Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  TRẦN THỊ HUẾ MÃ SINH VIÊN: 1101219 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINHTỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.225 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Hà Nội –2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HUẾ MÃ SINH VIÊN: 1101219 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES184.225 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Hà Nội –2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu- người trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền đạt kiến thức quý báu luôntạo điều kiện tốt để hoàn thành tốt khóa luận Trong trình nghiên cứu, nhận nhiều giúp đỡ nhiệt tình thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác môn Vi sinh – Sinh học, môn Công nghiệp Dược nói riêng, trường Đại học Dược Hà Nội nói chungvà môn Hóa Vật liệu – khoa Hóa – Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội Tôi chân thành cảm ơn Thầy Cô Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, ủng hộ giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Do thời gian thực có hạn, điều kiện nghiên cứu trình độ thân hạn chế nên tránh khỏi sai sót khóa luận Vì vậy, mong nhận đóng góp ý kiến, bảo thầy cô để khóa luận hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Huế MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptpmyces 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 1.1.3 Đặc điể i 1.1.4 i i củ e ce 1.2 Đại cương kháng sinh 1.2.1 Đị ĩ 1.2.2 P â ại 1.2.3 Cơ c ế 1.3 i i c dụ củ i Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh .4 1.3.1 C c 1.3.2 B 1.4 ươ qu iố vi i iố …………………………………… vậ Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 1.4.1 i iệ 1.4.2 C c 1.4.3 1.5 c i ê e ươ ê ố ếu ố e đế qu ê e Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.5.1 P ươ 1.5.2 P ươ c iế xuấ i c ế 1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 1.6.1 P 1.6.2 P 1.6.3 P ại- ại (IR) ối 1.6.4 P iế (UV-VIS) c ( ) 10 â (N R) 10 1.7 Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225 11 1.8 Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2 11 1.9 Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin D .12 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 14 2.1.1 Giố xạ 2.1.2 Vi i uẩ 14 vậ iể đị 14 2.1.3 ôi ườ uôi cấ V V iể 2.1.4 ôi ườ uôi cấ xạ đị 14 uẩ 14 2.1.5 Dung môi 15 2.1.6 2.2 c iế ị 16 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 C 2.2.2 ê c c i e iố c iế c 16 i 2.2.3 Bư c đ u x c đị c ế i 16 ố c ấ v cấu c củ i u đư c……………………………………………………………………………16 2.3 Phương pháp th c nghiệm 16 2.3.1 P ươ 2.3.2 Đ uôi cấ i iữ iố i 17 ươ uếc 17 2.3.3 P ươ c 2.3.4 P ươ c i v c 2.3.5 P ươ ê 2.3.6 P ươ x c đị i dịc 2.3.7 C c ươ uôi cấ iố c ê 18 ề Hv đ ề 21 iệ đ củ e 21 c iế cấu 18 i đ u i x c đị ườ e c c dịc 2.3.8 P ươ 2.3.9 