Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng bacillus subtilis phân lập từ đất vườn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --- NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP ENZYM CELLULASE TỪ CHỦNG Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ðẤT VƯỜN Chuyên ngành: CÔN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ CÚC

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP ENZYM CELLULASE

TỪ CHỦNG Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ðẤT VƯỜN

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác

Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi

rõ nguồn gốc

Học viên

Nguyễn Thị Cúc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội để hoàn thành ựược luận văn này tôi ựã nhận ựược rất nhiều sự ựộng viên, giúp ựỡ của nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kắnh trọng tới PGS.TS Lương đức Phẩm và TS Nguyễn Văn Giang người ựã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks Phạm Thị Hải, ựã nhiệt tình giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý đào tạo sau ựại học, các Thầy

Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, ựã tạo mọi ựiều kiện và giúp ựỡ tôi về kiến thức cũng như chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ựến gia ựình, bạn bè, những người thân ựã luôn bên tôi, ựộng viên và khuyến khắch tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Học viên

Nguyễn Thị Cúc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iii

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iv

MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

PHẦN 1 MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích của ñề tài 2

1.3 Nội dung ñề tài 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus 3

2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 4

2.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 9

2.2 Giới thiệu chung về cellulose và enzym cellulase 11

2.2.1 Cellulose 11

2.2.2 Lignocellulose 13

2.2.3 Enzym cellulase 16

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase ở vi sinh vật 23

2.2.5 Một số ứng dụng của enzym cellulase 25

2.2.6 Thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ môi trường nuôi cấy 26

2.3 Tình hình nghiên cứu enzym cellulase 27

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 27

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 28

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu 29

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 29

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 29

3.1.3 Hóa chất 30

3.2 Các phương pháp nghiên cứu 31

3.2.1 Phương pháp giữ giống 31

3.2.2 Xác ñịnh ñặc ñiểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào 31

3.2.3 Phương pháp xác ñịnh chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym cellulase (phương pháp ñịnh tính) 31

3.2.5 Xác ñịnh sự sinh trưởng theo mật ñộ quang 35

3.2.6 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ enzym cellulase - CMCase (phương pháp ñịnh lượng) (Ghose TK, 1987) 36

3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase 37

3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt ñộ CMCase 39

3.2.9 Phương pháp tách và thu nhận enzym CMCase bằng dung môi hữu cơ (ethanol 960 và aceton) 40

3.2.10 Xác ñịnh ñộ bền nhiệt ñộ của CMCase 41

3.2.11 Xác ñịnh ñộ bền pH của CMCase 41

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzym CMCase 42

4.1.1 Kết quả tuyển chọn 42

4.1.2 Lựa chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym CMCase 43

4.2 Phân loại 44

4.2.2 Xác ñịnh một số các phản ứng sinh hóa của chủng Bs4 44

4.3 ðường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis Bs4 45

4.4 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase 46

4.4.1 Lựa chọn chất cảm ứng thích hợp 46

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất cảm ứng CMC 48

4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường 49

4.4.4 Ảnh hưởng của pH ban ñầu 49

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vi

4.4.5 Ảnh hưởng của nồng ñộ CaCO3 50

4.4.6 Ảnh hưởng của ñộ thông khí 51

4.4.7 Ảnh hưởng của thời gian ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase 52

4.5 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt ñộ CMCase 54

4.5.1 Nhiệt ñộ phản ứng thích hợp 54

4.5.2 pH phản ứng thích hợp 55

4.6 Nghiên cứu tách enzym CMCase từ dịch môi trường 57

4.7 Xác ñịnh ñộ bền nhiệt của CMCase 58

4.8 Xác ñịnh ñộ bền pH của CMCase 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

Kết luận 61

Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 66

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vii

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hoá của B Subtilis 5

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của một số loại phế thải nông nghiệp 14

Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng trong ñề tài 29

Bảng 3.2 Các hoá chất sử dụng trong ñề tài 30

Bảng 3.3 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính một số enzym ngoại bào

của Bacillus subtilis 35

Bảng 3.4 Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác ñịnh ñường chuẩn glucose 36

Bảng 3.5 Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác ñịnh hoạt ñộ cellulase 37

Bảng 4.1 ðường kính VPG cơ chất CMC của 4 chủng Bs 43

Bảng 4.2 Kết quả xác ñịnh một số các phản ứng sinh hóa của chủng Bs4 44

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp CMCase của chủng Bs4 47

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất cảm ứng CMC ñến khả năng sinh CMCase của chủng Bs4 48

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của pH ban ñầu ñến khả năng sinh enzym CMCase 50

Bảng 4.6 Khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 trong môi trường có CaCO3 51

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của ñộ hiếu khí lên khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 52

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 53

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ phản ứng thích hợp ñến hoạt ñộ CMCase của chủng Bs4 54

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của pH phản ứng thích hợp ñến hoạt ñộ CMCase của chủng Bs4 56

Bảng 4.11 Thu nhận enzym bằng các dung môi hữu cơ 57

Bảng 4.12 Kết quả ño hoạt ñộ CMCase theo các dung môi hữu cơ 57

Bảng 4.13 ðộ bền nhiệt của CMCase 58

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp viii Bảng 4.14 ðộ bền pH của CMCase 59

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ix

DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis 4

Hình 2.2 Cấu tạo phân tử cellulose 12

Hình 2.3 Cấu trúc của CMC 13

Hình 2.4 Cấu trúc của lignocellulose 14

Hình 2.5 Cấu tạo phân tử lignin 16

Hình 2.6 Cơ chế hoạt ñộng của endoglucanase (EG) 19

Hình 2.7 Cơ chế hoạt ñộng của exoglucanase (CBH) 20

Hình 2.8 Cơ chế hoạt ñộng của β - glucozidase 20

Hình 2.9 Sơ ñồ tác ñộng phân giải của hệ cellulase lên phân tử cellulose

(Has G.Schlegel, 1993) 21

Hình 2.10 Mô hình phân hủy cellulose của Lutzen 22

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng Bs có hoạt tính enzym ngoại bào 43

