Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ trichoderma reesei trên môi trường rắn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === N TT NGHIP Đề tài: Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từTrichoderma reesei môi tr-ờng rắn GV h-ớng dẫn : ThS đào thị xuân SV thực : Lê thị Duyên Lớp : 49K - Công nghÖ thùc phÈm M· sè SV : 0852040429 VINH - 12/2012 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên Khóa MSV Ngành : : : : Lê Thị Duyên 49K - Hóa Thực Phẩm 0852040429 Công nghệ thực phẩm 1.Tên đề tài : Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Trichoderma reesei môi trƣờng rắn Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: Cán hƣớng dẫn : Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày hoàn thành đồ án : ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày tháng năm 2012 Ngày tháng năm 2012 Ngày Chủ nhiệm môn (Ký ghi rõ họ tên) tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày tháng năm 2012 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XẾT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Lê Thị Duyên Khóa : 49K - Hóa Thực Phẩm MSV : 852040429 Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt : Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nhận xét cán hƣớng dẫn: Ngày tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XẾT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Lê Thị Duyên Khóa : 49K - Hóa Thực Phẩm MSV : 0852040429 Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt : Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nhận xét cán duyệt: Ngày tháng năm 2012 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Lời cảm ơn Em xin chân thành cảm ơn ThS Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên khoa Hóa học, trƣờng đại học Vinh tận tình hƣớng dẫn em suốt trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy cơ, cán hƣớng dẫn thí nghiệm Phịng hóa thực phẩm, Phịng hóa hữu cơ, Trung tâm vệ sinh an toàn thực phẩm Trƣờng Đại học Vinh tạo điều kiện tận tình giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới bạn phịng thí nghiệm thực phẩm, bạn lớp gia đình tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đồ án SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân TÓM TẮT ĐỒ ÁN Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Trichoderma reesei môi trƣờng lên men rắn Nội dung nghiên cứu:  Tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao để tiến hành nghiên cứu  Nghiên cứu thời gian nuôi cấy nấm Trichoderma reesei cho hoạt tính enzyme cellulase cao - Nghiên cứu đƣợc số yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp cellulase từ nấm Trichoderma reesei Vn1072  Nghiên cứu tinh enzyme cellulase từ muối trung tính (NH4)2SO4 - Nghiên cứu đặc tính cellulase chủng Trichoderma reesei Vn1072 Kết thu đƣợc:  Đã tuyển chọn đƣợc chủng Trichoderma cho hoạt tính cellulase cao là: 020NC, Vn1072, 069QX 007NĐ Tôi sử dụng chủng Trichoderma reesei Vn1072 để thực nghiên cứu  Nghiên cứu thời gian nuôi cấy nấm Trichoderma reesei cho hoạt tính enzyme cellulase cao Thời điểm sau ngày ni cấy enzyme cellulase chiết tách từ chủng nấm Trichoderma reesei Vn1072 cho hoạt tính cao  Dung môi lựa chọn để tinh enzyme cellulase chiết tách từ chủng Trichoderma reesei vn1072 amoni sulfat bão hịa 65%  Nghiên cứu đặc tính enzyme cellulase chiết tách từ chủng Trichoderma reesei:  Nhiệt độ tối ƣu: 30oC  pH tối ƣu: SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài 2 Nhiệm vụ nghiên cứu .2 Vật liệu, phạm vi nội dung nghiên cứu 3.1 Vật liệu .2 3.2 Phạm vi nghiên cứu .2 3.3 Nội dung nghiên cứu 3.