinase 3.2.3 Nghiên cứu cách bổ sung chất cho trình đồng thời chiết enzym thủy phân chitin Sau ngày nuôi cấy môi trường rắn tuyển chọn M3 thêm 50ml đêm acetat 4.5 + 3g/ml chất thực trình chiết Nhưng cách bỏ khác SVTH: Lê Thị Phương 47 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Với lượng chất thêm vào trình chiết g/l bổ sung theo cách, tiến hành thí nghiệm đồng thời: Một mẫu thí nghiệm bổ sung chất lần Mẫu cịn lại mẫu bổ sung lần, lần thêm vào với lượng = 1/4 thời điểm giờ giờ Kết thúc 24 trích ly lọc, thu dịch thủy phân Sau tiến hành lọc hút 1ml hỗn hợp đem thực phản ứng thủy phân Xác định hàm lượng đường amin theo Elson-Morgan Kết cụ thể sau: Bảng 3.8 Ảnh hƣởng cách bổ sung chất tới q trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin Số lần bổ sung lượng 3g/ml Mật độ quang OD 4.8997 6.693 Hàm lượng glucosamin (g /l) 4.3434 5.9736 Hàm lượng glucosamin (μg /ml) 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 lần lần Số lần thêm Hình 3.10 Ảnh hưởng cách bổ sung chất tới trình lên men chuyển hóa đồng thời chitin Kết hình cho thấy việc bổ sung lượng chất nhau, phương pháp bỏ khác hàm lượng đường amin tạo không giống Kết sau lần bổ sung tăng 1,5 lần so với việc bổ sung lần chất SVTH: Lê Thị Phương 48 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân KẾT LUẬN Đề tài đạt số kết sau: Thu nhận enzyme chitinase từ q trình ni cấy nấm Trichoderma harzianum mơi trường rắn Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chitinase mơi trường rắn thu enzym có hoạt tính cao tại: - Độ ẩm: 55 % - Tỷ lệ chất: 1,6 % tổng khối lượng môi trường - Thời gian nuôi cấy: ngày - Nhiệt độ: 300C - pH: Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình đồng thời lên men chuyển hóa chitin enzyme chitinase tạo hàm lượng đường amin nhiều điều kiện: - Thời gian chiết: 24 - Hàm lượng chất bổ sung vào q trình trích ly: 3g/ml - Bổ sung chất lần, lần ¼ tổng lượng chất tối ưu SVTH: Lê Thị Phương 49 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Bùi Xuân Đồng - Nguyễn Huy Văn (2000), Vi Nấm dùng công nghệ sinh học NXB KH & KT Hà Nội Phạm Minh Hiếu (2005), Khảo sát trình cảm ứng tổng hợp hệ enzyme chitinase chủng nấm mốc Trichoderma harzianum, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh Học, Trường Đại Học KHTN TP HCM Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo số cộng “Hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua” Báo cáo khoa học, Đề tài cấp Nha Trang.2000 Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền cộng “Vật liệu sinh học từ chitin” Viện hóa học - Viện cơng nghệ sinh học, Trung tâm khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia Hà Nội.1997 Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết (2004), Công Nghệ enzyme NXB ĐHQG TP.HCM Tô Duy Khương (2007), Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật, Luận Văn Thạc Sĩ ngành sinh học, Đại Học KHTN TP.HCM Lê Quốc Phong (2000), Khảo sát đặc tính enzyme chitinase chiết tách từ nấm mốc Trichoderma harzianum, Khóa luận cử nhân sinh học, Trường Đại học KHTN TP.HCM Lê Ngọc Tú, La văn Trứ, Phạm Chân Châu (1982), Enzyme vi sinh vật (Tập 1, 2) NXB KH & KT Hà Nội Đỗ Đình Rãng, Phạm Đình Cường, “Xác định hàm lượng chitin số loài thủy sản Việt Nam chuyển hóa thành glucosamin” Tạp chí khoa học, N0 4, tr 66- 71, 1990 10 Nguyễn La Anh, Quách Thị Việt (2011), “Nghiên cứu đồng thời chuyển hóa lên men đồng thời tạo glucosamin từ chitosan hiệu suất cao” Tạp chí khoa học cơng nghệ pp 190- 197 11 Lưu Vǎn Chính, Châu Vǎn Minh, Phạm Hữu Điển, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận “Tổng hợp nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu N,N,Ntrimethyl chitosan (TMC)” Tạp chí Dược học số 9, mục 5, năm 2000 SVTH: Lê Thị Phương 50 