Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tannase từ các chủng nấm mốc

“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” MỞ ĐẦU Ngày với phát triển ngành công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng nhiều lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế,… Trong thực tế, việc sử dụng enzyme lĩnh vực không so với ý nghĩa việc sử dụng lượng nguyên tử Theo thống kê, hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với giá trị 500 triệu USD ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzyme sử dụng phổ biến amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucose oxydase Trong lĩnh vực sản xuất đồ uống, vấn đề thu hút nhiều quan tâm vấn đề đục cặn sản phẩm Nguyên nhân thành phần nguyên liệu lựa chọn để sản xuât đồ uống chứa hàm lượng tannin cao chưa xử lý Tannin có nhiều trái cây, rau ăn chúng thường coi thành phần không mong muốn, gây vấn đề công nghệ tạo thành phức hợp với tinh bột, protein, enzyme tiêu hóa làm giảm giá trị cảm quan dinh dưỡng thực phẩm Do đó, ứng dụng chế phẩm enzyme tannase sản xuất đồ uống từ loại giàu tannin nâng cao chất lượng sản phẩm Ngoài ngành công nghiệp thuộc da thành phần nước thải giàu tannin, chất béo, protein,… Hiện người ta sử dụng số enzyme enzym lipase để phân giải chất béo, enzym protease kiềm tính để phân giải protein, hàm lượng tannin nước thải chưa được xử lí Vì vậy, sử dụng enzym tannase phân giải tannin giai đoạn xử lí sinh học cho phép xử lí nước thải ngành công nghiệp thuộc da triệt để Từ nhu cầu cấp thiết tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tannase từ chủng nấm mốc Aspergilllus theo phương pháp lên men rắn”, với mục tiêu sau: Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Mục tiêu đề tài - Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzyme tannase cao - Nghiên cứu điều kiện lên men tạo emzyme tannase theo phương pháp lên men rắn Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu đặt ra, thực nội dung nghiên cứu sau: - Phân lập lựa chọn chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp emzyme tannase cao từ nguồn nguyên liệu tự nhiên - Lựa chọn môi trường thích hợp cho trình sinh tổng hợp enzyme tannase phương pháp lên men rắn - Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp sinh tổng hợp emzyme tannase cao Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzyme tannase Enzyme tannase hay gọi acyl tannin hydrolase (EC 3.1.1.20) Đây enzym thủy phân hoạt động nguồn chất tannin, có khối lượng phân tử khoảng 150 kDa đến 300 kDa tùy thuộc nguồn enzyme Bảng 1.1: Khối lƣợng phân tử hàm lƣợng carbohydrat tannase Vi sinh vật Khối lƣợng phân tử (Da) Hàm lƣợng cacbohydrat (%) Tài liệu tham khảo Aspergillus flavus 192 000 25,4 Yamada et al, 1968; Adachi et al, 1971 Aspergillus oryzae 186 000 43 Barthomeruf et al, 1994; Parthasarathy & Bose, 1976 Aspergillus niger 300 000 22,7 Hatamoto et al, 1996; Abdel – Naby et al, 1999 Candida sp.K-1 250 000 61,9 Akio et al, 1976 Chryphonectria parasitica 240 000 64 Akio et al, 1976 Gỗ sồi Peduculate 300 000 Chưa xác định Niehaus et al, 1997 Nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ enzyme khoảng 35- 60oC pH tối ưu 3,58 tùy thuộc vào nguồn enzym Enzyme tannase ổn định vài tháng 30oC Tannase có điểm đẳng điện 3,8 Enzyme tannase xúc tác thủy phân liên kết este liên kết depside có tannin thủy phân để tạo thành glucose axit gallic Ngoài ra, enzyme tannase xúc tác thuỷ phân liên kết este có mặt hợp chất tannin axit tannic, metyl gallate, etyl gallate, n-propylgallate izoamylgallate Phản ứng Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” xúc tác điển hình tannase phá vỡ cầu nối hydro epigallocatechin-3-ol gallate Theo nghiên cứu Libuchi et al, 1972 tannase thuỷ phân hoàn toàn axit tannic (I) thành axit gallic glucose thông qua 2,3,4,6 tetragalloyl glucose (III) hai kiểu monogalloyl glucose (IV) Hình 1.1: Con đƣờng thuỷ phân axit tannic enzyme tannase 1.1.