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Nấm Trichoderma reesei 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái .4 1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.2 Hệ enzyme cellulase 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo : 1.2.2 Phân loại enzyme cellulase : 1.2.3 Tính chất lý hóa enzyme cellulase 1.3 Cơ chất hệ enzyme cellulase .10 1.3.1 Cellulose 10 1.3.1.1 Khái niệm cấu trúc 10 1.3.1.2 Thành phần sinh khối thực vật 11 1.3.2 Carboxymethyl cellulose (CMC) 12 1.4 Hệ enzyme cellulase Trichoderma reesei 13 1.5 Dinh dƣỡng đƣờng trao đổi chất Trichoderma reesei .14 1.5.1 Nguồn Cacbon 14 1.5.2 Nguồn Nitơ 15 1.5.3 Nguồn dinh dƣỡng khác 15 1.5.4 Oxi CO2 16 1.5.5 Ảnh hƣởng yếu tố bên lên phát triển nấm Trichoderma 17 1.6 Các phƣơng pháp tinh chế enzyme .17 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 1.6.1 Phƣơng pháp kết tủa đẳng điện 17 1.6.2 Kết tủa phân đoạn muối trung tính (NH4)2SO4 để tách enzyme 18 1.6.3 Kết tủa enzyme dung môi hữu 18 1.6.4 Sử dụng chất trợ lọc (support) kết tủa enzyme 18 1.6.5 Kết tủa polymer có khối lƣợng phân tử cao 19 1.6.6 Thay đổi thành phần hóa học môi trƣờng để làm enzyme 19 1.6.7 Sắc ký lỏng cao áp 19 1.6.8 Sắc ký tƣơng tác ƣa béo 19 1.6.9 Phân tách lỏng - lỏng 20 1.7 Ứng dụng enzyme cellulase .20 1.7.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm 20 1.7.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy bột giấy .21 1.7.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 21 1.7.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 22 1.7.5 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu .23 1.7.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 23 1.8 Cellulase từ số nguồn khác .23 1.8.1 Nấm mốc .24 1.8.2 Vi khuẩn xạ khuẩn 25 1.9 Tình hình nghiên cứu thu nhận cellulase từ trichoderma giới Việt Nam .26 1.9.1 Lịch sử nghiên cứu Trichoderma 26 1.9.2 Tình hình nghiên cứu thu nhận cellulase từ trichoderma giới .27 1.9.3 Tình hình nghiên cứu thu nhận cellulase từ trichoderma Việt Nam 29 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 30 2.1 Vật liệu 30 2.2 Hóa chất thiết bị 30 2.2.1 Hóa chất .30 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 32 2.3 Các môi trƣờng nuôi cấy 32 2.3.1 Môi trƣờng giữ giống PGA (Potato Glucose Agar): 32 2.3.2 Môi trƣờng nhân giống 32 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 2.3.3 Môi trƣờng nuôi cấy 32 2.3.4 Môi trƣờng tuyển chọn 33 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.4.1 Phƣơng pháp nuôi cấy trichoderma thu cellulase môi trƣờng lỏng rắn 33 2.4.2 Phƣơng pháp cấy chuyền giữ giống .33 2.4.3 Xác định hoạt độ cellulase 33 2.4.3.1 Nguyên tắc 33 2.4.3.2 Tiến hành 33 2.4.3.3 Cách tính kết .34 2.4.4 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng khử phƣơng pháp Dinitro Salicylic 34 2.4.5 Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase môi trƣờng rắn 35 2.4.5.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian thu nhận .35 2.4.5.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng độ ẩm .36 2.4.5.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ .36 2.4.5.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng pH 36 2.4.5.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn chất khác .37 2.4.6 Tinh enzyme 37 2.4.7 Đặc tính enzyme cellulase từ trichoderma reesei 38 2.4.7.1 Phƣơng pháp xác định nhiệt độ tối ƣu 38 2.4.7.2 Phƣơng pháp xác định pH enzyme cellulase từ trichoderma reesei 38 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 31 Nghiên cứu phân lập chủng Trichoderma reesei có khả sinh tổng hợp cellulase 39 3.2 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase môi trƣờng rắn 40 3.2.1 Ảnh hƣởng thời gian đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 40 3.2.2 Ảnh hƣởng độ ẩm đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 41 3.