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 12 Ts Nguyễn Vĩnh Ngọc “Thuốc điều trị thối hóa khớp” Khoa xương khớp Bệnh Viện Bạch Mai Hà Nội Tạp chí Sức khỏe & đời sống ngày 30/5/2006, số 964 13 BS.Huỳnh Bá Lĩnh “Glucosamine, thuốc điều trị bệnh viêm khớp”.Bệnh Viện Việt Đức Hà Nội Tài liệu truy cập mạng internet, theo địa chỉ: vietduchospital.edu.vn 14 Nguyễn Trường Thọ (2004), Nghiên cứu sử dụng nấm mốc Trichoderma Harzianum phòng bệnh héo rũ dưa leo Pythium sp, Luận văn Thạc Sĩ ngành Sinh học, Đại Học KHTN TP.HCM 15 Nguyễn Thị Ngọc Tú, Nguyễn Thị hương Giang (1997), Bảo vệ trồng chế phẩm từ vi nấm NXB Nông Nghiệp 16 Ts Nguyễn Vĩnh Ngọc “Thuốc điều trị thối hóa khớp” Khoa xương khớp Bệnh Viện Bạch Mai Hà Nội Tạp chí Sức khỏe & đời sống ngày 30/5/2006, số 964 17 Lưu Vǎn Chính, Châu Vǎn Minh, Phạm Hữu Điển, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận “Tổng hợp nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu N,N,Ntrimethyl chitosan (TMC)” Tạp chí Dược học số 9, mục 5, năm 2000 18 Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Ty “Nghiên cứu tác dụng tăng sinh collagen chitosan điều trị bỏng nhiệt thực nghiệm” Tạp chí Dược học số 9, mục 9, năm 2000 Tài liệu tiếng Anh: 19 Good T.A and Beesman S.P (1964)- Determination of glucosamin and galatosamin using borate buffers of the Elson - Morgan and Morgan Elson reaction, pp 253-262 20 Inbar J, Chet.I (1992), Biomimics of fungal cell-cell recognition by use of lectin coated nilon fibers, J bacterial 1992 Feb 174(3), pp 1055-1059 21 Jeuniaux C, Braconnot H (1971), Structure of chitin and chitosan Ann Chitin, Paris, pp - 49 - 1811 22 Jeuniaux Charles (1963), Chitinase- Methods of enzymology, Vol 4, pp 644 - 650 SVTH: Lê Thị Phương 51 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 23 Hutchinson, S A, and M E Cowan (1972) Identification and biological effects of volatile metabolites from cultures of Trichoderma harzianum Trans Br Mycol Soc 59, 71-77 24 Jolles.P, Muzzaralli A R (1999), Chitin and Chitinase Birkhauser verlag, Basel, Switzerland, pp 125 - 133 25 Patil R.S, Ghormade V (2000), Chitinolytic enzymes: an exploration Enzyme and Microbial Technogy 26 (2000) pp 473-483 26 Harman E G, Kubicek.P.Christian (1998), Trichoderma & Gliocladium Vol 2.pp 73 - 123 27 Fridlender.M, Inbar.J, Chet.I (1993) Biological control of soilborne plant pathogens by a b-1,3 glucanase producing pseudomones cepacia Soil Biol Biochem, 1211-1221 28 Gray.W.P(1997), Chitinase - material and method Patent WO 97/47752 29 Hirano.S, Inui H, Kosaki H (1994), Biotechnology ND Bioactive polymers, Vol2,pp 34-35 30 http://www.mrc lmb.cam.ac.uk/genomes/date/lctn.html 31 http://www.reserach.cm.utexas.edu/…/chitin/structure.html 32 http://www.ocean.udel.edu/…/Research/chitin.html 33 http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html#buffer 34 http://www.spices.res.in/spicebioinfo/project/chitinase/result.php 35 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme- explorer/learning-center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html 36 http://www.scribd.com/doc/58156023/Enzyme-Chitinase SVTH: Lê Thị Phương 52 Lớp 49K - CN thực phẩm ... Tên đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum môi trường rắn khảo sát khả chuyển hóa chitin trình lên men? ?? Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: ……………………………………………………………………………………... Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum môi trường rắn khảo sát khả chuyển hóa chitin trình lên men Nội dung nghiên cứu:  Nuôi cấy nấm Trichoderma hazianum sinh... 2.1 Mục tiêu Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum môi trường rắn khảo sát khả chuyển hóa chitin q trình lên men 2.2 u cầu  Ni cấy nấm Trichoderma hazianum sinh