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme tannase 1.1.1.1 Ảnh hƣởng pH Hoạt độ xác tác enzyme phụ thuộc nhiều vào giá trị pH môi trường Enzyme từ nguồn khác có khoảng pH thích hợp khác Ví dụ, enzyme tannase phân lập từ nấm mốc Aspergillus niger có pH tối ưu nằm khoảng từ 5,0 – 6,0 hoạt động ổn định khoảng rộng từ 3,5 – 8,0 Enzyme Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” tannase phân lập từ Chryphonectria parasitica có pH tối ưu 5,5 (Libuchi et al, 1968), từ Candida sp có pH tối ưu 6,0 hoạt độ ổn định phạm vi rộng pH 3,5 – 7,5 (Akio et al, 1976) Tannase thực vật phân lập từ sồi Penduculate có phạm vi pH rộng với pH tối ưu khoảng 5,0 Ngay enzyme ủ 24h pH 5,0 hoạt độ trì ổn định tốt (Madhavakríhna & Bose, 1962) 1.1.1.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ Hoạt độ xúc tác enzyme tăng tăng nhiệt độ phản ứng, vùng nhiệt độ giới hạn Theo nghiên cứu trước đây, tùy vào chủng phương thức nuôi cấy mà enzyme tannase có dải nhiệt độ tối ưu 30 60oC Nhiệt độ tối ưu ổn định tannase phân lập từ sinh vật khác thể bảng sau: Bảng 1.2: Nhiệt độ tối ƣu ổn định enzym tannase Vi sinh vật Nhiệt độ tối Nhiệt độ ổn ƣu định Tài liệu tham khảo Tannase từ nấm mốc Aspergillus flavus 50 -60oC ≤ 70oC Yamada et al,1968; Pourrat et al,1982 Aspergillus oryzae 30 – 40oC 55oC Beverini Metche, 1990; Libuchi et al,1968 Aspergillus niger 35oC ≤ 50oC Haslam Tanner, 1970 Tannase từ vi khuẩn Penicillium 30 -40oC 45oC 1983 chrysogenum Chryphonectria Rajakumar Nandy, 30oC 25 – 40oC Farias et al,1992; Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Libuchi et al, 1968 parasitica Tannase từ nấm men Candida sp.K-1 Candida sp.K- Candida sp.K- Candida sp.K-1 1 Tannase từ thực vật gỗ sồi Peduculate 35 40oC ≤ 50oC Niehaus Gross, 1997 1.1.1.3 Ảnh hƣởng ion kim loại Một số nghiên cứu cho thấy enzyme tannase hoạt hóa số kim loại Ca2+, Fe2+, Na+, Mg2+ Hg+( N Lokeswari and K Jay Raju ,2007) số ion khác Ba2+, Ca2+, Zn2+, Hg2+, Ag+,…lại ức chế hoạt tính tannase (Alevden_Z öztürk ,2006) 1.4.4.3 Ảnh hƣởng chất Ảnh hưởng nồng độ chất axit tannic môi trường nuôi cấy tới sinh trưởng tổng hợp tannase vi sinh vật nghiên cứu điều kiện phòng thí nghiệm Khi tăng nồng độ chất cảm ứng axit tannic môi trường nuôi cấy tăng cường khả sinh tổng hợp enzyme tannase Nếu nồng độ chất cảm ứng tannic cao gây ức chế sinh trưởng vi sinh vật dẫn tới hoạt tính tannase tổng hợp giảm theo (Ruth Belmares , 2004) 1.1.2 Các nguồn thu nhận enzyme tannase 1.1.2.1 Nguồn tannase từ thực vật Các loài thực vật giàu tannin có hàm lượng enzyme tannase cao Trong thực tế, loại thực vật giàu tannin thuỷ phân tannin ngưng tụ sử dụng làm nguồn để thu nhận enzyme tannase Các thành phần nằm mô riêng biệt (Lekha Lonsane, 1997) Enzyme tannase nằm vỏ Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” thực vật Một số thực vật có chứa hàm lượng tannin cao như: Myrobolan (Terminalia chebuna), Divi Divi (Caesalpinia coriaria), gỗ sồi (Quercus rubra) từ Karee (Rhus typhina)… Nghiên cứu vai trò enzyme tannase thực vật Madhavakrishna et al (1960) cho sinh trưởng thực vật tổng hợp lượng lớn axit gallic, axit chebulinic axit hexahydroxyphenic bị este hoá với glucose xúc tác tannase để tạo thành tannin phức tạp Khi có tượng rụng hoạt động liên kết este tannase góp phần tích cực