Hình 4.2 Khả năng thủy phân cơ chất CMC của chủng vi khuẩn Bs4 43

Hình 4.3 ðường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bs4 ở 300C 45

Hình 4.4 Ảnh hưởng của chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp CMCase của chủng Bs4 47

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường ñến khả năng sinh enzym CMCase 49

Hình 4.6 Ảnh hưởng của thời gian ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 1

PHẦN 1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Vi sinh vật trong tự nhiên rất ña dạng và phong phú Chúng có mặt khắp nơi: trong ñất, trong nước, trong không khí,…Bên cạnh tác hại gây ra như gây bệnh cho con người, ñộng vật, thực vật…vi sinh vật còn mang lại cho con người nguồn lợi to lớn trong các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, công nghệ sinh học… Các chủng vi

sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói riêng ñang ñược ứng dụng rộng rãi trong

Enzym là những chất xúc tác sinh học có hiệu suất xúc tác cao, ñang ngày càng

ñược áp dụng rộng rãi trong thực tế với quy mô ngày càng lớn Hệ enzym của Bacillus

rất phong phú và ña dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase và chế phẩm enzym cellulase là một trong những chế phẩm enzym có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ trong tự nhiên Cellulase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, ñộng vật và

vi sinh vật Nhưng hiệu quả kinh tế nhất vẫn là nguồn cellulase thu ñược từ vi sinh vật, phổ biến là nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn Mặc dù nấm sợi phân hủy rất tốt các cellulose

tự nhiên nhưng vi khuẩn lại có tốc ñộ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có ưu việt lớn hơn

Trong sản xuất và ñời sống, enzyme nói chung và cellulase nói riêng ñược sử dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế giới tăng 20÷30% mỗi năm Enzyme và những chế phẩm có liên quan ñược sử dụng trong các ngành công nghiệp nhẹ, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm

ở Việt Nam hiện nay chủ yếu ñược nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao mặc dù nước ta có nguồn phế phẩm nông nghiệp dùng làm nguyên liệu ñể sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzym từ vi sinh vật phân lập tại Việt Nam hiện nay ñang là một ñòi hỏi cấp thiết Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzym nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp ñã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 2

Xuất phát từ lý do trên và tình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi ñã tiến hành thực

hiện ñề tài: ‘‘Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng Bacillus subtilis

phân lập từ ñất vườn’’

1.2 Mục ñích của ñề tài

1 Chọn ñược một chủng vi khuẩn có khả năng sinh ra cellulase

2 Thu ñược một chế phẩm cellulase ở quy mô phòng thí nghiệm

1.3 Nội dung ñề tài

1 Tuyển chọn một chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzym cellulase

2 Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng tuyển chọn

3 Khảo sát các ñiều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase

4 Nghiên cứu phương pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm cellulase có hoạt tính cao

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.1 đặc ựiểm chung vi khuẩn Bacillus

Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong ựất, nước, không khắ là do chúng

có khả năng hình thành bào tử và sống kị khắ tùy tiện Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này ựều có khả năng sinh ra nhiều amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra cellulase

Bacillus là vi khuẩn Gram dương (+), hình que có kắch thước khác nhau (0,5-2,5)

x (l,2-10) ộm Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di ựộng Chúng sống hiếu khắ hay kị khắ tùy tiện Bacillus là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu

năng lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ

Bacillus có khả năng sinh bào tử Bào tử của vi khuẩn không phải là cơ quan

sinh sản mà là một trạng thái bảo vệ nòi giống Nó sinh ra ựể chịu ựựng ựược với các ựiều kiện sống bất lợi đó là dạng nghỉ của tế bào và ở ựó, quá trình sống bị ức chế rất mạnh Ở phần lớn vi khuẩn, mỗi tế bào chỉ có một bào tử Gặp ựiều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm Mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng Bào tử của

giống Bacilus thường có kắch thước hẹp hơn kắch thước của tế bào do ựó khi mang bào tử

tế bào không bị biến ựổi hình dạng , trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn chỉ phình to một ắt khi chứa bào tử Tùy loài mà bào tử có thể nằm chắnh tâm, lệch tâm hay gần ựầu tế bào (Lương đức Phẩm, 2009)

Bào tử vi khuẩn có thể chịu ựựng ựược khá cao các ựiều kiện bất lợi của ngoại cảnh Khả năng ựề kháng này không giống nhau ựối với tùy loài vi khuẩn Ở nhiệt

sterosporus Ờ 7 phút rưỡi, B subtilis Ờ 180 phút, B mesentericus Ờ 380 phút, và

của B tostus Ờ 1200 phút (Nguyễn Lân Dũng, 1989)

đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số Bacillus phù hợp với pH = 9 - 10 như B alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 - 6 như B acidocaldrius

Nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt ựộ cao (45ồC - 75ồC), hay ưa lạnh (5ồC - 25ồC), nhưng thường gặp Bacillus ưu ấm ở nhiệt ựộ 25ồC - 45ồC (tối thắch là 35ồC - 37ồC)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 4

Vi khuẩn thuộc giống Bacillus ñã và ñang ngày càng trở thành những vi sinh vật

hàng ñầu về mặt ứng dụng do chúng có tiềm năng lớn về các enzym ngoại bào Các ứng dụng của chúng bao gồm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống ñến công nghệ lên men hiện ñại, xử lý môi trường ô nhiễm, v.v…

2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.2.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis ñược phát hiện ñầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y

học Nazi của ðức Lúc ñầu ñược sử dụng chủ yếu là ñể phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ ðức chiến ñấu ở Bắc Phi

Việc ñiều trị phải ñợi ñến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự

tách ñược chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ ñó “subtilis therapy” có nghĩa là

"thuốc subtilis" ra ñời trị các chứng viêm ruột, viêm ñại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn này ñã trở nên rất phổ biến, ñược sử dụng rộng

rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm…

2.1.2.2 ðặc ñiểm phân loại

Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Bộ: Eubacteriales

Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis

Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.2.3 ðặc ñiểm phân bố:

Loài B subtilis rất hay gặp trong ñất, ñặc biệt ở cỏ khô Vì vậy, nó ñược gọi là trực

khuẩn cỏ khô (Lương ðức Phẩm, 2009) Chúng cư trú trong ñất, thông thường ñất

ñất hoang thì vi khuẩn B subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào B.subtilis

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 5

2.1.2.4 ðặc ñiểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay kị

khí tùy tiện Thường ñược tìm thấy trong ñất có bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức

xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm (M Paul và ctv., 2006)

B subtilis có khuẩn lạc khô, vô màu hay có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo

ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch Trực khuẩn ngắn nhỏ kích thước từ (3-5 x 0,6)µm, nhiều khi nối lại thành sợi dài, ngắn khác nhau có thể ñứng riêng rẽ (hình 2.1) Bào tử chịu ñược nhiệt khá cao, có hình bầu dục 0,9 – 0,6µm, phân bố không theo nguyên tắc chặt

chẽ nào (lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm) (Lương ðức Phẩm, 2005)

2.1.2.5 ðặc ñiểm sinh hoá

Trong môi trường lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ Do bào tử B

subtilis chịu nhiệt cao thanh trùng không chết nên phát triển trong một số thực

phẩm hộp gây hư hỏng và tạo mùi khó chịu B subtilis sinh acid từ xylose,

arabinose, glucose, sucrose và manitol nhưng không tạo khí (sử dụng nguồn nitơ

là muối amonium) Có khả năng phân giải nitrat, sinh nitrit từ nitrat Trong ñiều kiện kỵ khí, không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrat

Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hoá của B Subtilis

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 6

B subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism) Chúng dùng cách này như

một phương pháp ñơn giản ñể thoát khỏi những trường hợp ñiều kiện sống giới hạn

B subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như: Subtilin,

subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, difficidin,

bacillanene…, những chất này có thể gọi chung là bacteriocin (Nguyễn Lân Dũng, 1989)

2.1.2.6 Bào tử và khả năng tạo bào tử

Cấu tạo bào tử

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng nhầy, dưới lớp màng là vỏ Vỏ bào tử có nhiều lớp ðây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất ñồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao ñổi chất, vì

vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê ðỗ Mai Phương, 2004)

Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh

lý

Bào tử B subilis có dạng ellip ñến hình cầu, kích thước chiều rộng 0,6 – 0,9 µm,

chiều dài 1,0 – 1,5 µm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm ñến gần cuối tế bào, phần lớn ñược tạo thành ở 8 giờ Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chịu khô hạn (Trần ðỗ Quyên, 2004)

Khả năng tạo bào tử

Theo ña số các nhà nghiên cứu cho rằng bào tử là một hình thức sống tiềm sinh (cryptobiosis, latent life) của vi khuẩn Bào tử giúp cho vi khuẩn vượt qua những ñiều kiện bất lợi của ngoại cảnh Bào tử thường ñược sinh ra trong khó khăn như thiếu thức

ăn, nhiệt ñộ và pH không thích hợp, môi trường tích lũy nhiều sản phẩm trao ñổi chất

có hại…(Nguyễn Lân Dũng, 1989) Tuy nhiên, B subtilis cũng có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên (Tô Minh Châu, 2000) Sự tạo bào tử diễn ra

gồm nhiều giai ñoạn, tổng cộng gần 8 giờ ñể hoàn tất Lúc ñầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào ñược sử dụng Tế bào chất và nhân tập trung lại ở một vị trí nhất ñịnh trong tế bào Vị trí này thường ñược gọi là vùng bào sinh (hoặc bào nguyên ñới) Tế

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 7

bào chất tiếp tục cô ñặc lại và sau ñó tế bào hình thành một vách ngăn và bắt ñầu phân chia thành hai phần Phần nhỏ hơn của tế bào ñược gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn ñược gọi là tế bào mẹ Tiền bào tử bắt ñầu ñược bao bọc dần bởi các lớp màng Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng tự phân giải và bào tử ñược giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp ñiều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn

(Nguyễn Lân Dũng, 1989)

2.1.2.7 Khả năng sinh enzym của Bacilus subtilis

B subtilis có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzym ngoại bào có hoạt tính cao

như: amylase, protease và cellulase…

 Khái niệm về enzym ngoại bào

Enzym ngoại bào là những enzym ñược tạo ra trong tế bào vi sinh vật, sau ñó tiết vào môi trường xung quanh ñể phân hủy các cơ chất có cấu tạo cao phân tử, biến các

cơ chất này thành những chất có phân tử thấp, mà vi sinh vật có thể ñồng hóa ñược (Lương ðức Phẩm, 1979)

 Enzym protease

Protease là nhóm enzym thủy phân các liên kết peptit (- CO-NH -) trong phân tử protein hoặc các polypeptit Protease có thể chia thành: proteinase và peptidase Proteinase thủy phân protein thành polypeptit, pepton Chúng có tính ñặc hiệu tương ñối rộng Tiếp theo ñó là sự phân hủy các peptit có phân tử nhỏ này (pepton, polypeptit) thành các axit amin tự do dưới tác dụng của peptidase Các peptitdase có tính ñặc hiệu hơn, chúng chỉ tác dụng lên các liên kết peptit ở những vị trí nhất ñịnh Protease của vi khuẩn hoạt ñộng chủ yếu ở vùng pH 7 – 9

Protease nói chung ñược dùng ñể nâng cao giá trị dinh dưỡng của thịt cá, thủy phân protein của sữa ñể chế những món ăn kiêng ñặc biệt và ñược dùng trong thuộc

da, chế bột giặt, phim ảnh, tơ sợi, len dạ, cũng như dùng trong y học Protease vi sinh vật có thể sử dụng với amylase trong sản xuất thức ăn gia súc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 8

 Enzym amylase

Amylase là các enzym xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các polyose tương tự như dextrin, glucogen

Ở vi khuẩn Bacillus enzym chủ yếu trong nhóm này là α-amylase

α-amylase có khả năng thủy phân tinh bột mạnh và tạo thành những dextrin cao phân tử tạo màu với iot, α-amylase vi khuẩn ñược ổn ñịnh bằng ion canxi Phạm vi pH tác dụng tối thích là khoảng 6,5 – 7, α-amylase vi khuẩn bền vững với nhiệt ñộ cao và

