Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 20 112

m BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHAN THỊ THANH THẢO GÓP PHẦN NGHIÊN cứu LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 20.112 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006) Người hướng dẫn Nơi thực hiện Thời gian thực hiện PGS.TS. CAO VĂN THU BỘ MÔN VI SINH - SINH HỌC 2-5/2006 HÀ NỘI, 5/2006 - LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và cảm ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm cfn đến PGS.TS Cao Văn Thu - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Vi sinh - Sinh học, phòng thí nghiệm trung tâm, Thạc sĩ Nguyễn Đình Luyện - Bộ môn Công nghiệp dược, PGS.TS Nguyễn Quang Đạt - Bộ môn Hoá hữu cơ, đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy giáo, cô giáo các bộ môn, các phòng ban trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập tại trường. Với thời gian thực nghiệm có hạn và trong quá trình thực nghiệm không tránh khỏi những thiếu sót nên khoá luận này chắc chắn còn nhiều hạn chế . Rất mong được sự góp ý của các thầy cô giáo và bạn bè để khoá luận hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội ngày 19 tháng 5 năm 2005 Sinh viên Phan Thi Thanh Thảo MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỂ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN , , 2 1.1. Vài nét về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 2 1.1.3. Phân loại kháng sinh 2 1.1.4. úíig dụng kháng sinh 3 1.1.5. Sơ đồ mô tả qui trình sản xuất kháng sinh 4 1.2. Đại cương về xa khuẩn 4 1.2.1. Xạ khuẩn 4 1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 5 1.2.3. Phân loại Streptomyces . 6 1.3. Cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh Jỉ 1.3.1. Mục đích cải tạo giống 7 1.3.2. Các phưcmg pháp cải tạo giống 7 1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 8 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8 1.4.1. Lên men bề mặt 8 1.4.2. Lên men chìm 9 1.5. Chiết tách, tinh chế sản phẩm sau lên men 10 1.5.1, Tách sinh khối từ dịch lên men 10 1.5.2. Tách chất kháng sinh từ sinh khối 10 1.5.3 Chiết kháng sinh từ dịch lọc 10 1.5.4. Tách các thành phần kháng sinh và tinh chế kháng sinh. . 11 1.6. Nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh . 12 1.7. Một số nghiên cứu gần đây về kháng sinh 13 1.7.1. Phân lập một kháng sinh mới, Alaremycin, có cấu trúc giống với 5-Aminolevulinic acid từ Streptomyces sp. A012304 13 1.7.2 Phenoxymethylpenicillin được chèn giữa các hydrotalcit là thuốc ức chế vi khuẩn 14 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 15 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 15 2.1.1. Nguyên vật liệu 15 2.1.2. Các phương pháp thực nghiệm 17 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 23 2.2.1. Sàng lọc chủng đã được cất giữ của xạ khuẩn Streptomyces 20.112 23 2.2.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 23 2.2.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 26 2.2.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29 2.2.5. Kết quả chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 31 2.2.6. Kết quả sắc ký lớp mỏng 32 2.2.7. Kết quả thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không 33 2.2.8. Kết quả sắc ký cột 34 2.2.9. Kết quả thu kháng sinh tinh chế bằng cất quay chân không 36 2.2.