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 42 3.2.4 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase .43 3.2.5 Ảnh hƣởng nguồn chất đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 45 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 3.3 Nghiên cứu số đặc tính enzyme cellulase chiết tách từ chủng Trichoderma reesei Vn1072 46 3.3.1 Nghiên cứu nhiệt độ tối ƣu enzyme cellulase .47 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng pH lên hoạt tính cellulase 47 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Khảo sát lần lƣợt khả kết tủa enzyme với tác nhân tỷ lệ khác nhằm xác định điều kiện kết tủa cho hàm lƣợng hoạt tính cellulase cao Cách tiến hành : Tiến hành lọc dịch enzyme thô, loại bỏ bã thu dịch Xác định thể tích dịch thu đƣợc, cho tác nhân tủa theo tỷ lệ khảo sát Tiến hành tủa enzyme với tỷ lệ dịch enzyme thơ so với thể tích dung mơi lần lƣợt 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 Dịch thu đƣợc ta bỏ lạnh 0oC Sau ly tâm lạnh 0-5oC với tốc độ 4000 vòng/phút 15 phút Ta tiến hành hòa tan tủa nƣớc cất (thể tích nƣớc cất thể tích enzyme thơ ban đầu) để thu enzyme tinh chế Xác định hoạt tính chế phẩm enzyme thu đƣợc Từ chọn dung mơi tủa, nồng độ dung mơi thích hợp Lƣu ý : dung môi phải đƣợc làm lạnh trƣớc để hạn chế gây biến tính enzyme trình tủa Trong trình ly tâm, rửa tủa enzyme phải ln đƣợc trì lạnh để hạn chế enzyme hoạt tính Khi cho tác nhân tủa vào dịch enzyme thơ phải cho từ từ để tránh kết tủa cục 2.4.7 Đặc tính enzyme cellulase từ Trichoderma reesei 2.4.7.1 Phƣơng pháp xác định nhiệt độ tối ƣu Sử dụng enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase Xác định hoạt tính cellulase nhiệt độ 25 – 45oC (hút dịch enzyme ổn nhiệt nhiệt độ cần khảo sát 24h sau xác định hoạt tính enzyme cellulase Từ vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên hoạt tính enzyme nhiệt độ, suy nhiệt độ tối ƣu (top) cellulase chiết tách từ Trichoderma reesei Vn1072 2.4.7.2 Phƣơng pháp xác định pH enzyme cellulase từ Trichoderma reesei Sử dụng enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng pH lên hoạt tính cellulase Điều chỉnh pH cách sử dụng đệm có pH khác từ 3-8 Tiến hành thủy phân cellulase, nhiệt độ thực nghiệm nhiệt độ tối ƣu Dựng đƣờng biểu diễn biến thiên hoạt độ enzyme cellulase pH Suy pH tối ƣu (pH op) enzyme 49 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu phân lập chủng Trichoderma reesei có khả sinh tổng hợp cellulase Các chủng Trichoderma reesei đƣợc nuôi cấy môi trƣờng tuyển chọn có bổ sung chất cacboxylmethylcellulose kích thích q trình sinh tổng hợp enzyme Ni nhiệt độ phịng, lắc với tốc độ 180 v/p, tiến hành lấy mẫu thời điểm 3; 4; 5; ngày Dịch nuôi cấy đƣợc xác định hoạt độ cellulase theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử DNS (Dinitro salycylic) Lƣợng đƣờng khử dung dịch thủy phân enzyme tỷ lệ thuận với cƣờng độ màu bƣớc sóng 540 nm y = 2.3559x - 0.2393 2 R = 0.9964 OD 1.5 0.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 nong Hình 3.1 Đƣờng chuẩn Glucose Từ thực nghiệm ta thu đƣợc kết nhƣ sau: Bảng 3.1 Khả sinh tổng hợp cellulase chủng Trichoderma Chủng Hoạt tính cellulase (  mol/ml/phút) Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ 020NC 0.102 0.1207 0.11 1.109 069QX 0.096 0.0963 0.087 0.084 007ND 0.096 0.1045 0.102 0.098 011NL 0.09 0.0907 0.079 0.073 Vn1491 0.054 0.0542 0.054 0.051 Vn1072 0.112 0.1171 0.012 0.094 50 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân hoạt độ enzyme 0.14 0.12 0.1171 0.1207 0.1045 0.0963 0.1 0.0907 0.08 0.0542 0.06 0.04 0.02 Vn1072 020Nc 069QX 007NĐ 011NL Vn1491 chủng Hình 3.2 Hoạt tính chủng Trichoderma reesei Từ kết cho thấy khả sinh tổng hợp cellulsae chủng Trichoderma không giống thời điểm ngày nuôi cấy thứ hoạt tính enzym thu đƣợc cao Từ tập hợp chủng Trichoderma tìm đƣợc chủng có hoạt tính cao chủng trichoderma reesei Vn1072 để nghiên cứu trình sinh tổng hợp cellulase 3.2 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase mơi trƣờng rắn 3.2.1 Ảnh hƣởng thời gian đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase Vi sinh vật sau trải qua giai đoạn sinh trƣởng