α-amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết α-1,4 glucozit nội mạch ở bất

kỳ vị trí nào bên trong phân tử tinh bột với cơ chất là amylose

Với những tính chất này mà α-amylase của vi khuẩn ñược dùng ñể dịch hóa tinh bột, làm giảm ñộ nhớt của dịch hồ và chủ yếu trong chế biến dextrin Nó cũng ñược dùng phối hợp với glucoamylase sản xuất ñường mật ngô và sôcôla, trong sản xuất bia, với hỗn hợp ñường ñể sản xuất thức ăn trẻ con, ñể sản xuất nước quả và ñược ứng dụng rộng rãi trong y học

 Enzym cellulase

Cellulase là một phức hệ enzym phức tạp xúc tác cho sự thủy phân cellulose thành cellobiose, rồi sau ñó tiếp tục thủy phân tới glucose

Cellulose cellobiose glucose

Việc nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose ñến glucose bằng enzym, cũng như việc nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm cellulase có hoạt tính cao là một công việc có

nhiều ý nghĩa về mặt lý thuyết và mặt thực tế sản xuất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 9

2.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên

2.1.3.1 Bacillus mesentericus

B mesentericus rất giống B subtilis, ñược gọi là trực khuẩn khoai tây Khuẩn lạc

mọc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nhúm, khô, không mọc lan

ra môi trường, màu xám nhạt – trắng hay hơi vàng, cũng có khi có màu kem hay vàng

nâu Thường gặp B mesentericus rubber có khuẩn lạc nhuộm màu hồng, B

mesentericus niger màu ñen (Nguyễn Lân Dũng, 1983)

Tế bào hình que mảnh, dài ngắn khác nhau (3 - 10) x (0,5 - 0,6) µm, ñứng riêng

rẽ hoặc xếp hàng thành chuỗi dài Bào tử hình ovan dài (0,5 – 0,9 µm), nằm ở bất kỳ trong tế bào và tế bào không phình to khi có bào tử

B mesentericus ngừng phát triển

B mesentericus có hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào cao hơn B subtilis,

nhưng lên men ñường lại kém hơn

B mesentericus và B subtilis rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm

hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm chứa nitơ và các sản phẩm giàu ñường (bánh kẹo, hoa quả…) Ngoài ra chúng còn sinh một loại hợp chất có tính kháng một

số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin, ở B subtilis gọi là subtilin hay inrutin A, B

Bào tử của nó phát tán khắp nơi, trong ñất, không khí… thường sinh sôi và nảy

nở trên thực phẩm và có thể sinh ra ñộc tố gây ngộ ñộc thực phẩm Nó còn ñược áp dụng ñể sản xuất thuốc kháng sinh (Lương ðức Phẩm, 2006)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 10

2.1.3.3 Bacillus pumilus

Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, Bacillus pumilus có mặt trong ñất nhiều hơn

Bacillus subtilis Khuẩn lạc nhỏ xung quanh viền mờ lan không ranh giới Tế bào của

nó gần giống với tế bào của Bacillus subtilis (Cao Thị Hạnh, 2007)

2.1.3.4 Bacillus megaterium

Ở ống giống non, tế bào khá dày, chiều ngang 1,2 - 1,5 µm, ñôi khi tới 2 µm, chiều dài từ 3 ñến 10 - 12 µm Các tế bào ñứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi Ở các giống nuôi già, tế bào ngắn hơn, có vẻ tròn, ñôi khi có hình thoi với ñầu hẹp lại Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và nhiều chất dinh dưỡng dự trữ (các hạt mỡ và glycogen) Bào tử hình ovan hay hình bầu dục kéo dài có kích thước 0,7 – 1,0 x 1,5 µm, nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hay chiều xiên của tế bào (Nguyễn Lân Dũng, 1983) Khuẩn lạc hình tròn hoặc hơi lượn sóng giống như giọt nến trắng, lồi, nhẵn, thường có viền quanh khuẩn lạc hoặc vòng ñồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa, màu kem, có khi màu nâu nhạt, có ánh mỡ hay ñục

2.1.3.5 Bacillus polymyxa

Khuẩn lạc không màu, phẳng hoặc lồi, trơn và nhầy, ñôi khi có mép có thùy (Nguyễn Thị Huyền Thu, 2007) Tế bào có kích thước (0,6 – 1,0 x 2,0 – 7,0 µm), ñứng riêng rẽ hay xếp thành ñôi, thành chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên hình quả chanh Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6 µm), trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa tế bào

B polymyxa chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực phẩm ñang bị hỏng

Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Chúng là nguồn ñể sản xuất kháng sinh polymyxin

2.1.3.6 Bacillus aslersporus

Khuẩn lạc của B aslersporus nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm,

nhày, ñồng nhất Trực khuẩn dài (1,0 – 1,2 x 3 – 7 µm) ñứng riêng rẽ hoặc xếp thành

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 11

từng ñôi Bào tử hình trụ kích thước (1,0 x 1,5 - 2 µm), nằm giữa tế bào Khi hình

thành bào tử, tế bào phồng lên một chút trông giống như vi khuẩn Clostridium

2.2 Giới thiệu chung về cellulose và enzym cellulase

2.2.1 Cellulose

Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành phần tế bào thực vật Trong bông nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ khoảng 40 - 50% cellulose trọng lượng khô Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài VSV, chúng tồn tại ở dạng sợi (Nguyễn ðức Lượng, 2004)

Cellulose có hình sợi dài, ñược trùng hợp từ các gốc D-glucose tương ứng với phân tử lượng là 15.000 Trong nước lạnh, nó không hòa tan mà chỉ trương phồng lên Khi ñun sôi với acid sulfuric loãng, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong ñiều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose Cellulose cũng bị thủy phân bởi enzym cellulase do vi sinh vật tiết ra và sản phẩm là cellobiose

Các gốc D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết 1,4- glucoside Tinh bột cũng ñược cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết 1,4- glucoside ðiểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân

chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc ñường và ñược cấu tạo như sau:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 12