ôi c i ể i c i 22 i i iế 23 iế u đư c 23 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 24 3.2 Kết đột biến UV cải tạo giống lần 24 3.3 Kết đột biến UV cải tạo giống lần 25 3.4 Kết đột biến hóa học 27 3.5 Kết chọn môi trường lên men chìm tốt 28 3.6 Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt 288 3.7 Kết đánh giá ảnh hưởng pH nhiệt độ đến độ bền kháng sinh dịch lọc 29 3.8 Kết chọn dung môi hữu chiết xuất kháng sinh 30 3.9 Kết lên men chìm thu dịch lên men 31 3.10 Kết tách kháng sinh sắc ký lớp mỏng 32 3.10.1 C ắc 32 3.10.2 C ắc 34 3.10.3 C ắc 35 3.10.4 Hiệu uấ qu c v i c ế i 36 3.11 Kết sơ xác định kháng sinh tinh khiết thu 37 3.11.1 Kháng sinh 377 3.11.2 Kháng sinh 388 3.12 Bàn luận 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 466 DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2'- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis DM Dung môi DMHC Dung môi hữu Đường kính vòng vô khuẩn ĐBUV Đột biến UV ĐBHH Đột biến hóa học Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh HT Hình thái ISP International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P.mirabilis Proteus mirabilis s Sai số chuẩn hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào UV Ultra violet (tử ngoại) V Thể tích VSV Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học .4 Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định 14 Bảng 2.2 Môi trƣờng nuôi cấy VSV kiểm định 14 Bảng 2.3 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) .14 Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng 15 Bảng 3.1 Kết thử HTKS sau SLNN 24 Bảng 3.2 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần 25 Bảng 3.3 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần 26 Bảng 3.4 Kết thử HTKS sau ĐBHH 27 Bảng 3.5 Kết chọn môi trƣờng lên men .28 Bảng 3.6 Kết lên men chìm dạng biến chủng MT2dt 29 Bảng 3.7a Kết ảnh hƣởng pH đến độ bền kháng sinh .30 Bảng 3.7b Kết ảnh hƣởng nhiệt độ tới độ bền kháng sinh dịch lọc 30 Bảng 3.8 Kết HTKS pha DM pha nƣớc pH = .31 Bảng 3.9 Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần .32 Bảng 3.10 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần 33 Bảng 3.11 Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần 34 Bảng 3.12 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần 35 Bảng 3.13 Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần 35 Bảng 3.14 Kết sắc ký lớp mỏng phân đoạn sau chạy cột lần 36 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học actinomycin X2 (1) actinomycin D (1a) 39s PHỤ LỤC Hình P.1 Sơ đồ chế tác dụng kháng sinh Hình P.2 Hình ảnh khuẩn lạc sau ĐBUV1 Hình P.3 Hình ảnh chạy sắc kí cột lần Hình P.4 Hình ảnh mỏng sau chạy SKLM Hình P.5 Phổ tử ngoại kháng sinh Hình P.6 Phổ hồng ngoại kháng sinh Hình P.7 Phổ hồng ngoại kháng sinh Hình P.8 Phổ khối lƣợng kháng sinh Hình P.9 Phổ khối