phát triển ta tiến hành thu nhận enzyme Thời gian thích hợp để thu nhận enzyme hoạt độ enzyme đạt cao Chủng nấm Trichoderma reesei Vn1072 đƣợc nuôi mơi trƣờng rắn nhiệt độ phịng Sau lấy mẫu thời điểm 3, 4, 5, 6, ngày để xác định hoạt độ enzyme Kết thu đƣợc nhƣ sau: 51 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase theo thời gian nuôi cấy môi trƣờng rắn Thời gian (ngày) Mật độ quang (OD) Hoạt độ (  mol/g/phút) 1.3589 1.61126 1.9748 1.7723 1.7088 1.3154 0.628 0.7273 0.87 0.79 0.7657 0.611 cellulase hoạt độ enzyme 0.87 0.79 0.7273 0.8 0.7657 0.628 0.611 0.6 0.4 0.2 thời gian Hình 3.3 Ảnh hƣởng thời gian ni cấy lên hoạt tính enzyme cellulase thơ chiết tách từ nấm Trichoderma reesei Vn1072 Từ kết cho thấy hoạt tính cellulase cao ngày ni cấy thứ 5, hoạt tính đạt 0.87 (  mol/g/phút) Ta thu nhận dịch enzyme cellulase sau ngày nuôi cấy, dịch enzyme đƣợc dùng để thực nghiên cứu ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ, pH, độ ẩm, ảnh hƣởng nguồn chất khác 3.2.2 Ảnh hƣởng độ ẩm đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase Độ ẩm yếu tố cần thiết cho hoạt động vi sinh vật trình phát triển Độ ẩm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng trao đổi chất vi sinh vật trình lên men rắn Độ ẩm tạo độ xốp cho trichoderma reesei tiếp xúc với chất dễ Ngồi độ ẩm cịn ảnh hƣởng tới khuyếch tán O2 làm ảnh hƣởng tới hoạt lực enzyme Độ ẩm thích hợp để thu nhận enzyme hoạt độ enzyme đạt cao Chủng nấm Trichoderma reesei Vn1072 đƣợc nuôi môi trƣờng rắn độ 52 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân ẩm khác từ 50-90% nhiệt độ phịng Sau lấy mẫu để xác định hoạt độ theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử DNS Kết thu đƣợc nhƣ sau : Bảng 3.3 Hoạt độ cellulase theo độ ẩm môi trƣờng rắn Độ ẩm 60 50 Mật độ quang (OD) 70 80 90 1.4904 1.1739 1.0774 0.6798 0.555 0.5175 1.9863 1.6254 Hoạt độ cellulase (  mol/g/phút) 0.8737 0.7329 hoạt tí nh enzyme 0.8 0.6 0.4 0.2 50 60 70 80 90 độ ẩm Hình 3.4 Ảnh hƣởng độ ẩm lên hoạt tính enzyme cellulase thô chiết tách từ nấm Trichoderma reesei Vn1072 - Kết cho thấy hoạt tính cellulase cao độ ẩm mơi trƣờng 60%, hoạt tính đạt 0.8737 (  mol/g/phút) - Hoạt tính enzyme giảm dần độ ẩm từ 70-90% 3.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase Nhiệt độ thích hợp cho tăng trƣởng phát triển hầu hết chủng Trichoderma khoảng từ 25-300C Ở nhiệt độ cao thấp q trình sinh trƣởng Tuy nhiên, nhiệt độ phát triển tốt chƣa trình sinh trƣởng enzyme tốt 53 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Để nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ lên trình sinh tổng hợp enzyme cellulase tơi thực ni chủng Trichoderma reesei Vn1072 môi trƣờng nhiệt độ khác Sau tiến hành xác định hoạt độ sau ngày ni cấy Từ thực nghiệm ta có kết sau: Bảng 3.4 Hoạt tính cellulase theo nhiệt độ nuôi cấy môi trƣờng rắn Nhiệt độ Mật độ quang (OD) Hoạt tính enzyme (  mol/g/phút) hoạt độ enzyme 30 oC 35 oC 40 oC 45 oC 1.1271 1.9537 1.5215 1.0156 0.652 0.537 0.862 0.692 0.4932 0.35 0.862 0.8 0.6 25 oC 0.692 0.537 0.4932 0.35 0.4 0.2 25 30 35 40 45 nhiệt độ Hình 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase chiết tách từ nấm Trichoderma reesei Vn1072 Từ kết ta thấy : - Hoạt tính enzyme cellulase tăng dần từ 25 – 30 oC, giảm dần từ 35-45 oC - Nhiệt độ để sinh tổng hợp enzyme cellulase từ chủng Trichoderma reesei Vn1072 30oC 3.2.4 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase pH ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa chất, ngồi cịn ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp enzyme Để nghiên cứu ảnh hƣởng PH lên hoạt độ enzyme cellulase Chúng tiến hành nuôi chủng Trichoderma reesei Vn1072 môi trƣờng chọn lọc pH 54 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân khác nhau, tiến hành lấy mẫu ngày nuôi thứ đem xác định hoạt độ Kết thu đƣợc nhƣ sau: Từ thực nghiệm