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy bột tinh chế 38 2.2.11. Kết quả xác định một số nhóm chức của kháng sinh bằng quang phổ hồng ngoại 39 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 41 3.1. Kết luận 41 3.2. Đề xuất 41 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT HTKS Hoạt tính kháng sinh KS Kháng sinh MT Môi trường MTdd Môi trường dung dịch Gr(+) Gram dưoỉng Gr(-) Gram âm VK Vi khuẩn vsv Vi sinh vật D(mm) Đường kính trung bình vòng vô khuẩn s Độ lệch thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh B.pumilus Bacillus pumilus p. mirabilis Proteus mirabilis ĐẬT VẤN ĐỂ Hiện nay, khoa học nghiên cứu các chất kháng sinh vẫn đang là vấn đề nổi bật, thu hút sự chú ý quan tâm của nhiều nhà khoa học thuộc các lĩnh vực khác nhau trên thế giới. Nhờ sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại và sự hỗ trợ của các ngành khoa học khác, việc nghiên cứu các chất kháng sinh đã đạt được những thành tựu rực rỡ, hàng năm có vài trăm chất được phát hiện. Tuy hiện nay có nhiều chất kháng sinh được phát hiện nhưng chỉ có không quá 1% có giá trị thực tiễn trong y học. Hơn nữa do việc sử dụng không hợp lý chất kháng sinh trong y học cũng như trong chăn nuôi làm ngày càng có nhiều chất kháng sinh không còn tác dụng. Do vậy việc tìm kiếm các chất kháng sinh mới là cẩn thiết và vô cùng quan trọng. Trong số các vi sinh vật sinh chất kháng sinh, xạ khuẩn là nhóm tiềm năng lớn, khoảng 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới có 80% là do xạ khuẩn sinh ra. Nhiều kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng làm kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Trong những năm gần đây, bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành phân lập một số chủng Streptomyces có trong đất Việt Nam, góp phần vào các nghiên cứu ban đầu tìm ra kháng sinh mới. Qua quá trình thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn khóa luận: "Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 20.112" với những mục tiêu: - Nghiên cứu cải tạo giống quy mô phòng thí nghiệm để nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Bước đầu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh quy mô phòng thí nghiệm. - Bước đầu nghiên cứu tinh chế kháng sinh và xác định một số nhóm chức trong cấu trúc kháng sinh bằng phổ hồng ngoại( IR). PHẦNl TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về kháng sinh 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [5], Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay từ các nguồn tự nhiên khác, có hoạt tính sinh học cao, ở nồng độ thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật )• 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh [9]. Người có công lớn nhất trong việc khám phá ra thế giới các chất kháng sinh, đặt nền móng cơ bản cho nghiên cứu chất kháng sinh là bác sĩ người Anh Alexander Fleming (1881-1955). Năm 1928, Fleming phát hiện nấm sợi Penicilium notatum khi phát triển có thể ức chế mạnh, thậm chí làm tan cả khuẩn lạc của vi khuẩn Staphylococcus aureus. Năm 1940, B.E.Chain, H.W.Florey tiến hành chiết xuất thành công chế phẩm kháng sinh đầu tiên đặt tên penicilin, mở ra một kỷ nguyên mới, kỷ nguyên kháng sinh chính thức ra đời. Sau penicilin nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới tiến hành nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh từ vsv. Đến nay, số lượng chất kháng sinh hiện biết là hơn 8000 chất và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh được phát hiện. I.13. Phân loại kháng sinh {6\ Có nhiều cách phân loại kháng sinh, thông thường phân loại theo cấu tạo hoá học gồm có các nhóm sau: 1. Kháng sinh p-lactam 2. Kháng sinh Aminoglycosid 3. Kháng sinh Tetracyclin 4. Kháng sinh Chloramphenicol và dẫn chất 5. Kháng sinh Macrolid 6. Kháng sinh Lincosamid 7. Kháng sinh Polypeptid 8. Kháng sinh Quinolon 9. Các chất kháng sinh khác: Rifamycin, kháng sinh chống nấm, kháng sinh chống ung thư. 1.1.4. ứng dụng kháng sinh [5]. ❖ ứig dụng kháng sinh trong lĩnh vực y học: Việc ứng dụng kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm trùng có ý nghĩa thực tiễn y học lớn. Ngày nay, do việc sử dụng rộng rãi kháng