Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 20 310

BỘ Y TẾ TRUỒNG ĐẠI HỌC Dưpc HÀ NỘI (3303 SO ĐOÀN THỊ DIỄM NGHIÊN CỨU SINH TỐNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 20.310 KHOÁ LUẬN TỔT NGHIỆP DƯỢC SỸ Khoá 2000 - 2005 Giáo viên h n g ^ : PGS.TS CAO VĂN THU Nơi thực : BM Vi sinh Sinh học Thời gian thực : 2/2005 -5/2005 HÀ NỘI - 5/2005 Với lòng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm Cfn đến PGS.TS Cao Vân Thu - người tận tình hướng dẫn tơi thực khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo mơn Vi sinh - Sinh học tồn thể mơn , ban giám hiệu trưòmg ĐH Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành khoá luận Do thời gian hạn chế nên khoá luận khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong đóng góp ý kiến cơ, bạn bè để khố luận tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm Cfn Hà Nội, ngày 25 ứiáng năm 2005 Sinh viên Đoàn Thị Diễm MỤC LỤC Trang Đặt vấn đ ề Phần I Tổng quan 1.1 Đại cưofng kháng sin h 1.1.1 Sơ lược lịch sử phát triển thuốc kháng sinh 1.1.2 Định nghĩa kháng sin h 1.1.3 Quá ưình sản xuất kháng sinh 1.1.4 ứ ig dụng kháng sinh y học 1.1.5 Một số kháng sinh Streptomyces specỉes tổng hợp 1.2 Đại cưcíng xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2.1 Xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm hình thái sinh lý chỉ' Streptomỵcs 1.2.3 Phân loại Streptomyces 1.3 Cải tạo giống vi sinh vật 1.3.1 Chọn lọc ngẫu nhiên 1.3.2 Đột biến nhân tạo 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Giống vi sinh vật 1.4.2 Lên m en 1.5 Chiết tách tinh chế sản phẩm sau lên men .11 1.5.1 Phưcmg pháp chia cắt pha 11 1.5.2 Phưcmg pháp chuyển pha .12 1.6 Một số kết mód nghiên cứu sản xuất kháng sinh 13 1.6.1 Tách đòng xác định cụm gen sinh tổng hợp Bleomycin từ Streptomyces verticilỉus AĨCC ỉ 5003 13 1.6.2 Pumagừingillin, dẫn xuất Fumagillin phân lập từ Aspergillus fumigatus .14 1.6.3 Sản xuất Cephalosporin c nhờ tế bào Cephalosporin acremonium bất động hố bình lên men gián đoạn .14 Phần n Thực nghỉệm kết 16 2.1 Nguyên vật liệu phưcíng pháp thực nghiệm .16 2.1 L Nguyên vật liệu 16 2.1.2 Các phương pháp thực nghiệm 20 2.2 Kết thực nghiệm nhận xét 27 2.2.1 Kết phân loại theo ISP 27 2.2.2 Khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 20310 môi trường phân lập MT3 28 2.2.3 Ảnh hưởng loại môi trường đến khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 0310 28 2.2.4 Kết qủa chọn lọc ngẫu nhiên 30 2.2.5 Kết gây đột biến nhân tạo ánh sáng u v 32 2.2.6 Kết lên men chìm 33 2.2.7 Ảnh hưỏỉng pH đến độ bền vững kháng sinh 33 2.2.8 Lựa chọn dung môi pH thích hợp để chiết kháng sinh từ dịch lọc ỉên men 34 2.2.9 Kết tíiử hoạt tính kháng sinh nội bào 35 2.2.10 Thử hoạt tính chống nấm Streplomyces 20.310 35 2.2.11 Thử độ bền nhiệt kháng sinh dịch lên men .35 2.2.12 Kết sắc ký lớp mỏng 36 Phần n i Kết luận đề xuất 37 3.1 Kết iuân .37 3.2 Đề xuất 37 Tài