ta có kết quả: Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase theo pH ni cấy mơi trƣờng bán rắn 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mật độ quang (OD) 0.7209 1.254 1.5462 1.735 1.512 1.1477 Hoạt tính cellulase (  mol/g/phut) 0.3774 0.587 0.702 0.776 0.688 0.545 hoạt độ enzyme pH 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.776 0.702 0.688 0.587 0.545 0.3774 pH Hình 3.6 Ảnh hƣởng pHlên hoạt tính enzyme cellulase thơ chiết tách từ nấm Trichoderma reesei Vn1072 Từ kết cho thấy : pH có ảnh hƣởng lớn đến khả sinh tổng hợp cellulase Sự thay đổi pH làm cho hoạt tính enzyme thay đổi Từ kết nghiên cứu cho thấy mơi trƣờng có pH từ - có khả sinh tổng hợp đƣợc enzyme nhƣng tùy vào chủng vi nấm dựa vào việc khảo sát ảnh hƣởng pH đến khả sinh tổng hợp cellulase ta thấy Trichoderma reesei sinh tổng hợp cellulase tốt pH = 3.2.5 Ảnh hƣởng nguồn chất đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase Cơ chất với nồng độ định thƣờng đóng vai trị chất cảm ứng cho trình sinh tổng hợp enzyme 55 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Để nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn chất lên trình sinh tổng hợp enzyme cellulase tơi thực ni chủng Trichoderma reesei Vn1072 mơi trƣờng có chứa nguồn chất khác nhƣ bã mía, cám mỳ, mụn cƣa Sau tiến hành xác định hoạt độ sau ngày nuôi cấy Từ thực nghiệm ta có kết sau: Bảng 3.6 Hoạt tính cellulase theo nguồn chất mơi trƣờng rắn Bã mía Cám mỳ Mụn cƣa Mật độ quang (OD) 1.6824 1.8735 0.35974 Hoạt tính enzyme (  mol/g/phút) 0.7553 0.83 0.2354 hoạt độ enzyme Nguồn chất 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 bã mí a cám mỳ mụn cưa nguồn chất Hình 3.7 Ảnh hƣởng nguồn chất lên hoạt tính cellulase chiết tách từ nấm Trichoderma reesei Vn1072 Từ kết ta thấy : - Hoạt tính enzyme cellulase nguồn chất khác khác - Dựa vào kết ta thấy hoạt tính enzyme cellulase mơi trƣờng có chứa cám mỳ cao 3.3 Nghiên cứu số đặc tính enzyme cellulase chiết tách từ chủng Trichoderma reesei Vn1072 Để thuận lợi cho nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ chủng nấm Trichoderma reesei Vn1072 enzyme thơ đƣợc làm (NH4)2SO4 tỉ lệ 1: để kết tủa tủ lạnh 40C 2h Sau đem kết 56 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân tủa ly tâm chế độ 4000 vòng 15 phút thu lấy phần cặn, rửa cặn nƣớc cất ống ly tâm thu đƣợc enzyme tinh 3.3.1 Nghiên cứu nhiệt độ tối ƣu enzyme cellulase Nhiệt độ tối ƣu nhiệt độ mà enzyme hoạt động mạnh có nghĩa hoạt tính cao Khi nhiệt độ cao thấp nhiệt độ tối ƣu hoạt tính enzyme giảm Chúng ta tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulsae để tìm nhiệt độ tối ƣu Từ vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên hoạt tính enzyme nhiệt độ, suy nhiệt độ tối ƣu (top) cellulase chiết tách từ Trichoderma reesei Vn1072 Từ thực nghiệm ta có kết sau: Bảng 3.7 Hoạt tính cellulase theo nhiệt độ phản ứng T0 C 25 30 35 40 45 OD 1.323 2.1407 1.6891 1.1146 0.8357 0.614 0.9354 0.755 0.5321 0.4225 Hoạt độ cellulsae (  mol/g/phút) 0.9354 hoạt độ enzyme 0.755 0.8 0.614 0.5321 0.6 0.4225 0.4 0.2 25 30 35 40 45 nhiệt độ Hình 3.8 Hoạt độ cellulase nhiệt độ khác Ta thấy môi trƣờng bán rắn, nhiệt độ T = 300C enzyme cellulase hoạt động mạnh Ở nhiêt độ thấp nhƣ nhiệt độ cao 300C hoạt độ giảm Điều nhiệt độ thấp cao 300C enzyme cellulase bị ức chế dẫn đến hoạt động thấp 57 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng pH lên hoạt tính cellulase Mỗi enzyme thu từ lồi, chủng khác có dải pH hoạt động khác Và enzyme có pH tối ƣu, mà hoạt tính đạt cao Khi pH cao thấp hoạt tính giảm Để nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến hoạt độ cellulase, tiến hành hòa tan cách sử dụng dung dịch đệm có pH từ 3-8 Tiến hành thủy phân cellulase, nhiệt độ thực nghiệm nhiệt độ tối ƣu Bảng 3.8 Hoạt tính cellulase theo pH phản ứng 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mật