sinh làm tỷ lệ kháng kháng sinh tăng cao nên việc cải tạo các kháng sinh có sẵn và tìm kiếm, sản xuất kháng sinh mới là rất cần thiết. ❖ ứig dụng kháng sinh ngoài lĩnh y học - Kháng sinh dùng trong chăn nuôi: Kháng sinh được các bác sỹ thú y dùng để điều tri các bệnh do v sv gây ra cho động vật. Ví dụ: dùng griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú ở trâu bò, Ngoài ra KS còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc. Ví dụ: các chế phẩm Biovit, Tetravit. - Kháng sinh dùng trong trồng trọt: Kháng sinh được dùng để tiêu diệt v s v gây bệnh cho cây trồng. Ví dụ: những kháng sinh thưòmg dùng là griseofulvin, kasugamycin - Kháng sinh dùng trong công nghiệp thực phẩm: Một số kháng sinh là chất bảo quản lý tưởng thực phẩm tươi và đóng hộp. Ví dụ: subtilin, nisin hay được dùng trong bảo quản thực phẩm 1.1.5. Sơ đồ mô tả qui trình sản xuất kháng sinh[5]. 1.2. Đại cương về xạ khuẩn [3], [4], [7], [9]. 1.2.1. Xạ khuẩn. ♦♦♦ Đặc điểm chung của xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gr(+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng scfi phân nhánh. Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Xạ khuẩn có khả năng tạo nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như : kháng sinh, ezym, một số vitamin và acid hữu cơ Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn gây bệnh cho người. ❖ Đặc điểm hình thái xạ khuẩn: - Đường kính khuẩn ty khoảng 0,2)Lim-3|am, - Màu sắc của khuẩn ty rất phong phú: trắng, vàng, đỏ, tím, nâu, xám, - Thành tế bào xạ khuẩn dày khoảng 10nm-20nm, - Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính. 1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces Streptomyces là giống xạ khuẩn được Waksman và Henri đặt tên năm 1943. Chúng có vị trí tiến hóa cao trong số các giống thuộc vi khuẩn Gr(+), có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh phát triển, phân nhánh. ❖ Đặc điểm hình thái - Khuẩn lạc : khuẩn lạc của xạ khuẩn rất đặc biệt, nó không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Khuẩn lạc có chân vững chắc khó tách khỏi môi trường. - Hệ sợi xạ khuẩn có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh + Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu trong môi trường nuôi cấy. Nó có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố : có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. + Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Màu sắc của khuẩn ty hết sức phong phú : màu trắng, vàng, đỏ, lục, xám. - Xạ khuẩn sinh sản vô tính bằng bào tử. [...]... biến bằng ánh sáng u v cho kết quả lên men chìm tốt với khả năng sinh tổng hợp khánh sinh cao, - Chủng 9.2 có hoạt tính kháng sinh tốt khi lên men bề mặt nhưng khi lên men chìm lại không có hoạt tính kháng sinh Như vậy kết quả lên men bề mặt và lên men chìm có thể không giống nhau 2.2.5 Kết quả chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ Tiến hành chiết dịch lọc sau khi lên men bằng n-Butanol ở pH7 theo phưofng... khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm các mục đích: - Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, - Cải tạo đặc tính lên men, rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt - Chỉ sinh tổng hợp một sản phẩm để dễ chiết tách, tinh chế, - Sinh tổng hợp được sản phẩm mới 1.3.2 Các phương pháp cải tạo giống [5] ♦♦ Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc tự nhiên ♦ Các vi sinh vật biến... biến đổi HTKS cao(> 120% ) chưa có Hình 3: Hoạt tính kháng sinh của chủng 9.2.25.24, 9.2.25.25, 9.2.25.26 (vi khuẩn kiểm định là Bacillus pumilus) 2.2.4 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh ❖ Kết qủa lựa chọn môi trưòíng lên men Tiến hành lên men chìm chủng 9.2.25.2 trên máy lắc với 3 môi trường khác nhau là