Hình 2.2 Cấu tạo phân tử cellulose

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton Các phân

tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết hydro

Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có ñường kính khoảng 3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi Trong ñiều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không ñồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:

- Vùng kết tinh: Các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự ñều ñặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác ñộng của ñiều kiện bên ngoài Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này

- Vùng vô ñịnh hình: Các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander War Ở vùng này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác ñộng bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác ñộng, làm thay ñổi toàn bộ cấu trúc của chúng

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô ñịnh hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại, chứa nhiều cellulose vô ñịnh hình

Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose Một trong những dẫn xuất ñược ứng

Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp 13

dụng rất nhiều là CMC (Cacborxyl Methyl Cellulose), trong đĩ một số nhĩm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH

Hình 2.3 Cấu trúc của CMC

Trong thiên nhiên, khi thực vật và vi sinh vật cĩ chứa cellulose bị chết, cellulose của chúng chỉ bị phân hủy bởi cả một tập đồn vi sinh vật Các lồi VSV sẽ thay phiên nhau thủy phân cellulose để tạo ra mùn và từ đĩ các thành phần cấu tạo của cellulose lại được đi vào các con đường chuyển hĩa trong chu trình chuyển hĩa vật chất hữu cơ của thiên nhiên

Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn Số lượng cellulose thường khơng đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật Người ta thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây

Ở VSV cấu trúc của cellulose khơng bền và khơng theo một trật tự như ở thực vật Ở đĩ, cellulose thường thuộc loại vơ định hình Chính vì thế việc phân hủy chúng thường rất dễ thực hiện

Cellulose được bao quanh bởi phân tử hemicelluloses và lignin nên được gọi là lignocellulose

2.2.2 Lignocellulose

Trong tự nhiên phế liệu chứa lignocellulose là nguồn chất hữu cơ thay thế được tạo

ra trong quá trình quang hĩa ở thực vật Lignocellulose là thành phần chủ yếu của gỗ, giấy và bột giấy Lignocellulose chiếm khoảng 60% tồn bộ phế liệu từ gỗ được sản

xuất trên trái đất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 14

Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày ñặc rất khó ñể phân cắt Tuy nhiên nó

là nguồn giàu carbon và năng lượng hóa học, do ñó việc tận dụng nguồn phế liệu ligno-cellulose là vấn ñề rất cần thiết ñể duy trì vòng tuần hoàn cacbon toàn cầu Về mặt hóa học, chúng gồm 2 polymer cellulose và hemicellulose và một polymer có cấu trúc 3 chiều lignin Cellulose ñược bao quanh bởi phân tử hemicellulose và lignin

Hình 2.4 Cấu trúc của lignocellulose

Lignocellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả cũng như trong các loại mùn cưa, thân cây gỗ mềm, rơm rạ của lúa và lúa mì… ñược cấu tạo chủ yếu từ cellulose, hemicellulose và lignin, một lượng nhỏ pectin, protein, các chất trích ly và tro Thành phần các chất này khác nhau tùy theo loại cây (bảng 2.2)

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của một số loại phế thải nông nghiệp

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 15

Vật liệu lignocellulose chứa hỗn hợp các polymer cacbohydrat (cellulose và hemicellulose), lignin, các chất trích ly và các chất khoáng Khái niệm holocellulose thường ñược sử dụng ñể mô tả tổng cacbohydrat có trong cây

2.2.2.1 Hemicellulose

Hemicellulose là polysaccharide có phân tử lượng nhỏ hơn phân tử lượng của cellulose rất nhiều Chúng thường ñược cấu tạo từ 150 gốc ñường Các gốc ñường này ñược nối với nhau bằng các liên kết -1,4; -1,3; -1,6 glucoside Chúng thường là những mạch ngắn, phân nhánh Cấu trúc của hemicellulose không bền, chúng không hòa tan trong nước nhưng dễ dàng bị phân giải bởi acid loãng hoặc kiềm (Lê Ngọc Tú, 2002) Hemicellulose cũng là thành phần của tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các phần như: vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu ñược các monosaccharide thuộc nhóm hexose như manose, galactose, nhóm pentose như arabinose, xilose Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như mannan, galactan, và pentozan Các polysaccharide như mannan, galactan, araban và xilan ñều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như: gỗ, rơm rạ,…

Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ (chiếm khoảng 30%), cây lá rộng (chiếm khoảng 20-25%) Ở những cây lá kim thường chứa ít xylan

2.2.2.2 Lignin

Lignin là một hợp chất cao phân tử, chúng có nhiều ở thực vật bậc cao Ở cây gỗ, lignin chiếm tới 20-30% Trong thành phần của lignin, carbon chiếm tới 69%, hydro chiếm 7% và oxy chiếm 24% (Palonen, Hetti, 2004)

Lignin có cấu tạo vô ñịnh hình, không tan trong nước và trong acid vô cơ Dưới

Trong thực vật chúng như chất ximang liên kết các tế bào lại với nhau, làm tăng ñộ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 16

bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các ñộc tố, các VSV từ bên ngoài

Trong suốt quá trình phát triển của thực vật, lignin ñược tạo ra, không bị biến ñổi sinh lý Chúng có cấu tạo rất phức tạp, tạo thành từ sự ngưng tụ của các loại rượu khác nhau

Hình 2.5 Cấu tạo phân tử lignin

2.2.3 Enzym cellulase

2.2.3.1 Nguồn gốc của enzym cellulase

 ðược thu nhận từ các nguồn khác nhau:

• ðộng vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…

• Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như ñại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch ñen…

• Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…

 Trong thực tế người ta thường thu nhận enzym cellulase từ vi sinh vật các chủng

vi sinh vật thường sử dụng :

• Nấm mốc: Aspegillus niger, Aspegillus oryzae, Aspegillus candidus…

• Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

• Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilus, Bacillus pumilis…

(Nguyễn ðức Lượng, 2004)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 17

2.2.3.2 Cơ chất của enzym cellulase

Cellulose là cơ chất của enzym cellulase Cellulose là một polysaccharide phong phú nhất trong tự nhiên Việc phân hủy sinh học cellulose bởi vi sinh vật là một trong những bước chính của chu trình carbon trên trái ñất