vào việc thuỷ phân tannin Mặt khác, thành phần tannin giúp cho thực vật tự bảo vệ chống lại xâm nhập vi sinh vật công động vật ăn cỏ Khi thực vật bị công thực vật ăn cỏ tế bào bị số phần làm cho tannase tiếp xúc với tannin thuỷ phân tannin thành chất độc hại thực vật bậc cao 1.1.2.2 Nguồn enzyme tannase từ động vật Đã có số nghiên cứu có lượng nhỏ enzym tannase tìm thấy niêm mạc cỏ gia súc, ví dụ màng niêm mạc ruột non bò Ngoài ra, tannase sản sinh ấu trùng nốt sần phát triển nốt sần thực vật để thuỷ phân axit tannic (Lekha Lonsane, 1997) 1.1.2.3 Nguồn enzym tannase từ vi sinh vật Vi sinh vật nguồn cung cấp enzym vô quan trọng Tannase từ nấm mốc hoạt động tốt việc làm giảm tannin thuỷ phân, tannase từ nấm men lại làm giảm axit tannic tốt có lực thấp với tannin tự nhiên (Deschamps et al, 1983) Nhiều tác giả chứng minh nấm sợi có khả phân giải tannin nguồn cacbon (Lewis & Starkey, 1969; Hadi et al, 1994) Trong tất vi sinh vật có khả tạo enzyme tannase Aspergillus có khả sản xuất enzyme thương mại hiệu Chryphonectria parasitica phát gây bệnh bạc hạt dẻ Mỹ, tỷ lệ tăng trưởng loại nấm mốc đóng vai trò quan trọng sinh bệnh học vi nấm trình hình thành bệnh bạc Sự tăng trưởng cho thấy loại Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” nấm mốc sử dụng chất tannin có nhiều vỏ hạt dẻ Điều cho thấy, loại nấm mốc sử dụng tannin vỏ nguồn cacbon hữu trình nhiễm bệnh Chất tannin vỏ đóng vai trò quan trọng, nhạy cảm với bệnh bạc hạt dẻ Enzyme tannase từ vi khuẩn thuỷ phân tannin tự nhiên axit tannic hiệu (Deschamps et al, 1983; Lewis Starkey, 1969) Deschamps (1983) phát thấy khả phân giải tannin tannase ngoại bào giải phóng axit gallic glucose Tác giả chứng minh chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Bacillus polymyxia Klebsiella planticola sản xuất tannase ngoại bào từ vỏ hạt dẻ nguồn cacbon Sự phong phú nhóm vi khuẩn phân giải tannin tìm thấy đường tiêu hoá động vật nhai lại (Deschamps et al, 1983) Sự phân giải tannin từ nấm men không sâu vào nghiên cứu Aoki et al, (1976) phân lập báo cáo suy thoái gallotannin loài nấm men Candida sản xuất enzyme tannase Tannase từ nấm men thuỷ phân liên kết este depside từ axit tannic để tạo thành axit gallic glucose Bảng 1.3: Các vi sinh vật có khả sản sinh tannase (Bhat et al, 1998) Nguồn vi sinh vật Tài liệu tham khảo Vi khuẩn Bacillus pumilis Deschamps et al, 1983 Bacillus polymyxa Deschamps et al, 1983 Corynebacterium sp Deschamps et al, 1983 Nấm mốc Bradoo et al, 1996 Aspergillus oryzae Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Aspergillus niger Bradoo et al, 1996 Rhizopus oryzae Hadi et al, 1994 Ganga et al, 1977 Penicillium notatum Nấm men Candida sp Aoki et al, 1976 Pichia spp Deschamps & Lebeault, 1984 1.1.3 Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme tannase Trong năm gần nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme tannase từ nhiều loại nấm sợi khác nhau, số chi Aspergillus Penicillium lựa chọn nhiều cho mục đích sinh tổng hợp enzym tannase (Bajpai and Patil, 1997; Banerjee et al, 2001; Pinto et al, 2001) Ngoài sinh tổng hợp tannase nghiên cứu nguồn khác nấm men (Aoki et al; 1976) vi khuẩn (Sivashanmugam and Jayaraman, 2011; Mondal et al, 2000, 2001; sharma and John, 2011) Một số nhà khoa học chứng minh nấm sợi có khả phân giải tannin nguồn cacbon phân giải tannin tăng bổ sung chất trao đổi khác (Lewis & Starkey, 1969; Hadi et al, 1994) Ganga et al (1977) cho Aspergillus niger Penicillium spp tăng trưởng tốt môi trường có chứa đường tannin (Bhat et al, 1997, 1998), điều cho thấy việc bổ sung nguồn cacbon nitơ thúc đẩy việc sản xuất