lƣợng kháng sinh Hình P.10 Phổ cộng hƣởng từ kháng sinh Bảng P.11 Kết thử HTKS sau SLNN Bảng P.12 Kết thử HTKS sau ĐBUV1 Bảng P.13 Kết thử HTKS sau ĐBUV2 Bảng P.14 Kết thử HTKS sau ĐBHH 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Bảng P.11 Kết thử HTKS sau SLNN Kết B.subtilis Kết P.mirabilis B.subtilis P.mirabilis Dạng Dạng chủng ̅ s (mm) ̅ s chủng (mm) ̅ s (mm) ̅ s (mm) 22,45 1,13 23,11 0,76 18 23,85 0,25 23,98 0,79 24,54 1,12 24,74 1,23 19 22,94 1,34 22,84 0,43 24,99 0,69 24,62 0,78 20 23,29 1,27 23,01 1,38 23,54 1,02 22,14 0,81 21 23,64 0,61 22,99 0,73 25,34 0,54 24,87 1,01 22 22,64 0,49 22,45 0,45 24,11 0,43 23,05 0,46 23 23,71 0,85 23,97 0,54 23,61 1,42 22,11 0,86 24 23,75 0,78 22,86 1,53 22,84 1,21 23,09 0,28 25 23,91 1,33 23,70 0,44 23,41 0,43 23,05 0,38 26 23,67 0,58 23,27 1,98 10 24,44 0,82 22,56 0,86 27 23,45 0,99 23,04 1,65 11 23,54 0,43 22,73 0,55 28 23,39 1,43 22,43 1,10 12 22,54 0,50 22,98 0,98 29 22,47 1,76 23,09 1,45 13 24,72 0,41 24,02 1,06 30 23,43 0,35 22,31 0,85 14 22,91 0,78 22,95 1,46 31 22,43 0,24 22,43 0,98 15 23,53 0,83 22,41 0,42 32 23,80 1,56 23,97 1,36 16 23,01 0,88 22,59 1,44 33 24,40 0,78 23,24 0,78 17 23,11 1,55 22,87 1,76 66 Bảng P.12 Kết thử HTKS sau ĐBUV1 Hoạt tính kháng sinh ( D , s) Hoạt tính kháng sinh ( D , s) B.subtilis P.mirabilis Biến chủng D (mm) s biến đổi hoạt tính D (mm) s % biến đổi hoạt tính 24,56 0,43 104,33 24,46 1,24 106,12 23,91 0,64 101,57 23,32 0,72 101,17 24,56 1,89 104,33 24,43 0,45 105,99 26,18 0,76 111,21 25,56 1,56 110,89 23,43 0,72 99,53 23,31 0,38 101,13 22,98 0,44 97,62 23,01 0,64 99,83 25,28 0,57 107,39 23,54 0,89 102,13 13 24,23 1,67 102,93 23,72 1,34 102,91 23,44 0,27 99,58 23,08 0,76 100,13 23,76 0,58 100,93 23,06 0,55 100,04 10 23,87 0,57 101,40 23,30 0,87 101,08 11 23,61 0,75 100,30 23,33 0,68 101,21 12 23,85 0,64 101,32 23,05 0,53 100,00 13 23,44 1,57 99,58 23,24 0,98 100,82 14 23,69 1,52 100,64 23,29 1,97 101,04 15 25,08 1,78 106,54 24,16 1,45 104,82 16 23,75 0,72 100,89 22,98 0,75 99,70 17 23,65 0,57 100,47 22,67 0,51 98,35 18 23,77 0,93 100,98 22,91 1,47 99,39 67 19 23,56 0,35 100,08 23,29 0,97 101,04 20 23,57 0,34 100,13 23,17 1,84 100,52 21 23,85 0,83 101,32 23,06 1,03 100,04 22 25,86 1,34 109,86 25,32 0,76 109,85 23 23,93 0,68 101,66 23,29 0,50 101,04 24 23,93 0,85 101.66 23,32 0,63 101,17 25 23,95 0,76 101,74 23,34 0,56 101,26 26 23,69 1,53 100,64 23,18 0,76 100,56 27 23,66 1,38 100,51 23,28 0,81 101,00 28 26,14 1,34 111,05 26,34 1,12 114,27 29 23,54 0,53 100,00 23,22 0,66 100,74 30 23,83 0,82 101,23 23,31 0,88 101,13 31 26,02 0,54 110,54 24,28 0,45 105,34 32 23,94 0,67 101,70 23,04 0,64 99,96 33 23,49 0,46 99,79 23,06 1,42 100,04 34 23,94 0,63 101,70 23,19 1,63 100,61 MC 23,54 0,51 100,00 23,05 0,62 100,00 68 Bảng P.13 Kết thử HTKS sau ĐBUV2 Biến chủng Hoạt tính kháng sinh ( D , s) Hoạt tính kháng