2.2.3.3 Phân loại enzym cellulase

Tên gọi cellulase dùng ñể chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt hợp chất cellulose Tất cả các enzym cellulase ñều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 ñơn

vị glucose Theo nhà khoa học Wood và Mc Cral (1979) enzym cellulase ñược phân chia theo chức năng thành 3 nhóm sau ñây:

•••• 1,4 - β – D glucanase hay glucanhydrolase (endoglucanase , EC.3.2.1.4), (EG) Enzym này tham gia phân giải liên kết -1,4 glucozit trong cellulose

và -D-glucanase Sản phẩm của quá trình phân giải là xenlodextrin, xellobiose, và glucose

•••• 1,4 - β –D glucancellobiohydrolase (exoglucanase, EC.3.2.1.91), (CBH)

Enzym cắt ñầu cuối của chuỗi cellulose ñể tạo thành cellobiose

•••• β - D glucozit glucohydrolase (β–glucozidase hay cellobiase,

EC.3.2.1.21) Enzym này tham gia phân giải cellobiose và celloligosaccarit tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzym endoglucanase (EG) có tác dụng phân cắt tốt trên cellulose vô ñịnh hình và ñặc biệt có tác dụng trên cellulose biến tính như CMC (carboxyl methyl cellulose), HEC (hydroxyl ethyl cellulose) Vì vậy, ñể xác ñịnh hoạt tính enzym này người ta thường sử dụng cơ chất là CMC Còn các enzym exoglucanase (CBH) thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô ñịnh hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính Trong hệ thống enzym CBH thì enzym CBH I tấn công từ ñầu khử, trong khi CBH II tấn công vào ñầu không khử của chuỗi cellulose

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 18

Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzym trên ðầu tiên enzym EG tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các ñầu cuối của chuỗi Tiếp sau ñó các enzym CBH tiếp tục phân cắt ñể tạo sản phẩm cuối là cellobiose Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzym thứ ba β - glucozidase Vì vậy tuy rằng enzym β-glucozidase không có tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng nó vẫn ñược xếp vào hệ thống enzym cellulase

2.2.3.4 Cấu trúc của enzym cellulase

Cellulase có bản chất là protein ñược cấu tạo từ các ñơn vị là axit amin, các axit amin ñược nối với nhau bởi các liên kết peptid –CO-NH Ngoài ra, trong cấu trúc còn

có những phần phụ khác Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzym nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một ñuôi tận cùng, phần ñuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và ñược gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối ñuôi là vùng gắn kết cellulose CBD (cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình thủy phân cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzym và ái lực của các enzym này ñối với cellulose Hơn nữa, hoạt tính của cellulase và khả năng kết hợp của CBD với cellulose ðiều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính CMCase ñối với tinh thể cellulose Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzym cellulase thực hiện việc cắt ñứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay ñổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng ñến hoạt tính xúc tác của các enzym

2.2.3.5 Tính chất của enzym cellulase

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC) Cellulase cắt liên kết β-1,4-

glucozit trong cellulose, lichenin và các β-D-glucanase của ngũ cốc

ðộ bền nhiệt và tính ñặc hiệu cơ chất có thể khác nhau Cellulase hoạt ñộng ở pH

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 19

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và

bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức ñộ nhẹ

Trọng lượng của các enzym cellulase thay ñổi từ 30-110 KDa (Begunin và cộng

sự, 1991)

2.2.3.6 Cơ chế tác dụng của enzym cellulase

 Cơ chế 1,4-β-D-glucanase hay endoglucanase (EG, EC 3.2.1.4)

Enzym này còn có tên gọi khác như: endo-1,4- β-D-glucanase, Endo-1,4 gluconase, β-1,4-endoglucanhydrolase, carboxymethyl cellulase, xenludextrinase, cellulase A, xenlulosin AP, Alkali cellulase…

Enzym này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4 – β – D glucozit giữa mạch của chuỗi cellulose, lichenin và các β – D glucanase của ngũ cốc

Hình 2.6 Cơ chế hoạt ñộng của endoglucanase (EG)

 Cơ chế 1,4-β-D-glucancellobiohydrolase hay exoglucanase (CBH, EC 3.2.1.91) Enzym này có tên gọi khác như: exo-β-1,4-glucanase, cellobiohydrolase, exo-cellobiosidase, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan cellobiosidase, cellobiosidase…

Enzym này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ ñầu không khử của chuỗi cellulose ñể tạo thành cellulobiose

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 20

Hình 2.7 Cơ chế hoạt ñộng của exoglucanase (CBH)

 β – D glucozit glucohydrolase (EC.3.2.1.21)

Enzym này có tên khác như là: β - glucozidase, β - D glucozidase…

Enzym này thủy phân liên kết β – D glucozit không khử ở ñầu tận cùng ñể phóng thích ra gốc D – glucose

Hình 2.8 Cơ chế hoạt ñộng của β - glucozidase

2.2.3.7 Sự thủy phân cellulose bởi enzym cellulase từ vi sinh vật

Trong thiên nhiên cũng tồn tại những loài VSV chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzym trong hệ enzym cellulase Hoạt tính enzym này thường mạnh hơn các loại enzym còn lại Chính vì thế, trong ñiều kiện tự nhiên, một loài VSV không thể

tham gia thủy phân triệt ñể cellulose ñược (Lương ñức phẩm, 2009)

Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzym ñến nghiên cứu tác ñộng tổng hợp của cả 3 loại enzym cellulase, nhiều tác giả ñều ñưa ra kết luận chung là các loại enzym cellulase sẽ thay phiên nhau thủy phân cellulose ñể tạo sản phẩm cuối cùng là glucose