độ quang (OD) 0.89876 1.3221 1.591 1.9322 1.6137 1.2564 Hoạt tính cellulase (  mol/g/phút) 0.4473 0.614 0.7194 0.8535 0.7283 0.5872 hoạt độ enzyme pH 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.8535 0.7283 0.7194 0.614 0.5872 0.4473 pH Hình 3.9 Hoạt độ cellulase pH khác Qua bảng kết t thấy pH = hàm lƣợng cellulase thu đƣợc lớn Nếu cao hay thấp enzyme hoạt động nên lƣợng cellulase tạo thấp 58 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân KẾT LUẬN Kết xác định hoạt độ tập hợp gồm chủng Trichoderma cho thấy hầu hết chủng có hoạt tính cellulase Tuy nhiên, khả sinh tổng hợp cellulase chủng không giống - Chọn chủng Trichoderma reesei Vn1072 có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase cao để tiến hành nghiên cứu - Cellulase tách chiết từ Trichoderma reesei Vn1072 có hoạt tính cao sau ngày ni cấy, hoạt tính enzyme thơ đạt 0.862  mol/g/phút - Nghiên cứu đƣợc số yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp cellulase từ nấm Trichoderma reesei Vn1072 nhƣ nhiệt độ, pH, độ ẩm - Nghiên cứu đặc tính cellulase chủng Trichoderma reesei Vn1072 thu đƣợc kết nhƣ sau:  Nhiệt độ tối ƣu: 30oC  pH tối ƣu: pH = 59 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, 2004 Công nghệ Enzyme Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Phạm Thị Ánh Hồng, 2003 Kỹ thuật sinh hóa Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng Thí nghiệm cơng nghệ sinh học Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Trần Thị Ánh Tuyết, Trƣơng Quốc Huy Khảo sát điều kiện nuôi cấyvà phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis Tuyển tập Báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ7 Nguyên Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lƣơng, 1982: Vi Nấm NXB KH & KT, Hà Nội Lê Hồng Phú Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzyme pectinase cellulase ứng dụng sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men Nguyến Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục, 2003 Trần Thạnh Phong Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme cellulase từ trichoderma reesei aspergillus niger môi trường lên men bán rắn Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Châu Hồng Vũ Thu nhận tinh enzyme cellulase từ trichoderma phương pháp lên men bán rắn Khoa luận cử nhân khoa học, Trƣờng Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 10 Trần Thạnh Phong, Hồng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phƣợng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hƣng, Trƣơng Thị Hồng Vân Thu nhận enzyme cellulsae trichoderma reesei môi trường bán rắn Tạp chí phát triển Khoa học Công Nghệ, tập 10, số 07-2007 60 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 11 Nguyễn Văn Tuân Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo -β-1,4-Glucanase đánh giá tính chất lý hóa endo -β-1,4Glucanase Luận văn thạc sĩ khoa học Viện khoa học công nghệ Việt Nam 2009 12 Nguyễn Trần Nhật Minh Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 13 J Environ Biol Optimization of solid state fermentation conditions for the production of cellulase by Trichoderma reesei Journal of Environmental Biology January 2012 14 Arja Miettinen-Oinonen Trichoderma reesei strains for production of cellulases for the textile industry Faculty of Biosciences department of biological and enviromental sciences University of Helsinki, 2004 15 M M V Baig Cellulolytic enzymes of trichoderma lignorum produced on banana ogro-waste: optimisation of culture medium and conditions Journal of Scientific and Industrial Research, January 2005, pp 57-66 16 Enzyme assay 17 M.K Bakare1, I.O.Adewale, A Ajayi3, O.O.Shonukan3 Purification and characterization of cellulase from the wild-type and two improved mutants of Pseudomonas fluorescens Department of Biochemistry and Microbiology, Obafemi Awolowo