liệu tham khảo Phu lue CHỮ CÁI VIẾT TẮT Asp Aspergillus nìger DMBC 101 Bc Bacillus cereus ATCC 9946 Blm Bleomycin Bp Bacillus pumiỉus ATCC10241 Bs Bacillus subtiỉis ATCC 6633 Cd Candida albicans DMBC 102 D Đường kính vòng vơ khuẩn trung bình DNA Deoxyribose nucleotic acid EC Escherichia coli ATCC 25922 Gy Gray- xám Hairy- tóc rối ISP International Streptomyces Project MT Môi trường MTdd Môi trường dung địch Pro Proteus mirabilis BV 108 Pseu Pseudomonas aeruginosa VM 201 s s Saỉ Spirales -lò xo Salmonella typhi DT 220 Shì Shigeỉỉa flexneri D T 112 Sar Sarcina lutea ATCC 934ỉ sm Smoth- nhẩn sp Spiny- gai Sta Staphylococcus aureus ATCC Ỉ228 VK Vi khuẩn vsv Vi sinh vật wa warty- xù xì Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh ĐẶT VẤN ĐỂ Trong chăm sóc sức khoẻ cộng đồng, bệnh nhiễm khuẩn vấn đề y tế chủ yếu - cãn nguyên hàng đầu gây tử vong, hàng năm cướp 17 triệu sinh mạng đa số trẻ nhỏ Năm 1928, việc tình cờ phát tác dụng Penicillin Alexander Fleming tạo cách mạng to lớn ưong y học thực hành Lồi người tưởng khỏi bệnh nhiễm khuẩn đưa kháng sinh vào điều trị Tuy nhiên, ngày nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh xuất Tổ chức y tế giới nhận định ràng xuất vi khuẩn kháng thuốc nhanh hcfn so với khả tìm nhũng thuốc kháng sinh có hiệu ỉực vói vi khuẩn [4] Trong chạy đua giành ưu thế, cách khác nhau, ngưcd cố gắng tìm loại kháng sinh có hiệu lực cao hcín điểu trị bệnh nhiễm khuẩn Trong đó, kháng sinh từ xạ khuẩn nhà khoa học quan tâm tìm kiếm nhiều Tại môn Vi sinh-Sinh học trường ĐH Dược Hà Nội tiến hành phân lập nghiên cứu số chủng Streptomyces có đất Việt Nam Qua số kết thử nghiệm ban đầu chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 20.310'" vód mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống, điều kiên nuôi cấy điều kiện lên men tối ưu - Nghiên cứu sơ phưcíng pháp tách tinh chế kháng sinli “ Nghiẽn cứu đặc điểm hình thái sinh lý nhằm phân loại định tên chủng Streptomyces 20.310 Phần I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Sơ lược lịch sử phát triển thuốc kháng sinh [4], [8] Những năm đầu kỷ XX, nhiễm khuẩn nguyên gây bệnh tử vong Việc phát Penicillin Alexander Fleming (1928) coi khởi đầu thời đại kháng sinh hiên đại Tuy nhiên đến năm 1940 Chain Florey nghiên cứu thành cơng phưcíng pháp sản xuất Penicillin G Việc đưa kháng sinh vào điều trị đáp ứng yêu cầu chiến II-, khơng nghi ngờ hiệu kháng sinh ưong điéu trị bệnh nhiễm khuẩn Trong 30-40 năm gần đây, nhiều loại kháng sinh tìm đưa vào áp dụng điều trị Đến thập niên 80, người ta đưa thị trường 50 loại Penicillin, 70 Cephalosporin, 12 tetracyciin, aminoglycosid, monoỉactam, carbapenem, macrolid fluoroquinon Ngày nay, nhờ áp dụng thành tựu khoa học cơng nghệ vói khoản đầu tư hàng tỷ đơla hàng năm, danh mục thuốc kháng sinh ngày mở rộng 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh [2] Kháng sinh sản phẩm đặc biệt nhận từ vi