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 21

Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong ñiều kiện tự nhiên

thường bị ảnh hưởng bởi tác ñộng nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài

phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu Chính vì thế, việc thủy phân cellulose

trong tự nhiên thường tiến hành không ñồng bộ, xảy ra rất chậm

Hệ vi sinh vật thủy phân xác thực vật chủ yếu là cellulose khá phong phú, gồm

có vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc Chúng có khả năng tiết vào môi trường enzym

thủy phân là các cellulase Cellulase gồm hai enzym exo- và endoglucanase ðây là hai

enzym tác dụng vào phân tử cellulose (glucan) Ở các vị trí khác nhau: endoglucanase

mạch thẳng, ñể tạo thành các ñơn vị cấu thành là ñường ñôi cellobiose gồm hai

glucose ðường này tan trong nước và bị tác dụng của β-glucozidase chuyển thành

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 22

công vào ñầu ñoạn chuỗi ñã mở tạo ra các cellobiose và tiếp theo là tác ñộng của glucozidase lên cellobiose ñể tạo thành glucose

β-Do ñó, thủy phân cellulose tự nhiên phải có tác ñộng hiệp ñồng của ba enzym là endoglucanase, exoglucanase, và β-glucozidase

Theo quan niệm mới, cellulase gồm hai loại enzym là endocellulase (endoglucanase) và exocellulase (exoglucanase) Tác dụng của chúng lên cellulose ñược mô tả (hình 2.10)

Lutzen ñã lập mô hình phân giải cellulose (N.V.Lutzen & M.H.Nielson, 1983) như sau:

Hình 2.10 Mô hình phân hủy cellulose của Lutzen

(1) Thủy phân trực tiếp do tác dụng của exoglucanase

(2) Thủy phân do tác dụng phối hợp của endoglucanase và cellobiohydrase (3) Thủy phân trước tiên do tác ñộng của endoglucanase và sau là của

exoglucanase

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 23

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase ở vi sinh vật

2.2.4.1 Giống vi sinh vật

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến sự hình thành cellulase và lượng cellulase của

vi sinh vật như: chủng VSV, môi trường dinh dưỡng, ñiều kiện nuôi cấy…Trong các yếu tố trên thì chủng VSV là ñiều kiện ñầu tiên và cơ bản nhất

Không phải các chủng VSV ñều có khả năng tổng hợp enzym như nhau Ngay cả những chủng cùng chi, thậm chí là cùng loài cũng rất khác nhau về enzym do chúng sinh ra Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng VSV có khả năng tạo nhiều enzym là

vô cùng quan trọng

Bên cạnh việc tuyển chọn giống có khả năng sinh enzym cao, thì việc cung cấp các chất dinh dưỡng và tiến hành nuôi cấy trong ñiều kiện tối ưu cũng rất quan trọng

2.2.4.2 Nguồn dinh dưỡng

Việc lựa chọn các nguồn dinh dưỡng và nồng ñộ của chúng trong môi trường phụ thuộc vào ñặc tính sinh lý của từng chủng, từng loài VSV và ñiều kiện nuôi cấy chúng

• Ảnh hưởng nguồn cacbon

Theo lý thuyết sinh tổng hợp enzym cảm ứng trong môi trường nuôi cấy các vi sinh vật sinh cellulase nhất thiết phải có cellulose và nguồn cacbon

Những nguồn cellulose có thể là CMC, bột cellulose, giấy lọc, bông, lõi ngô, cám, mùn cưa, bã củ cải, rơm, than bùn…là những hợp chất cacbon không tan trong nước thì VSV hấp thụ quanh bề mặt của chúng và phân giải chúng dần dần

Các nguồn cacbon khác (glucose, cellubiose, axetat, xitrat, oxalate, xucxinat và những sản phẩm trung gian của vòng Krep) có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cellulase Song trong môi trường với nồng ñộ glucose rất ít có tác dụng kích thích

VSV phát triển và tạo thành enzym (Lương ðức Phẩm, 1978)

• Ảnh hưởng nguồn nitơ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 24

Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin ñể cấu tạo nên các protein cấu trúc cho các phân tử của enzym Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy có thể là nitơ vô

cơ hoặc nitơ hữu cơ Các nguồn nitơ hữu cơ là những nguyên liệu giàu ñạm như cao ngô, cao nấm men, pepton, bột ñậu tương, khô lạc, khô ñậu,…

Các nguồn nitơ vô cơ thường dùng cho các VSV sinh cellulase là muối nitrat Các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzym này thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì rằng trong môi trường các muối này làm cho môi trường axit hóa ðiều này không những ức chế quá trình sinh tổng hợp enzym, mà còn có thể làm mất hoạt tính enzym sau khi tạo thành

Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau ñến sinh trưởng tổng hợp cellulase ðiều này phụ thuộc vào ñặc tính sinh lý của từng chủng giống Cao ngô

và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của VSV, nhưng với cao ngô

còn là nguồn cacbon tốt cho VSV Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự

có mặt các axit amin, các nguyên tố khoáng và những nhân tố sinh trưởng khác (Lương ðức Phẩm, 1978)

• ðiều kiện nuôi cấy

Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, các yếu tố sau ñây ảnh hưởng rất lớn ñến sự sinh trưởng và phát triển cũng như là sinh enzym cellulase của VSV

- Nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ có ảnh hưởng rất lớn ñến sự sinh trưởng và phát triển của VSV vì vậy

nó có ảnh hưởng rất lớn ñến khả năng sinh tổng hợp enzym của chúng Mỗi loài VSV

có một giá trị nhiệt ñộ tối ưu mà tại nhiệt ñộ ñó VSV có khả năng sinh trưởng, phát

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 25

- pH

pH ban ñầu của môi trường ảnh hưởng không nhỏ ñến sự phát triển và tạo thành enzym ða số nấm mốc phát triển và tạo enzym ngoại bào ở môi trường axit, pH trong khoảng 4-6, trong khi ñó vi khuẩn lại thích hợp trong môi trường trung tính pH môi trường không chỉ ảnh hưởng ñến lượng enzym tổng hợp mà còn ảnh hưởng ñến chủng loại enzym ñược tổng hợp

- Nồng ñộ cơ chất

VSV sử dụng cơ chất có trong môi trường nuôi cấy và tổng hợp enzym Nồng ñộ

cơ chất càng lớn khả năng sinh tổng hợp enzym càng cao Tuy nhiên nồng ñộ cơ chất càng cao áp suất thẩm thấu tạo ra trong môi trường nuôi cấy càng lớn, áp suất này gây