MTldd, MT2dd, MT5dd Đánh giá hoạt tính kháng sinh của dịch lọc sau lên men bằng phương pháp... các môi trưcmg lên men khác nhau để chọn môi trường lên men tốt nhất với tỷ lệ Vgiô„g: yuĩìènmsn = 1-10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 30°c, tốc độ quay 145 vòng/ phút trong 120h Sau khi lên men, lọc dịch lên men thu được dịch lọc thử hoạt lực kháng sinh của dịch lọc bằng phương pháp giếng thạch Dựa vào kết quả đó lựa chọn môi trường lên men tốt nhất ❖ Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi... hoạt chất quan trọng như: acid amin, các chất kháng sinh ** Lên men gián đoạn có bổ sung: Đây là biến tướng của phương pháp lên 1 men gián đoạn, khi ta bổ sung thêm môi trường mới vào dịch lên men một cách ổn định, thay đổi hay định kỳ nhưng không lấy bớt dịch lên men ra ❖ Lên men liên tục: Hệ thống lên men hoạt động như hệ thống mở Trong quá trình lên men vừa bổ sung liên tục môi trường dinh dưỡng... khô, ổn định trong đất Tùy theo trang thiết bị và vi sinh vật cần giữ mà chúng ta có thể sử dụng phương pháp nào Đối với giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm đơn giản nhất có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng trong tủ lạnh 1.4 .Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [5], [11], [13], [15], [18] Lên men sinh tổng hợp kháng sinh là quá trìnlĩmĩôi cấy v s v trong môi trường dinh... đồng lượng dịch lên men đã biến đổi cùng v s v có trong đó ❖ Lên men bán liên tục; ở đây việc rút bớt dịch lên men và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng không xảy ra liên tục mà theo chu kỳ định kỳ 1.5 Chiết tách, tinh chế sản phẩm sau lên men Sau khi lên men, dịch lên men ngoài kháng sinh còn có nhiều tạp chất khác là các chất vô cơ hoặc hữu cơ, là sản phẩm trao đổi chất hay là thành phần của môi trường... đoán các nhóm chức mà kháng sinh có ❖ Xác định nhiệt độ nóng chảy của bột kháng sinh tinh chế: Bột kháng sinh tinh chế được đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo độ nóng chảy Dựa vào đó ta xác định được một tính chất của kháng sinh 2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 2.2.1 Sàng lọc chủng đã được cất giữ của xạ khuẩn Streptomyces 20. 112 Các chủng được cất giữ của xạ khuẩn streptomyces 20. 112 là: chủng gốc,... trưng Đây là cơ sở việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR 1.7 Một số nghiên cứu gần đây về kháng sinh [19], [20] 1.7.1 Phân lập một kháng sinh mới, Alaremycin, cố cấu trúc giống với 5-Aminolevulinic acid t Streptomyces sp A012304 [19] Một kháng sinh mới có cấu trúc giống với 5-Aminolevulinic acid (ALA), tiền chất của quá trình sinh tổng hợp hem, được đặt tên là alaremycin, phân lập từ môi trường nuôi cấy... áp lực cao, vô trùng tuyệt đối ), đầu tư lớn Với những ưu điểm nổi bật như vậy, đại đa số kháng sinh hiện nay được sản xuất trong công nghiệp bằng phưofng pháp lên men chìm Quá trình lên men chìm được chia làm nhiều kiểu: ❖ Lên men gián đoạn (lên men có chu kỳ): là một quá trình đóng kín, trong thời gian lên men không có bất cứ tác động hay bổ sung gì vào hệ ngoài việc cung cấp oxy, chất phá bọt, chất . HỌC Dược HÀ NỘI PHAN THỊ THANH THẢO GÓP PHẦN NGHIÊN cứu LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 20. 112 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 200 1 -200 6) Người hướng dẫn Nơi thực hiện. sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 20. 112& quot; với những mục tiêu: - Nghiên cứu cải tạo giống quy mô phòng thí nghiệm để nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Bước đầu nghiên cứu. các thành phần kháng sinh và tinh chế kháng sinh. . 11 1.6. Nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh . 12 1.7. Một số nghiên cứu gần đây về kháng sinh 13 1.7.1. Phân lập một kháng sinh mới,