sinh vật hay nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm tiêu diệt cách chọn lọc lên nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm ) hay tế bào ung thư nồng độ thấp 1.1.3 Quá trình sản xuất kháng sinh [2], [8] Sơ đồ tổng quát trình sản xuất kháng sinh giới thiệu hình Hình 1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 1,1,4 ứng dụng kháng sinh ưnh vực y học [2], [9] Bên canh thành tựu đạt y học, kháng sinh sử dụng số lĩnh vực sau nhằm phát huy tính hiệu tối đa kháng sinh: Kháng sinh ưong chăn nuôi nhằm điều trị bệnh vi sinh vật gây động vật sử dụng chất kích ứiích tăng ưọng đàn gia súc, gia cầm (Biovit, Tetravit) Kháng sinh trồng trọt: khoảng 30 kháng sinh sử dụng để trị bệnh cho trồng nhiễm khuẩn nấm gây Sử dụng kháng sinh trồng trọt khắc phục nhược điểm thuốc hoá học dùng bảo vệ thực vật (kasugamycin, validamycin) Kháng sinh dùng công nghiệp thực phẩm: Các kháng sinh subtilin, nisin dùng bảo quản thực phẩm đóng hộp rút ngắn thời gian khử trùng nhiệt, giảm nhiệt độ khử trùng, đảm bảo chất lượng sản phẩm (vitamin, hưcfng vị) Sử dụng kháng sinh ưong chăn nuôi, ưồng ưọt cồng nghệ thực phẩm cần lưu ý đến khả xuất vi sinh vật kháng kháng sinh nguy hại cho việc điều trị bệnh nhiễm trùng người 1.1.5 Một số kháng sinh Streptomyces species tổng hợp [1], [2], [9] Những kháng sinh loài chi Streptomyces tổng hợp đa dạng Có thể xếp sau: Bảng 1: Một sô'kháng sinh Streptomỵces tổng hợp STT Nhóm kháng sinh Kháng sinh tạo thành Chủng Streptomyces sinh tổng hợp Kanamycin Str.kanamyceticus Neomycin Str.fradiae Nhóm kháng sinh Tobramycin aminogỉycosid Streptomycin Str.tenebrarius Str.griseus Paromomycin Str.rimosus Spectinomycin Str.spectabiỉus 2.2.2 Khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 20,310 môi trường phân lập MT3 Chủng Streptomỵces 20.310 cấy môi trường MT3, sau ngày thử hoạt tmh kháng sinh phương pháp đặt khối thạch mơi trường thạch thường có chứa vi sinh vật kiểm định, kết ttình bày bảng Bảng 4: Hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces 20.310 môi trường MT3 vsv kiểm định D (mm) Gram(-) Gram (+) Bc Bp Bs Sta Sar EC Sal Shi Pro Pseu 22,76 19,00 20,54 22,86 20,34 21,22 23,32 21,18 20,06 19,92 Nhận xé t Trên môi trường phân lập MT3, chủng Streptomyces 20.310 có khả sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, tác dụng vi khuẩn Gram (+) vi khuẩn Gram (-) 2.2.3 Ảnh hưỏmg loại môi trường đến khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Sừ-eptomyces 20.310 Tiến hành nuôi cấy xạ khuẩn môi trường đặc, sau ngày thử hoạt tính kháng sinh ưên 10 loại vi khuẩn, kết trình bày bảng Bảng 5: Hoạt tứửi kháng sinh chủng Steptomyces 20.310 loại môi trường với 10 chủng vi khuẩn kiểm định VK Tham số MTl MT2 22,88 18,47 Bs Bp Sta Sal EC Shi Sar Pseu - s Pro MT3 MT4 MT5 MT6 12,37 14,13 Ì 19,47 17,06 0,18 ©¿9 0,77 0,08 MT7 s 0,74 Z)(mm) 19,10 12,74 13,90 18,87 18,51 17,74 s 0,59 0,54 0,18 1,06 