University, Ile-Ife, Nigeria, 10 August, 2005 18 ALI, Nagham1, YAZAJI, SABAH , HAJALI, A.2 and AZMEH, M.F Optimization of cellulase production by submerged fermentation of agriculture wastes by Trichoderma spp Department of Food Science, faculty of Agriculture, Damascus University 19 BY K Selby and C C.Maitland The Cellulase of Trichoderma viride separation of the components involved in the solubilization off cotton Shirley Institute, Didebury, Marnche8ter 20(Received 16 December 1966) 20 T K GHOSE Measurement of cellulase activities Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology, New Delhi-110016, India 21 Shazia Shafique, Rukhsana Bajwa and Sobiya Shafique Cellulase biosynthesis by selected trichoderma species Institute of Mycology and Plant Pathology, 61 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân University of the Punjab, Quaid-e-Azam Campus Lahore, Pakistan 22 M Moosavi-Nasab and M Majdi-Nasab Cellulase Production by Trichoderma reesei using Sugar Beet Pulp Department of Food Science and Technology, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, I R Iran 23 Anikó Brumbauer, Gote Johansson & KatiRéczey Fractionation of cellulase and  -glucosidase in a Trichoderma reesei culture liquid by use of two-phase partitioning Department of Biochemistry, Lund University, P.O Box 124, S-221 00 Lund 24 Jae Ho Do and Sang Dal Kim Enzymatic properties of a cellulase from Ganoderma lucidum Korea Ginseng and Tobaco Reasearch Institute, Daejeon 300-31, Korea 25 T Nakari-Setala and M Penttila Production of Trichoderma reesei cellulases on glucose-containing media Appl Environ Microbiol, 1995 26 Minoru Kumakura, Masao Tamada, Noboru Kasai, and lsao Kaestu Enhancement of Cellulase Production by Immobilization of Trichoderma reesei Cells Department of Nutrition, Faculty of Domestic Science, Tokyo Kasei University, Kaga, Itabashiku, Tokyo, Japan Accepted for publication July 18, 1988 27 Linder, M., et al (1995).The difference in affinity between two fungal cellulose-binding domains is dominated by a single amino acid substitution FEBS letters, 372(1), pp 96-98 28 Kleywegt, G.J., et al (1997) The crystal structure of the catalytic core domain of endoglucanase I from Trichoderma reesei at 3.6 Å resolution, and a comparison with related enzymes1 Journal of molecular biology, 272(3), pp 383-397 29 Martinez, D., et al (2008) Genome sequencing and analysis of the biomassdegrading fungus Trichoderma reesei (syn Hypocrea jecorina) Nature Biotechnology, 26(5), pp 553-560 30 Mattinen, M.L., et al (1997) Three-dimensional structures of three engineered cellulose-binding domains of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei Protein science, 6(2), pp 294-303 31 Montenecourt, B.S (1983) Trichoderma reesei cellulases Trends in Biotechnology, 1(5), pp 156-161 62 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 32 Saloheimo, M., et al (1997) cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast European Journal of Biochemistry, 249(2), pp 584-591 33 Seiboth, B., Ivanova, C., and Seidl-Seiboth, V (2011) Trichoderma reesei: A Fungal Enzyme Producer for Cellulosic Biofuels Biofuel Production – Recent Developments and Prospects 63 SV: Lê Thị Duyên Lớp: 49K-Hóa Thực Phẩm ... ÁN Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Trichoderma reesei môi trƣờng lên men rắn Nội dung nghiên cứu:  Tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao để tiến hành nghiên cứu  Nghiên cứu. .. nấm Trichoderma reesei cho hoạt tính enzyme cellulase cao - Nghiên cứu đƣợc số yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp cellulase từ nấm Trichoderma reesei Vn1072  Nghiên cứu tinh enzyme cellulase. .. 39 31 Nghiên cứu phân lập chủng Trichoderma reesei có khả sinh tổng hợp cellulase 39 3.2 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase môi trƣờng rắn