sinh ( D , s) B.subtilis P.mirabilis D (mm) s biến đổi hoạt tính D (mm) s biến đổi hoạt tính 25,78 0,82 101,78 23,30 0,58 93,27 25,23 1,02 99,61 24,31 0,29 97,32 25,34 1,59 100,04 24,29 1,58 97,24 27,15 0,67 107,19 25,65 1,54 102,68 25,71 1,29 101,50 24,28 1,43 97,20 27,66 0,87 109,20 26,20 0,56 104,88 26,34 1,35 103,99 26,16 1,76 104,72 25,52 1,57 100,75 24,29 1,58 97,24 25,74 0,59 101,62 24,25 0,82 97,08 10 26,74 1,65 105,57 24,87 0,78 99,56 11 25,24 0,62 99,64 24,19 0,77 96,84 12 25,67 1,48 101,34 24,04 0,69 96,24 13 25,61 0,49 101,11 24,29 0,38 97,24 14 27,96 0,76 110,38 26,55 0,39 106,29 15 27,45 0,45 108,37 26,28 0,95 105,20 16 26,67 0,34 105,29 25,50 0,45 102,08 17 24,89 0,85 98,26 24,24 0,28 97,04 18 25,73 0,34 101,58 24,29 0,66 97,24 19 25,54 0,82 100,83 24,34 0,89 97,44 69 20 25,69 0,64 101,42 24,11 0,73 96,52 21 25,34 0,51 100,04 24,29 0,90 97,24 22 25,68 0,74 101,38 24,32 1,56 97,36 23 25,87 1,65 102,13 24,35 0,83 97,48 24 25,67 1,39 101,34 24,31 0,92 97,32 25 26,05 0,34 102,84 24,65 1,63 98,68 26 25,49 1,46 100,63 24,28 0,47 97,20 27 25,51 0,93 100,71 24,24 0,62 97,04 28 25,63 1,62 101,18 24,33 0,72 97,40 29 25,40 0,73 100,28 24,30 0,47 97,28 30 25,28 0,69 99,80 24,28 0,82 97,20 31 25,00 0,77 98,70 24,33 1,48 97,40 32 25,79 0,76 101,82 25,22 0,69 100,96 MC 25,33 0,78 100,00 24,98 0,82 100,00 70 Bảng P.14 Kết thử HTKS sau ĐBHH Hoạt tính kháng sinh ( D , s) Hoạt tính kháng sinh ( D , s) B.subtilis P.mirabilis Biến chủng D (mm) s biến đổi hoạt tính D (mm) s biến đổi hoạt tính 26,28 1,94 101,70 25,60 0,47 99,65 26,00 0,87 100,62 25,59 1,04 99,61 26,18 0,49 101,32 25,53 1,59 99,38 25,85 0,46 100,04 25,61 1,07 99,69 25,93 1,84 100,35 25,60 0,57 99,65 27,61 0,56 106,85 27,50 1,56 107,05 25,94 1,68 100,39 25,59 0,48 99,61 28,06 0,34 108,59 27,48 0,87 106,97 28,12 0,63 108,82 26,60 0,44 103,54 10 26,12 0,47 101,08 25,61 0,79 99,69 11 26,06 0,79 100,85 25,46 0,55 99,10 12 26,09 0,63 100,97 25,39 1,09 98,83 13 30,53 0,48 118,15 29,89 0,49 116,35 14 26,17 0,48 101,28 25,49 0,83 99,22 15 26,17 0,86 101,28 25,46 0,57 99,10 16 26,25 1,87 101,59 25,57 0,93 99,53 17 26,45 0,95 102,36 28,55 0,65 111,13 18 25,99 1,63 100,58 25,59 0,84 99,61 19 26,25 1,03 101,59 25,39 0,56 98,83 71 20 29,24 0,76 113,16 28,84 0,54 112,26 21 25,99 1,43 100,58 25,59 1,34 99,61 22 27,60 0,49 106,81 25,61 0,63 99,69 23 26,19 0,83 101,35 25,59 0,58 99,61 24 26,28 0,57 101,70 25,61 0,83 99,69 25 26,30 0,87 101,78 26,40 0,32 102,76 26 25,96 0,55 100,46 25,58 0,74 99,57 27 26,29 0,36 101,74 25,39 1,58 98,83 28 26,23 0,72 101,51 25,52 1,48 99,34 29 28,89 0,65 111,80 28,78 0,58 112,03 30 26,78 0,45 103,64 26,37 0,24 102,65 31 26,77 0,54 103,60 25,55 1,53 99,46 32 26,30 0,90 101,78 25,49 0,49 99,22 33 25,88 1,30 100,15 25,58 0,83 99,57 34 25,98 1,04 100,54 25,31 0,58 98,52 Chứng 25,84 0,32 100,00 25,69 0,53 100,00