0,85 0,23 £>(mm) 17,61 13,52 12,85 20,12 18,04 18,12 s 0,11 1,24 0,25 0,44 1,24 0,79 1,72 í)(mm) 15,83 17,53 19,44 17,43 18,20 16,77 18,18 s 1,31 0,24 0,91 0,35 0,90 0,83 0,23 D(mm) 18,76 15,31 13,32 17,96 16,53 19,52 s 0,12 0,16 0,35 0,76 0,18 0,42 Z)(mm) 20,20 15,03 14,65 19,33 19,65 18,76 s 0,58 0,44 0,69 0,36 0,13 1,02 D(mm) 18,97 21,51 12,95 10,28 18,54 19,93 17,93 s 0,21 0,47 1,21 1,13 0,62 1,00 0,97 D(mm) 16,77 19,17 15,81 10,96 17,36 18,52 16,78 s 1,15 2.01 0,57 0,24 0,13 1.21 0,36 £>(mm) 17,13 19^6 9,33 15,62 17,06 12,35 17,55 s 1,03 2,12 0,45 0,69 0,23 1,01 0,23 27,17 15,81 18,96 p (^ pl8,52 Dộmn) ■ w ; 0,35*' 0,54 - 1^ 1,41 16,78 Nhận xét Chủng S trep to m yces 20.3ỉ phát triển tốt môi trường khả sinh tổng hợp kháng sinh cao mồi trường MT2 Chọn MT2 làm môi trường nuôi cấy chọn Bacỉlỉus cereus, Proteus mirabilis làm vsv kiểm định nghiên cứu sau 1| 2.2.4 Kết chọn lọc ngẫu nhiên Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên môi trường MT2 Xác định hoạt tính kháng sinh khuẩn lạc ưên Bacilỉus cereus, Proteus mirơbiỉis Kết trình bày bảng Bảng 6: Kết chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 20.310 Kết Ký hiệu dạng chủng Bacillus cereus D s (mm) Ký hiệu Proteus dạng mirabilis chủng D s Kết Bacillus cereus D (mm) (mm) s Proteus mirabilis D s (mm) 19,01 0,87 17,59 0,38 17 15,75 0,97 Í6,69 0,37 17,22 0,44 16,72 0,14 18 15,18 0,12 15,03 0,92 0,27 ^ [ ^ 0,24 : 19 15,08 0,40 13J6 1,00 ■■ h % m 18,87 0,13 16,03 0,78 20 14,49 0,55 13,29 0,82 18,88 1,18 18,58 1,25 21 17,07 1,91 17,46 0,34 22 17,41 0,36 16,01 0,32 kOLSS - 15,29 0,66 14,50 0,90 23 15,71 0,47 14,69 0,35 18,67 0,86 16,53 0,59 24 16,11 0,71 15,84 0,73 16,66 0,57 15,14 0,32 25 13,07 0,76 11,80 0,40 10 15,55 0,81 14,28 1,31 26 16,21 0,89 15,00 0,17 11 15,91 0,67 13,33 0,21 27 18,21 0,15 18,05 0,55 12 15,22 0,62 12,61 0,27 28 17,63 0,94 15,92 0,52 13 19,56 0,48 17,15 0,82 29 17,76 1,06 15,58 0,14 30 16,65 0,95 16,23 0,07 17,93 ] 15 17,08 1,40 16,39 0,69 31 16,82 0,26 16,74 0,51 16 15,63 0,35 16,26 0,75 32 17,45 0,28 15,30 0,03 Nhận xét: Các dạng chủng 3, , 14 có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao nên giữ lại để nghiên cứu tiếp 2.2.5 Kết gãy đột biến nhàn tạo ánh sáng u v - Tiến hành đột biến bào tử Streptomyces 203ỈỒ (dạng chủng chọn lọc ngẫu nhiên) u v - % sống sót sau đột biến = 0,136% - Xác định hoạt tính kháng sinh 32 biến chủng sau đột biến Baciỉỉus cereus & Proteus mirabilis Kết sàng lọc sau đột biến trình bày bảng Bảng 7: Các biến chủng có % biến đổi hoạt tính(+) cao sau đột biến Biến chủng 6.5 „6.6 6.7 6.13 6.14 6.16 6.17 6.18 6.20 6.22 6.23 6.24 6.25 6.26 6.27 6.28 6.29 Chứng Bacillus cereus % biến đổi s Z)(mm) hoạt tính 21,80 0,39 118,28 20,43 0»69 19,90 19,70 20,35 20,57 18,81 19,06 19,72 19,97 19,63 19,60 0,77 1,27 0,33 0,78 0,25 0,20 1,35 0,29 0,18 0,25 : 19,90 21,02 19,89 19,81 18,43 0,23 0,65 0,66 0,45 0,21 107,98 106,89 110,18 