tannase cho phân cắt phân tử tannin để tăng cường giải phóng nguồn cung cấp cacbon Việc sản xuất enzyme tannase từ Aspergillus thực mặt axit tannic môi trường nuôi cấy, loại nấm chịu đựng nồng độ axit tannic cao lên tới 20% mà ảnh hưởng xấu tới phát triển tạo thành enzyme Các nghiên cứu tạo thành enzyme tannase từ Aspergillus thực môi trường khác Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” NH4Cl nguồn nitơ phù hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme tannase môi trường lên men rắn Nồng độ NH4Cl 0,3% cho hoạt tính enzym nhận cao Qua nội dung nghiên cứu chọn thành phần môi trường thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme tannase môi trường gạo hấp chín có bổ sung thành phần sau: + Axit tannic 2% + Glucose 0,1% + NH4Cl 0,3% + KH2PO4 0,2% + MgSO4 0,2% + FeSO4 0,3% 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện lên men đến đến sinh tổng hợp enzyme tannase chủng MKv Ngoài môi trường lên men điều kiện tiến hành trình lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp enzyme Thông thường loài vi sinh vật có điều kiện phát triển tối thiểu, tối thích tốt đa Để lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho trình tạo enzyme tannase cao trạng thái rắn, tiến hành nghiên cứu nuôi mốc điều kiện độ ẩm, độ dày khối môi trường rắn, độ thoáng khí khác Do tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện để lựa chọn điều kiện lên men tối ưu cho trình sinh tổng hợp enzyme tannase 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên men Chúng tiến hành thực trình lên men mốc nhiệt độ là: 25oC, 30oC, 35oC, 40oC khoảng thời gian 44 Kết thúc lên men, thu dịch chiết Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 39 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” enzyme xác định hoạt độ enzyme tannase Kết thể phụ lục hình 3.9 hoạt độ tannase (U/g) 25oC 30oC 35oC 40oC Hình 3.9: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính tannase Có thể thấy khoảng nhiệt độ lên men 30 - 35oC hoạt tính tannase tạo thành cao Nhiều tác giả nhận kết tương tự Để tiết kiệm nhiệt lượng chọn nhiệt độ 300C cho thí nghiệm 3.4.2 Ảnh hƣởng độ ẩm môi trƣờng Độ ẩm môi trường lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sinh trưởng phát triển tạo enzyme chủng nấm mốc Cơm hấp điều chỉnh nước bổ sung để tạo độ ẩm môi trường khác nhau, độ ẩm xác định lại máy đo độ ẩm Độ ẩm môi trường lên men sau hấp cơm xác định lại sau: 37,44%, 41,5%, 46,57%, 50,73% Tiến hành nuôi mốc điều kiện độ ẩm khác khoảng thời gian 44 Xác định hoạt độ enzyme tannase Chúng thu kết thể phụ lục hình 3.10 Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 40 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” hoạt độ tannase (U/g) 37,44 41.5 46.57 50.73 Hình 3.10: Ảnh hƣởng độ ẩm môi trƣờng đến hoạt độ tannase Qua nghiên cứu thấy độ ẩm môi trường hấp có ảnh hưởng lớn đến việc sinh tổng hợp enzyme số khoảng độ ẩm môi trường khảo sát độ ẩm môi trường 41,5% phù hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme tannase Khi cơm hấp bị ướt, lợi cho việc sinh tổng hợp enzyme, môi trường ẩm ảnh hưởng đến phát triển nấm mốc, môi trường khô yếu tố ức chế phát triển sinh tổng hợp enzyme tốt nấm mốc Như việc hấp cơm làm chất mang cho trình lên men rắn cần trọng để đảm bảo cho cơm chín đồng độ ẩm khoảng 41,5% thích hợp làm môi trường cho trình lên men trạng thái rắn sinh tổng hợp enzyme tannase 3.4.3 Ảnh hƣởng độ dày khối ủ Độ dày khối ủ yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men tạo enzyme Độ ẩm môi trường trì khoảng 41%, lên men 30oC thực trình lên men độ dày khác nhau: 1cm, 2cm, 3cm, 4cm thời