ức chế sự sinh trưởng và phát triển của VSV Vì vậy, VSV chỉ phát triển tốt ở giá trị nồng ñộ cơ chất nhất ñịnh

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn ñến sự hình thành enzym ðối với ña số nấm mốc khi nuôi ở môi trường xốp, sự tạo thành thường kết thúc khi nấm mốc bắt ñầu sinh bào tử, thời gian kết thúc sự tạo thành enzym ngoại bào thường từ 30 - 42 giờ Còn ñối với vi khuẩn, sự tạo thành enzym ngoại bào tốt nhất từ khoảng 40 - 50 giờ Còn nuôi cấy chìm sinh trưởng của chủng giống ñạt cực ñại tới pha ổn ñịnh trước, khoảng từ 5 ñến 8 giờ sau thì hoạt ñộ enzym ngoại bào ñạt cực ñại

- Nồng ñộ oxy

Do sống trong môi trường hiếu khí nên hàm lượng oxy cũng là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzym Lượng oxy trong môi trường nuôi cấy ñược ñiều khiển bằng tốc ñộ máy lắc và lượng khí sục vào môi trường

2.2.5 Một số ứng dụng của enzym cellulase

Mặc dù ñược nghiên cứu sau các enzym khác như protease, amylase (những năm 1980), nhưng cellulase ñã ñóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực ñời sống Cellulase ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp sản xuất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 26

chấy tẩy rửa (Lê Xuân Phương, 2001), công nghiệp thực phẩm - bánh kẹo - ñồ uống

2.2.6 Thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ môi trường nuôi cấy

Các chế phẩm enzym ñược sử dụng thực tế ở nhiều dạng khác nhau Trong một

số trường hợp, enzym có thể ñược sử dụng ở dạng thô mà không cần phải tách chiết tinh khiết như ñưa vào bột giặt, thuộc gia …Một số khác, người ta lại cần sử dụng các enzym tinh khiết ở nhiều mức ñộ khác nhau nên phải tách chiết, tinh chế Enzym rất dễ

bị mất hoạt tính, vì vậy khi tinh chế enzym cần tránh gây biến tính protein làm ảnh hưởng ñến hoạt tính của enzym nên cần tiến hành nhanh trong ñiều kiện nhiệt ñộ thấp,

ñộ pH phù hợp…Việc thu chế phẩm enzym cần phải qua các bước sau (Lương ðức Phẩm, 1998)

2.2.6.2 Thu chế phẩm kỹ thuật

Chế phẩm enzym kỹ thuật là chế phẩm enzym chưa tinh chế có thể chứa 1 hoặc 1 vài enzym chủ yếu ngoài ra trong ñó còn có các protein không hoạt ñộng, các chất ổn ñịnh… Thường ñược dùng trong công nghiệp và nông nghiệp

ðể thu ñược chế phẩm kỹ thuật người ta tiến hành cô ñặc các dịch enzym trong thiết bị có ñộ chân không cao Sau ñó:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 27

NaCl, glixerol… và thu chế phẩm

- Hoặc bổ sung thêm các chất ổn ñịnh rồi ñem sấy và thu chế phẩm

- Hoặc cho kết tủa enzym bằng muối trung tính hoặc cồn, ly tâm lấy cặn, rồi cho thêm chất ổn ñịnh, ñem sấy khô, nghiền mịn và thu chế phẩm

2.2.6.3 Thu chế phẩm enzym tinh khiết

Việc thu chế phẩm enzym có thể tiến hành qua nhiều phương pháp ðầu tiên loại các protein không hoạt ñộng khỏi dịch enzym bằng phương pháp làm biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH và nhiệt và tách chúng ra bằng cách ly tâm hoặc lọc bỏ kết tủa Có thể phương pháp tách phân ñoạn khác nhau nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ, muối, hấp phụ chọn lọc, trao ñổi ion ñể thu những phần có hoạt tính enzym cao nhất

chế phẩm enzym ñể có thể sử dụng lâu dài Việc thu chế phẩm enzym tinh khiết và nhất là dạng tinh thể thường rất khó khăn và tốn kém nên chỉ dùng trong y học hoặc trong nghiên cứu

2.3 Tình hình nghiên cứu enzym cellulase

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt ñầu từ những năm 1950 Cuối thé kỷ XIX ñã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các vi sinh vật một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một số tác giả như: trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp (Lusta và cộng sự, 1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium lini, Penicilium funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990) Năm 2000 Mawadza và cộng sự ñã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính ñặc hiệu cao bao gồm phức hệ enzym: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân hoàn toàn cellulose

Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì Bacillus

là chủng có khả năng sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và ñược quan tâm

nghiên cứu nhiều hơn cả là B subtilis (Park và cộng sự, 1991), B polymxa, B cereus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 28

(Robson & Chambliss, 1989), B pumilus (Chistakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus

sp KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) những nghiên cứu này chỉ mới dừng lại ở phân lập

và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần ựây ở Việt Nam ựã có một số nghiên cứu về vi sinh vật thủy phân cellulose và cellulase (đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003; Trịnh đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006) Những nghiên cứu này chủ yếu ựề cập vấn ựề phân lập các chủng VSV và ựánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường ựến khả năng sinh tổng hợp cellulase như tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase và tinh sạch, ựánh giá tắnh chất hóa lý của cellulase từ chủng penicillium sp DTQ Ờ HK1 (Trịnh đình Khá và cộng sự, 2007) Nghiên cứu phân loại

cộng sự, 2006)

Từ các nghiên cứu trên cho thấy ở Việt Nam hiện nay chưa có công trình nào công bố về việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh cellulase từ vi khuẩn

ỔỔBacillus subtilis Vì thế việc : nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng

Bacillus subtilisỖỖ nhằm thu thập các vi khuẩn B sutilis có khả năng sinh tổng hợp

cellulase cao và tinh sạch ựể thu ựược chế phẩm có hoạt tắnh cao là rất cần thiết