111,61 102,06 103,42 107,00 108,36 106,51 106,35 110,80 108,00 114,05 108,00 107,49 100,00 Proteus mirabilis %biêh đổi s Z)(mm) hoạt tmh 20,15 114,68 0,37 112^8 19,13 0,50 108,88 18,67 0,56 106,26 19,75 0,17 112,41 19,01 0,74 108,20 18,11 0,61 103,07 17,82 0,66 101,42 18,05 0,28 102,73 19,76 0,65 112,46 19,33 0,61 110,02 19,14 0,52 108,93 0^4 115,37 20,^7 18,64 106,09 0,35 18,77 0,28 106,83 19,73 0,45 112,30 19,93 1,01 113,43 17,57 100,00 0,34 Nhận xét: Tần suất xuất đột biến dưcfng tính Streptomyces 20.310 lớn, nhiên số biến chủng có % biến đổi hoạt tmh (+) có ý nghĩa khơng nhiều Giữ lại biến chủng 6.5, 6.6 6.25 để nghiên cứu tiếp 2.2.6 Kết lên men chìm Tiến hành lên men ttên môi trường MT2dd với chủng gốc 20.310, dạng chủng 20.310.6 CLNN biến chủng 20.310.6.5 sau đột biến Kết trình bày bảng Bảng 8: Kết lên men chìm MT2đd Bacillus cereus Ký hiệu biến chủng b (mm) Proteùs mirabilis s s D 20.310 18,65 0,43 17,22 0,18 20.310.6 19,18 0,27 19,56 0,22 20.310.6.5 21,98 0,24 20,86 0,34 Nhận xét: Qua trình sàng lọc đột biến, khả nãng sinh tng hỗfp khỏng sinh ca Streptomyces 20.310 tóng dỏn lờn Cần tiến hành nhiều bước đột biến để thu biến chủng cho hiệu suất lên men chìm cao 2.2.7 Ảnh hưởng pH đến độ bền vững kháng sinh Thử hoạt tửih kháng sinh dịch lên men pH 3, 5, 7, 9,11 sau ngày ngày Proteus mirabilis Baciìlus cereus Kết trình bày bảng pH Sau ngày Sau ngày Baccillus Proteus Proteus mirabilis Bacciỉlus cereus mirabilis cereus Dimm) ¿ (m m ) 11 14,97 0,45 16,19 0,12 11,47 0.11 11,08 0,34 16,43 0,23 15,93 0,44 12,75 0,45 14,53 0,45 16,07 0,12 14,56 0,18 15,60 0,56 14,34 0,13 16,11 1,24 15,77 0,33 14,83 1,04 13,02 0,76 15,92 0,76 15,57 0,32 14,76 0,28 13,57 0,34 Nhận xét: Kháng sinh chủng Streptomyces 20.3 ỉ sinh tổng hợp bền khoảng pH rộng pH kiềm Dựa vào bảng chọn pH-7 để bảo quản lưu giữ dịch lên men 2.2.8 Lựa chọn dung mơi pH thích hợp để chiết kháng sinh dịch lên men Tiến hành chiết đơn kháng sinh từ dịch lọc pH=3, 7, 10 vód dung mồi chiết khác Thử hoạt tính kháng sinh pha dung môi (dmhc) pha nước (N) Proteus mirabilis Kết trình bày bảng 10 Bảng 10: Hoạt túứi kháng sinh sau chiết dung mơi hữu Đường kính vòng vơ khuẩn (mm) pH Butyl acetat dmhc N Qoroform n-butanol Diclomethan dmhc N dmhc N dmhc N 14,54 11,36 16,66 15,90 11,73 16,Í9 12,84 13,11 13,73 10,26 14,91 15,37 16,63 11,70 15,45 14,86 19,51 10 16,80 15,48 15,61 1^6 QM Nhận xét: pH=10 Butyl acetat n-butanol chiết tốt, nhiên n-butanol cho kết chiết tốt pH=7 ,10 Do đó, chọn n-butanol làm dung mơi chiết kháng sinh chiết pH=7 2.2.9 Kết thử hoạt tính kháng sinh nội bào Nghiền Ig sinh khối 5ml n-butanol Ih Đánh giá hoạt tính kháng sinh phưcfng pháp khoanh giấy lọc Kết trình bày bảng 11 Bảng I I : Kết thử hoạt tính kháng sinh nội bào Bacillus cereus Proteus mirabilis Mâu thử D (mm) Dịch chiết n-butanol 13,45 0,36 17,48 0,52 Nhận x é t Chủng Streptomyces 20.310 có khả sinh tổng hợp kháng sinh ngoại