gian 44 Kết thúc lên men, thu dịch chiết enzyme xác định hoạt độ enzyme tannase Kết thể phụ lục hình 3.11 Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 41 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” 7.8 7.7 7.6 7.5 hoạt độ tannase (U/g) 7.4 7.3 7.2 7.1 1cm 2cm 3cm 4cm Hình 3.11: Ảnh hƣởng độ dày khối ủ đến hoạt tính tannase Có thể thấy nuôi mốc độ dày mỏng khả sinh tổng hợp enzyme cao so với nuôi dày, khoảng khảo sát độ dày cm cho hoạt tính tannase cao Tuy nhiên độ dày cao hoạt tính enzyme không bị ảnh hưởng nhiều giảm không đáng kể, điều thuận lợi cho trình sản xuất phụ thuộc điều kiện thiết bị nhà xưởng độ dày nuôi cấy khó khống chế xác Lý việc giảm nhẹ hoạt tính enzyme nuôi dày việc ảnh hưởng trình thông khí Điều hoàn toàn khắc phục kết hợp với việc đảo trộn thông khí 3.4.4 Ảnh hƣởng mức độ thông khí trì ẩm bề mặt môi trƣờng Để tìm hiểu ảnh hưởng mức độ thông khí việc trì ẩm bề mặt khối nuôi đến việc sinh tổng hợp enzyme tiến hành nuôi mốc mức độ thông khí trì ẩm bề mặt khác nhau, thí nghiệm thực độ dày 2cm bố trí sau: Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 42 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Mẫu : Không đậy vải ẩm khay Mẫu : Đậy vải ẩm, không đảo mốc Mẫu 3: Đậy vải ẩm ,Đảo mốc 4h/ lần Mẫu : Đậy vải ẩm , Đảo mốc 8h/ lần Quá trình lên men thực thí nghiệm trước Kết thúc lên men, thu dịch chiết enzyme xác định hoạt độ enzyme tannase Kết nhận thể bảng 3.9 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng mức độ thông khí trì ẩm bề mặt tới sinh tổng hợp enzyme tannase Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) 7,52 7,61 7,45 7,68 Việc đậy vải ẩm bề mặt khay nuôi để trì độ ẩm môi trường không khí tránh tượng khô bề mặt có tác dụng định tới việc thúc đẩy việc sinh tổng hợp enzyme so với không đậy vải, nhiên điều chủ yếu ảnh hưởng đến lớp môi trường bề mặt khay nuôi lớp môi trường phía không ảnh hưởng việc phủ vải làm tăng nhẹ đến hoạt tính enzyme Khi đảo trộn thông khí mức độ giờ/ lần có thúc đẩy sinh tổng hợp enzyme, đảo nhiều tác dụng lại ngược lại, nguyên nhân chủ Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 43 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” yếu việc đảo nhiều làm khô môi trường nhanh nên dẫn tới độ ẩm môi trường giảm làm giảm hoạt tính enzyme Việc đảo trộn phụ thuộc vào độ dày khối ủ, nuôi dày việc đảo trộn cần thiết để tăng cường tiếp xúc oxy cho khối môi trường rắn phía đồng đều, nuôi mỏng việc đảo trộn thiết cần áp dụng Như việc trì độ ẩm bề mặt khối lên men cần thiết, việc đảo trộn tùy thuộc vào mức độ dày khối, nuôi độ dày 2cm nên đảo giờ/ lần 3.4.5 Xác định động thái sinh tổng hợp enzyme tannase chủng nấm mốc MKv Chúng tối tiến hành nuôi chủng nấm mốc MKv nhiệt độ 300C Lấy mẫu đặn cách 12 giờ/lần xác định hoạt lực enzyme tannase tạo thành môi trường theo thời gian nuôi Trên sở xác định thời điểm lên men thu nhận enzyme tannase Kết thể phụ lục hình 3.12 hoạt độ tannase (U/g) 12h 24h 36h 40h 44h 48h 60h 72h Hình 3.12 Động thái sinh tổng hợp enzyme tannase chủng MKv Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 44 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Kết cho thấy hoạt độ enzyme tannase tăng nhanh khoảng thời gian từ 24h đến 44h, sau 44h hoạt độ emzyme giảm dần Điều tương ứng với trình phát triển nấm mốc, giai đoạn nấm mốc phát triển,môi trường dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, ảnh hưởng đến hoạt độ emzyme tannase Vì vậy, chọn thời gian nuôi mốc chủng MKv 44 Tổng hợp kết nhận phần này, chọn điều kiện lên men tốt cho lên men rắn tạo enzyme tannase chủng MKv sau: + Nhiệt độ lên men 30oC + Độ ẩm môi trường lên men khoảng 41,5% + Độ dày khối ủ tốt cm, nhiên tiến hành lên men độ dày cao kết hợp thêm thông khí khoảng giờ/ lần + Nên trì ẩm bề mặt khối nuôi cách đậy vải ẩm để tránh khô bề mặt Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 45 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” KẾT LUẬN Kết nhận thời gian nghiên cứu luận văn cho phép em rút số kết luận sau: Tuyển chọn 01 chủng nấm mốc Aspergillus niger MKv có khả sinh tổng hợp enzym tannase cao từ 11 nguyên liệu giàu tannin 03 chủng nấm mốc Trung quốc Lựa chọn thành phần môi trường thích hợp cho lên men rắn chủng MKv sinh tổng hợp enzym tannase: + Axit tannic 2% + Glucose 0,1% + NH4Cl 0,3% + KH2PO4 0,2% + MgSO4 0,2% + FeSO4 0,3% Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho lên men rắn chủng MKv sinh tổng hợp enzym tannase: + Nhiệt độ lên men 30oC + Độ ẩm môi trường lên men khoảng 41,5% + Độ dày khối ủ tốt cm, nhiên tiến hành lên men độ dày cao kết hợp thêm thông khí khoảng giờ/ lần + Nên trì ẩm bề mặt khối nuôi cách đậy vải ẩm để tránh khô bề mặt Thời gian dừng lên men thu hồi enzym tannase 44h Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 46 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành “Giáo trình nấm học” Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học Lê Đức Ngoan, Nguyễn Thị Hoa Lý, Dư Thị Thanh Hằng(2005) “Giáo trình thức ăn gia súc” Nhà xuất Nông nghiệp, trang 26-27 Phạm Anh Tuấn “ Phân lập tuyển chon chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzymee chitinaza” Luận án kỹ sư, Đại học Mở Hà Nội Tiếng Anh K.C Mondal, D Banerjee, M Jana and B R Pati (2001) Colorimetric assay method for determination of the tannin acyl hydrolase Vidyasagar University, Mydnapore 721 102, West Bengal, India, pp 168-171 N Lokeswari and K Jay Raju (2007) Tannase production by Aspergillus niger.Andhra University, Visakhapatnam- 530003 Vinod Chhokar, Seema, Vikas Beniwal, Raj Kumar Salar, K S Nehra, Anil Kumar, and J S Rana Purification and charaaccterization of extracellular tannin acyl hydrolase from Aspergillus heteromorphus MTCC 8818, pp 793799 Ruth Belmares et al (2004) Microbial production of tannase: an enzymee with potential use in food industry Université de Provence, France, pp 857864 Alevden_Z öztürk (2006) Production of tannase by Aspergillus niger Middle East Technical University Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 47 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Jogeswar Satchidananda Purohit, Jayati Ray Dutta, Ranjan Kumar Nanda, Rinto Banerjee (2005) Strain improvement for tannase production from coculture of Aspergillus foetidus and Rhizopus oryzae Indian Institute of technology, pp 795-801 10 Anne D Van Diepeningen Efficient degradation of tannic axít by black Aspergillus species 11 Rakesh Kumar, Jitender Sharma, Randir Singh (2006) Production of tannase from Aspergillus ruber under solid-state fermentation using jamun (Syzygium cumini) leaves Kurushetra University, pp 384-390 12 Chantal barthomeuf (1993) Producton and Charaterization of a tannase from Aspergillus niger LCF Laboratoire de Phamarcognoise et de Biotechnologie, pp 320-323 13 Malini Seth, Subash Chand (200) Biosynthesis of tannase and hydrolysis of tannins to gallic axít by Aspergillus awamori-optimisation of process parameters Indian Institute of technology Delhi, pp 39-44 14 Anoop Batra, R.K.Saxena (2004) Potential tannase producers from the genera Aspergillus and Penicillium University of Delhi South Campus, pp 1553-1557 15 Cristóbal Noé Aguilar (2000) Induction and repression patterns of fungal tannase in solid-state and submerged cultures Universidad Autónama metropolitana- Iztapalapa, Mexico 16 Enemuor, S.C and odibo, F J C (2009) Culture conditions for the production of a tannase of Aspergillus tamarii IMI3888810 Kogi State University, Nigeria, pp 2555-2557 Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 48 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” 17 Shashi sharma, lata Agarwal (2007) Purification, immobilization and characterrization of tannase from Penicillium variable University of Delhi South Campus, pp 2544-2551 18 C Botella, I De Ory (2005) Hydrolytic enzyme production by Aspergillus awamori on grape pomace University of Manchester, pp 100-106 Internet 19 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/bai-giang-thuc-vat-phan-4-.419332.html 20 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghiemdinhtenvk.htm 21 http://www.scribd.com/doc/6600968/CNSH3 22 http://vietsciences.free.fr/timhieu/khoahoc/thucpham/nuoctuong.htm 23 http://www.mibi.uk-j.de/Krankenhaushygiene.html 24 http://www.scribd.com/doc/26035485/10/Ch%E1%BB%8Dnngu%E1%BB%93n-nguyen-li%E1%BB%87u Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 49 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” PHỤ LỤC Phụ lục Ảnh hƣởng nồng độ axit tannic tới sinh tổng hợp enzyme tannase Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) 0% 1,37 1% 1,54 2% 1,98 3% 1,68 Phụ lục Ảnh hƣởng nồng độ glucose tới sinh tổng hợp enzyme tannase Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) 0% 1,93 0,05 % 2,34 0,1 % 2,65 0,15 % 2,62 0,2% 2,59 Phụ lục Hoạt tính enzyme tannase môi trƣờng có bổ sung nồng độ KH2PO4 khác Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) 0% 2,68 0,2 % 3,41 Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 50 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” 0,4 % 3,35 0,6 % 3,20 Phụ lục Hoạt tính enzym tannase môi trƣờng có bổ sung nguồn đạm vô hữu khác Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) Pepton (ĐC) 4,66 NH4Cl 6,68 NH4Cl 0,15%+ 6,31 Pepton 0,15% Cao nấm men 3,43 Ure 4,07 Phụ lục Hoạt tính enzym tannase môi trƣờng nhiệt độ lên men khác Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) 25oC 4,60 30oC 6,71 35oC 6,63 40oC 5,72 Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 51 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Phụ lục Hoạt tính enzym tannase môi trƣờng có độ ẩm khác Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) 37,44% 6,71 41,5% 7,50 46,57% 5,78 50,73% 4,88 Phụ lục Hoạt độ enzym tannase môi trƣờng độ dày khác Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) 1cm 7,73 2cm 7,66 3cm 7,39 4cm 7,36 Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 52 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” Phụ lục Hoạt tính emzym tannase theo thời gian Mẫu Hoạt độ tannase (U/g) 12h 1,20 24h 2,55 36h 4,91 40h 6,52 44h 7,67 48h 7,04 60h 6,11 72h 5,05 Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu 53 ... thích hợp sinh tổng hợp emzyme tannase cao Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Phạm Hoài Thu “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” CHƢƠNG TỔNG... hình nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme tannase từ vi sinh vật giới có thành tựu định nước ta chưa có nghiên cứu việc sinh tổng hợp enzyme tannase từ vi sinh vật công bố chí ứng dụng enzyme tannase. .. Thu 22 “ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ chủng nấm mốc Aspergillus theo phương pháp lên men rắn” 2.3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện lên men tới sinh tổng hợp enzyme tannase Các thí