bào kháng sinh nội bào Tuy nhiên, tỷ lệ kháng sinh nội bào nhỏ so với kháng sinh ngoại bào 2.2.11 Thử hoạt tính chống nấm Síreptomỵces 20.310 Thử hoạt tính chống nấm Streptomyces 20.310 Candida albicans Aspergiỉỉus niger phưcỉng pháp giếng thạch Kết kết luận Streptomyces 20310 khơng có hoạt tính chống nấm Candida aỉbicans Aspergiỉlus niger 2.2.12 Thử độ bền nhiệt kháng sinh dịch lên men Lấy mẫu địch lọc lẽn men, đem đun sồi trực tiếp 10 phút, đun cách thuỷ 30 phút Đánh giá hoạt tính kháng sinh Proteus mirabiỉis phưcmg pháp giếng thạch Kết trình bày bảng 12 Bảng 12: Kết thử độ bền nhiệt kháng sinh Tham số Đun sôi trực tiếp 10’ Đun cách thuỷ 30’ D (mm) 30,05 28,52 Nhận xét: Trong thòri gian ngán, kháng sinh dịch lên men bền nhiệt 2.2.13 Kết sắc ký lớp mỏng: Dịch chiết n-butanol sử dụng để chấm SKLM Tiến hành sắc ký với hệ dung môi sau: - Hệ 1: Cloroform : Methanol: Amoniac 25% = : : - Hộ 2: n-butanol: Ethanol: Dimethylfonnamide = : : - Hệ 3: Butyl acetat: Aceton : Triethylamin = : : - Hệ 4: Acetyl acetat: Propanol: Acetonitril = : : Phát vết phiíơng pháp hình v s v soi đèn tử ngoại Kết trình bày bảng 13 hình (phụ lục) Bảng 13: Kết sắc ký lớp mỏng Hê dung môi Rf uv v sv H ệl 0,00-0,92 0,00-0,92 Hệ ,00-0,86 ,00-0,86 Hệ 0,81 0,81 Hệ 0,00-0,76 0,00-0,76 Nhận xét: Kết sắc ký không phát vết phun dung dịch Ninhydrin 1% Phuofng pháp soi đèn tử ngoại hình v s v cho vết tương đương: vết hệ 1, 2, vết hệ Như sơ kết luận dịch chiết dịch lên men có thành phần kháng sinh Phần III; KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.Ỉ Kết luận: Qua thời gian thực nghiệm tơi hồn thành mục tiêu đề thu số kết sau: - Cơ kết luận tên khoa học Streptomyces 20.310 Streptomyces nigeỉlus - Kháng sinh Streptomyces 20.3Ỉ0 sinh tổng hợp kháng smh phổ rộng, tác dụng vi khuẩn GTam(+) Gram(-), khồng có hoạt tính chống nấm (Candida albicans Aspergillus niger) - Môi trường MT2 mồi trường lên men bề mặt tốt - Sau cải tạo giống phương pháp đột biến nhờ ánh sáng u v , hoạt tính kháng sinh tăng - pH trung túih pH tối ưu để bảo quản dịch lên men chiết kháng sinh dung môi n-butanol - Streptomyces 20.310 có khả sinh tổng hợp kháng sinh ngoại bào nội bào - Sau sắc ký với hệ dung môi, kết luận dịch chiết dịch lên men có vết kháng sinh 3.2 Đề xuất: - Tiếp tục nghiên cứu tìm điều kiộn tối ưu cho trình lên men cải tạo giống - Nghiên cứu sâu hcfn vế quy trình chiết tách, tinh chế tiến đến xác định tính chất lý hố, cấu trúc hoá học khẩng sinh Streptomỵces 20.310 tổng hcfp TÀI LIỆU THAM KHẢO Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trĩnh Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, trang 167-184 Bộ môn Công nghiệp Dược (2003), Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm I, Đại học Dược Hà Nội, trang 142-204 Bùi Long Biên (1995), Phân tích hố học định lượng, NXB Khoa học kỹ thuật, ưang 98-112 Nguyễn Trọng Chinh (2002), Vái đề kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh, Tạp chí Thơng tin Y Dược, số 7, ưang 12-16 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, trang 39-41 Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Lệ Phi (1999), Vi sinh học, Đại học Dược Hà Nội Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (2002), Hố phân tích //, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hường (2003), Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng Streptomyces ỈOA9y Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, Đại học Dược Hà Nội Từ Minh Kng (2005), Cơ sở cơng nghệ sinh học sản xuất Dược phẩm, NXB Y học 10 Nguyễn Hoài Nam (1986), ỉỉắc định hoạt lực kháng sinh vi sinh vật, NXB Khoa hoc kỹ thuật, ưang 5-62 11 Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định chất dung môi hữu cơ, NXB Khoa học kỹ thuật, tập I, trang 9-56 12 Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Khoa học kỹ thuật, trang 40-51 13 Cao Văn Thu (2000), Bài giảng kháng sinh vitamin, Hà Nội 14 Antonio J.G.Cruz, Tai Pan, Roberto C.Giordano, Maria Lucia G.C Araujo, Carlos D.Hokka (2004), “Cephalosprin C Production by Immobilized Cephalosprium acremonium Cells in a Repeated Batch Tower Bioreactor”, Biotechnology and Bioengineering, Vol.85, No.l, p 96-101 15 Ben Shen, Liangcheng Du, Cesar Sanchez, Daniel J.Edwards, Mei Chen and Jeffey M.Murrell (2002), “Qoning and Characterization of the Bleomycin Biosynthetic Gene Cluster from Streptomyces verticillus ATCC 15003", Journal o f Natural Products, Vol 65, No.3, p 422-431 16.E.B Shirling & D.Gottlieb (1966), “Methods for characterization of Streptomyces species”, ¡nt J.Syst.Bacterial, Vol.16, No.3, p 313-340 17 J.Horvátch (1968), Fundamental Genetics of Streptomyces, Budapest 18-Wenxu Jiao, John W.Blunt, Anthony L.J.Cole and Murray H.G.Munro (2004), “Fumagiringillin,a New Fumagillin Derivative from a strain of Fungus Aspergillus fumigatus”, Journal o f Natural Products, Vol.67, No.8 , p 1434-1436 PHỤ LỤC Ọ,Sịu;ỵ Hmh3: Hình thái chuỗi bào tử (độ phóng đại 14400) 0,5fftv Hình 4: Bể mặt bào tử (độ phóng đại 18000), Hình 5: Kết thử hoạt tính kháng sinh mơi trường Hình : Kết thử hoạt tính kháng sinh khoanh giấy lọc Hình 7; Kết SKLM hệ Hình : Kết thử hoạt túih kháng sinh phương pháp giếng thạch ... phân lập nghiên cứu số chủng Streptomyces có đất Việt Nam Qua số kết thử nghiệm ban đầu chọn đề tài Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 20. 310' " vód mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải... tổng hợp [1], [2], [9] Những kháng sinh loài chi Streptomyces tổng hợp đa dạng Có thể xếp sau: Bảng 1: Một sô 'kháng sinh Streptomỵces tổng hợp STT Nhóm kháng sinh Kháng sinh tạo thành Chủng Streptomyces. .. ưu - Nghiên cứu sơ phưcíng pháp tách tinh chế kháng sinli “ Nghiẽn cứu đặc điểm hình thái sinh lý nhằm phân loại định tên chủng Streptomyces 20. 310 Phần I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh