Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 21 123

... sinh tổng hợp kháng sinh, nghiên cứu phát triển để đưa vào ứng dụng điều trị sản xuất quy mô công nghiệp Từ sở tiến hành thực đề tài Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces. .. kháng sinh Streptomyces 21. 123 tạo - Sơ xác định số nhóm chức cấu trúc phân tử kháng sinh Streptomyces 21. 123 sinh tổng hợp PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỂ KHÁNG SINH 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh. .. dịch chiết có thành phần kháng sinh hoạt động - Dung môi n-butanol dung môi chiết hoàn toàn kháng sinh Streptomyces 21. 123 tổng hợp - Kháng sinh Streptomyces 21. 123 sinh tổng hợp tách tinh chế

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • NGUYỄN THỊ HẢI VÂN GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u LÊN MEN SINH TồNG HỢP KHÁNG SINH TỪ CHỦNG STREPTOMYCES 21.123 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC SỸ KHOÁ 2002-2007) Ngưă hướng dẫn : PGS-TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện : Bộ môn Vi sinh-Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiệm 02-05/2007 HÀ NỘI, THÁNG 05/2007 SSI LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến thầy giáo POS­ TS Cao Văn Thu đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên tại Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Vi sinh- Sinh học và Phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Cũng nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng các thầy giáo, cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi xin cảm fn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và ủng hộ tôi trong quá 0 trình học tập và thực hiện khoá luận tốt nghiệp. Vứi điều kiện và thcú gian tiến hành thực nghiệm còn nhiều hạn chế, chắc chắn khoá luận này còn nhiều thiếu sót. Tôi mong nhận được đóng góp ý kiến của các thầy cô và bạn bè để khoá luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2007 Sinh viên NGUYỄN THI HẢI VÂN MỤC LỤC Trang ĐẠT VAN ĐE PHAN I: TONG QUAN 1.1. Đại cương về kháng sinh 1 2 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2 1.1.4. Nguyên tắc sử dụng kháng sinh 3 1.1.5. ứ ig dụng của kháng sinh 3 1.2. Đại cương về xạ khuẩn 1 .2. . Lớp xạ khuẩn ( Actinomycetes ) 1 1.2.2. Đặc điểm xạ khuẳn chi Streptomyces l.S.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phưoíig pháp chọn lọc ngẫu nhiên 1.3.2. Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh 1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 1,4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1. Giống v s v 1.4.2. Lẽn men 1.5. Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.5.1. Chiết xuất 4 4 5 6 6 6 7 8 8 8 9 9 1.5.2. Tách sản phẩm 1 0 1.5.3. Tinh chế 1 0 1.6. Quang phổ hồng ngoại (IR) 1 1 1.7. Một số nghiên cứu mới về công nghệ sinh học 1 1 1.7.1. ốn định Penicillin G acyclase tự nhiên bằng các dung dịch ion 1.7.2. Sự biến đổi sinh học được cải thiện 15- Pluoro- deoxyerythronolid B thành 15- Pluoro- erythromycin A do sự biểu hiện quá mức của gen eryK trong Saccharopolyspora erythraea. 1 1 6 PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 1 2 14 14 2.1.1. Nguyên vật liệu 14 2.1.2. Các phương pháp thưc nghiêm 17 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 2 2 2.2.1. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 23 2.2.2. Kết quả đột biến cải tạo giống 24 2.2.3. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 28 2.2.4. Kết quả chiết xuất kháng sinh 30 30 2.2.5. Hoạt tính KS của Streptomyces 21.123 trên một số chủng VK kiểm định 2.2.6. Kết quả sắc ký lớp mỏng 31 2.2.7. Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh thô 32 2.2.8. Kết quả sắc ký cột 33 2.2.9. Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh tinh chế 35 2.2.10. Sự tương quan giữa nồng độ kháng sinh và đường kính vòng vô khuẩn 2.2.11. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại 37 39 PHAN 3: KET LUẠN VA ĐE XUAT 40 3.1. Kết luận 40 3.2. Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 42 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic E. coli Escherichia coli ACTC 25922 B. cereus Bacilus cereus A T ^ 9946 B. pumilus Bacilus pumilus AT^C 10241 B. subtilis Bacilus subtilis ATạC 6633 P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa P. mirabilis Proteus mirabilis BV 108 S. typhi Salmonella typhi D/T 220 S. lutea Sarcina lutea A T Ì^ 9341 S. flex Shigella flexneri DT 112 S. aureus Staphylococcus aureus A T ^ 1128 Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương KS Kháng sinh MT Môi trường MTdd Môi trường dung dịch SK Sắc ký SKLM Sắc ký lớp mỏng VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn ĐẶT VẤN ĐỂ Hiện nay trên thế giói đã phát hiện được hơn 10.000 chất kháng sinh, trong đó hơn 1 0 0 chất đã được nghiên cứu sâu và đưa vào áp dụng trong lĩnh vực Y học và một số lĩnh vực khác. Việc tìm ra và ứng dụng một chất kháng sinh mới là hết sức khó khăn, trong khi đó kháng sinh có một tầm quan trọng hàng đầu không thể thay thế được để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, ung thư và ngày càng có nhiều v s v gây bệnh kháng lại thuốc kháng sinh. Vì vậy, việc nghiên cứu phát minh các chất kháng sinh mới luôn là vấn đề thời sự hấp dẫn các nhà kinh tế, các nhà nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau: v s v học, Hoá sinh học, Dược lý học,... Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên hoặc được tổng hợp và bán tổng hợp. Trong tổng số các kháng sinh đã phát hiện được có đến hơn 60% là do v s v sinh tổng hợp và đặc biệt là chi Streptomyces thuộc lớp Xạ khuẩn. Tại Việt Nam đã có nhiều đề tài tiến hành phân lập các chủng Streptomyces nhằm tìm kiếm những kháng sinh mói, cải tạo nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh, và nghiên cứu phát triển để đưa vào ứng dụng trong điều trị và sản xuất quy mô công nghiệp. Từ cơ sở trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 21.123 ” với những mục tiêu sau: - Tiến hành nghiên cứu cải tạo giống trong quy mô phòng thí nghiệm để nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Tiến hành lên men sinh tổng hợp, chiết xuất và tinh chế kháng sinh do Streptomyces 21.123 tạo ra. - Sơ bộ xác định một số nhóm chức trong cấu trúc phân tử kháng sinh do Streptomyces 21.123 sinh tổng hợp. PHẦN I TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ KHÁNG SINH 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [5], [14] Theo định nghĩa kinh điển của Waksman (1942): Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên, được các v s v tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các v s v khác. Hiện nay các nhà nghiên cứu cho rằng: Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác, có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định( vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật,...) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp. 1.1.2. Phân loại kháng sinh [5] Có nhiều cách phân loại kháng sinh: Phân loại theo nguồn gốc, theo cấu tạo hoá học, theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng,... Phân loại theo cấu trúc hoá học: - Nhóm có cấu trúc ß- lactam( Penicillin, Cephalosporin) - Nhóm có chứa nhân thơm( Cloramphenicol) - Nhóm có cấu trúc Aminoglycosid ( Streptomycin, Gentamycin) - Nhóm có cấu trúc 4 vòng ( các Tetracyclin) - Nhóm Polypeptid ( E^myxin, Bacitracin) - Nhóm Macrolid ( Erythomycin, Spiramycin) - Nhóm Polyen ( Nystatin, Amphotericin B) - Nhóm Anthracyclin chống ung thư ( Daunorubicin) - Nhóm Actinomycin chống ung thư ( Dactinomycin D) 1.1.3. Cơ ché tác dụng của kháng sỉnh [14] - ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn - úc chế tổng hợp protein của vi khuẩn - ức chế tổng hợp acid nucleic - Thay đổi tính thấm của màng - Úc chế tổng hợp acid folic - Úc chế trao đổi chất hô hấp 1.1.4. Nguyên tắc sử dụng kháng sinh [5] - Phân lập chủng VSV gây bệnh và thử độ nhạy của chúng vói các kháng sinh( lập kháng sinh đồ) bằng phuofng pháp khoanh giấy lọc, v.v... - Chọn kháng sinh có hoạt tính mạnh nhất. - Quyết định liểu dùng, cách đưa kháng sinh vào cơ thể và điều trị một cách hợp lý. - Phối hợp kháng sinh vói các chế phẩm khác( coiticoid, enzym) làm tăng tác dụng và giảm phản ứng phụ. 1.1.5. ứng dụng của kháng sinh [1], [5], [12], [14] • Trong lĩnh vực y học: Trong lĩnh vực y học kháng sinh được ứng dụng khá rộng rãi để phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Từ nửa cuối thế kỷ 20 cùng vói việc phát minh ra kháng sinh, tuổi thọ con ngưòd đã tăng lên rõ rệt từ 35 đến 70 tuổi. • Trong nông nghiệp: - Trong trồng trọt: KS dùng để diệt nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng. KS còn kích thích hạt nảy mầm: ngâm hạt trong dung dịch KS trước khi gieo vừa để kích thích nảy mầm vừa diệt mầm bệnh trong hạt. Có thể phun dung dịch KS cho cây trồng đang bị bệnh hoặc trộn các VSV sinh kháng sinh vào trong đất để tiêu diệt mầm bệnh có trong đất. Những KS thường dùng trong trồng trọt là: + Griseofulvin: chống các bệnh do Botrytis gây ra( bệnh ri sắt ở lúa mỳ). + Blastixidin s, Kasugamycin: chống bệnh vàng lụi ở lúa. + Validamycin : diệt nấm gây bệnh khô vằn hại lúa. + Trichotexin : diệt nấm gây bệnh cho bông. • Trong chăn nuôi: + KS dùng để điều trị các bệnh do v s v gây ra cho động vật: KS griseoviridin chữa bệnh viêm phổi cấp , viêm vú của trân bò. Metimycin hoặc Cloramphenicol dùng điều trị các bệnh do Brucella gây ra,... + KS được sử dụng làm chất kích thích tăng trọng cho đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, kích thích tăng sản lượng trứng ở gà, vịt Chế phẩm Biovit (Biomycin + B12), Teưavit (Teramycin + B12) là chất kích thích tăng trọng lợn, gà, vịt, phòng bệnh ỉa chảy. • Trong công nghiệp thực phẩm: Trong thực phẩm đóng hộp: sử dụng KS để bảo quản thực phẩm tưoi và đóng hộp được lâu hơn. KS nisin thường được dùng để bảo quản thực phẩm đóng hộp như: cà chua, đậu xanh, bắp cải, phomat,... 1.2. Đại cương về xạ khuẩn 1.2.1. Lớp xạ khuẩn ( Actìnomycetes) [4], [8], [14] Xạ khuẩn là một nhóm Vi khuẩn nhân thật ( Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Đa số xạ khuẩn là các v s v Gr(+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Xạ khuẩn được quan tâm nghiên cứu vì có thể tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng. Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trẽn thế giới thì trên 6 6 % là do xạ khuẩn sinh ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzym: amylase, protease, cellulase,v.v,,. và nhiều chất khác. Một số rất ít xạ khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí có thể gây bệnh cho người, động vật và cây trồng. • Đặc điểm hình thái Xạ khuẩn có cấu tạo dạng scri nhỏ, dài, phân nhánh gọi là khuẩn ty. Hệ sợi gồm khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất phát triển sau 1 thời gian thì dài ra thành khuẩn ty khí sinh( khuẩn ty thứ cấp). Khuẩn ty xạ khuẩn đa số không có vách ngăn, màu sắc phong phú: vàng, đỏ, trắng, da cam, lục lam,... Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố: sắc tố tan trong nước, sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ, có loại phụ thuộc pH,... Tập hợp 1 khóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn. Khuẩn lạc xạ khuẩn có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp toả ra theo hình phóng xạ. • Đặc điểm cấu tạo tế bào - Thành tế bào: dạng lưới, dày khoảng 10-12nm. - Màng tế bào chất: chủ yếu là phospholipid và protein, dày 7,5-lOnm. - Mexosom: hình phiến, hình bọng hay hình ống. - Các thể ẩn nhập trong tế bào chất: gồm các hạt polyphosphat, các hạt polysaccarid. 1.2.2. Đặc điểm xạ k h i ^ chi Streptomyces [4], [14], [16] • Đặc điểm hình thái: có các đặc điểm của lớp xạ khuẩn Actinomycetes. Khuẩn ty khí sinh sau 1 thòi gian phát triển trên đỉnh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử mọc đơn hay mọc vòng có nhiều hình dạng: thẳng, uốn cong, móc đofn, xoắn lò xo,... Sinh sản bằng bào tử trần. Bào tử trần có các hình dạng: hình cầu, hình trụ, hình bầu dục, hình que,...Bề mặt bào tử : nhẵn, xù xì, có gai hoặc có tóc. • Đảc điểm sinh lý: Streptomyces là loại v s v dị dưỡng. Nguồn cacbon thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều hợp chất hữu cơ khác. Nguồn Nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn Nitơ vô cơ là nitrat, muối amon,... Streptomyces là loài Xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 25°C-35®C, một số loài có nhiệt độ phát triển cao hơn, pH môi trường tối ưu thường từ ,8-7,5. 6 Khả năng tạo sắc tố: sắc tố tạo thành từ Streptomyces chia thành 4 loại: sắc tố hoà tan, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố của khuẩn ty cơ chất và sắc tố melanoid. 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên [5], [6] Các VSV có sự đột biến tự phát theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 1 0 - 2 0 % những các thể khác. Cần phải chọn lấy những các thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp. 1.3.2. Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh [4], [5], [9] Các chủng xạ khuẩn mới phân lập, kể cả sau chọn lọc ngẫu nhiên thưcmg có hoạt tính kháng sinh thấp và hiệu suất tổng hợp không cao. Do đó để đáp ứng nhu cầu của sản xuất công nghiệp cần cải tạo giống VSV. *Mục đích: - Tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn, rút ngắn thời gian lên men, ít tạo bọt hơn,v.v... - Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết, tách, tinh chế thuận lợi hơn. - Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tao các liên kết mới, nhóm chức mới,v.v... *Tác nhân gây đột biến có thể là: - Tác nhân hoá học: hydroxylamin, nitrozoguanidin, nitrit... - Tác nhân vật lý: ánh sáng u v , tia Rơnghen... Đột biến bằng ánh sáng u v được sử dụng phổ biến trong di truyền chọn giống v s v . Ánh sáng u v tác dụng chủ yếu lên acid nucleic, mạnh nhất là vùng 260nm, dãn đến hiện tượng đimer hoá tymin: 2 tymin gần nhau được liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử C và Q . Hậu quả là sao chép bị sai 5 lầm vì ADN-polymerase dễ lắp nucleotid không chính xác vào vị trí trên. Do 1 tác dụng của ánh sáng u v , trên sợi ADN xuất hiện 1 dimer pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4, ở đây Q của pyrimidin 5’ (T hoặc C) được liên kết vói C của pyrimidin 3’ (thường là C). Đây là các sản phẩm chủ yếu của quá 4 trình đột biến bằng ánh sáng u v . * Các yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng gây chết và tần số phát sinh đột biến: - Liều lượng chiếu: được đặc trưng bởi 3 tham số là thời gian chiếu, khoảng cách chiếu và độ pha loãng bào tử. - Ánh sáng thường: sau khi đột biến bằng tia u v , nếu đem chiếu bằng ánh sáng thường thì sẽ có khoảng 50 đến 80% tế bào được phục hồi do tác dụng của enzym photolyase. Hiện tượng này được gọi là quang phục hoạt. - Các yếu tố khác: nhiệt độ. pH, thành phần môi trường, trạng thái sinh lý cuả v s v bị gây đột biến cũng ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình đột biến. 1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn [4] * Mục đích: - Duy trì hoạt tính, giữ giống v s v có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn định. - Chủng giống không bị tạp nhiễm bỏfi các v s v khác và phage. * Có nhiều phương pháp khác nhau để giữ giống v s v . Trong quy mô phòng thí nghiệm, giống xạ khuẩn thường được giữ trên môi trưòfng thạch nghiêng trong tủ lạnh sâu (từ 2 - 4°C), định kỳ 3 - 6 tháng cấy truyền. 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [2], [5], [6], [9] Là giai đoạn nuôi v s v để chúng tạo ra sinh khối hoặc các sản phẩm trao đổi chất bậc , thường lên men với các điều kiện tốt nhất về dinh dưỡng, 1 2 pH, nhiệt độ, thòd gian...để v s v sinh trưởng và phát triển tốt, tạo ra được tối đa các sản phẩm mong muốn. 1.4.1. Giống v s v Giống v s v trước khi đem cấy vào các bình lên men phải được tuyển chọn cẩn thận. Chỉ những cá thể có hoạt tính như mong muốn mới được truyền giống và nhân lên trong các bình giống cấp 1, 2, 3. 1.4.2. Lên men Có 2 kiểu lên men chính là lên men bề mặt và lên men chìm; - Lên men bề mặt: v s v được nuôi cấy trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc môi trường bán rắn, rắn. v s v sẽ hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt của MT. + ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp. + Nhược điểm: đòi hỏi mặt bằng lớn, khó cơ khí hoá và tự động hoá, giá thành cao. - Lên men chìm: là kiểu lên men mà v s v phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng. Trước khi lên men cần có giai đoạn tạo giống. Tỷ lệ giống trong môi trường lên men thường từ 1 - 10%. Trong quá trình lên men có thể phải cho thêm các chất phá bọt, chất điều chỉnh pH nhằm đảm bảo điều kiện cho quá trình lên men. Tuỳ thuộc vào sản phẩm mà thời gian lên men từ 50 - 120 giờ. Tuy nhiên, hiệu quả lên men tăng khi thời gian lên men được rút xuống. + ưu điểm: sử dụng triệt để môi trường dinh dưỡng, hiệu xuất cao, tiết kiệm mặt bằng, dễ cơ giới hoá và tự động hoá. + Nhược điểm: Đòi hỏi trang bị chịu áp cao, có nguy cơ bị nhiễm trùng toàn bộ. Lên men chìm được chia thành các kiểu sau: + Lên men gián đoạn (hay lên men có chu kỳ): trong suốt thời gian lên men không có bất cứ một tác động bổ sung nào vào hệ thống ngoại trừ việc thông khí, dùng đệm điều chỉnh pH, chất phá bọt. VSV sẽ phát triển qua 4 giai đoạn được gọi là các pha: pha tiềm tàng, pha log, pha dừng và pha suy tàn. Kết thúc quá trình ở giai đoạn nào là tuỳ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất bị đình chỉ ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của VSV hoặc việc sinh tổng hợp đã chậm lại và việc duy trì quá trình lên men không còn kinh tế nữa. Phương pháp này được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như acid amin, kháng sinh... + Lên men có bổ sung: Thực chất là kỹ thuật kéo dài chu kỳ phát triển của VSV khi cho thêm môi trường mới vào dịch lên men một cách ổn định, thay đổi hay định kỳ nhưng không lấy bớt dịch lên men ra. + Lên men liên tục: trong quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lấy ra đồng thể tích dịch lên men. + Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men việc rút bớt dịch lên men và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng không xảy ra liên tục và định kỳ sau những khoảng thời gian xác định. 1.5. Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men [11], [13] Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp do đó kết thúc quá trình lên men, kháng sinh có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men, đồng thời có thể có nhiều thành phần kháng sinh khác nhau và lẫn nhiều tạp chất, vì vậy phải chiết, tách, tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết. 1.5.1. Chiết xuất tách lấy Định nghĩa: chiết là phương pháp dùng 1 hoặc hỗn hợp dung môi để 1 chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. - Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa 2 pha không hoà lẫn được vào nhau. - Các phương pháp chiết: + Chiết bằng dung mồi hữu cơ, + Chiết bằng phương pháp kết tủa, + Chiết bằng nhựa trao đổi ion. 1.5.2. Tách sản phẩm - Định nghĩa: Tách là một nhóm các phương pháp hoá học, vật lý, hoá lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp đơn giản tách riêng ra từng chất. - Phương pháp tách hỗn hợp thường dùng là phương pháp chuyển pha: chuyển một chất hay một số chất từ pha này sang pha khác bằng một dung môi thích hợp. * Sắc ký : Sắc ký là 1 nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Quá trình tách sắc ký thường qua 3 giai đoạn chính: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và phát hiện các chất. SKLM : tiến hành trên 1 bản kim loại hay thuỷ tinh mỏng có tráng một lớp mỏng Silicagel mịn( pha tĩnh), chất lỏng( pha động) sẽ thấm và chạy trên bản mỏng và kéo theo các chất hoà tan nhờ lực mao dẫn. 1.5.3. Tinh chế Mục đích: thu lấy kháng sinh tinh khiết để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Sắc ký cột: là 1 phưorng pháp sắc ký trong đó chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha tĩnh được nhồi trong ống hình trụ gọi là cột. Trong phòng thí nghiệm cột là những ống thuỷ tinh hình trụ dài từ 30-70cm, đường kính từ 13cm, đầu dưới có vòi và một khoá điều chỉnh tốc độ. Chất nhồi cột: Cellulose, oxid nhôm, Silicagel, Cephadex,...Các chất nhồi cột phải được chuẩn hoá để sử dụng một cách thuận lợi. 1.6. Quang phổ hồng ngoại( IR) [13] Quang phổ hồng ngoại là phương pháp đo quang phổ hấp phụ phân tử. Phân tử hấp phụ năng lượng của bức xạ hồng ngoại và bị thay đổi trạng thái dao động. Trong phân tử, khi một nhóm nguyên tử nào đó hấp thu năng lượng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ (đỉnh hấp thụ) trên phổ IR. Như vậy có sự tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ. Người ta có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. 1.7. Một số nghiên cứu mới về công nghệ sinh học 1.7.1. ổ n định Penicillin G acyclase tự nhiên bằng các dung dịch ỉon [17] Penicillin G acyclase ( PGA) là một enzym chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp sản xuất các chất kháng sinh penicillin nhóm ß- lactam. Enzym này thuỷ phân mạch bên của penicillin G và các kháng sinh nhóm ß- lactam liên quan, giải phóng ra -APA là khung cơ bản được sử dụng trong ngành sản 6 xuất bán tổng hợp các penicillin. PGA cũng được sử dụng để bán tổng hợp các kháng sinh nhóm ß-lactam, trong đó enzym xúc tác cho phản ứng ngưng tụ 1 gốc acyl và 1 phân tử -APA. 6 Việc sử dụng các dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp nước-dung môi đồng tan đã làm tăng hiệu suất tổng hợp ß- lactam từ enzym. Tuy nhiên các dung môi dễ bay hơi lại có hại đến môi trường. Nghiên cứu cho thấy rằng PGA tự nhiên ổn định trong dung dịch ion hơn rất nhiều so với dung môi hữu cơ: toluen, diclomethan, propanol-2, ... Ví dụ: thời gian chu kỳ bán huỷ đạt được trong dung dịch [ emim‘^][Tf N ] là 23h 2 , cao gấp 2 0 0 0 lần so vói trong propanol- . 2 Cũng thấy rằng sự có mặt của cơ chất làm cải thiện rất lớn tính ổn định của enzym trong dung dịch ion, trên cơ sở có mặt của các anion tetrafluoborat và hexafluorphosphat, Kết quả là thời gian chu kỳ bán huỷ tăng cao nhất trong dung dịch [ bmim'^liPFg ] cao hơn gấp 9 lần so vói các dung dịch không có cơ chất. Theo đó những lợi ích tiềm năng của những dung môi mới này, cùng vói sự hiệu quả ổn định duy nhất trên PGA có thể mở ra khả năng phát ụển cắc quá trình xúc tác sinh học mới cho sản xuất bán tổng hợp các kháng sinh nhóm p- lactam và tách các hỗn hợp racemic, đặc biệt trong sản xuất các amin tinh khiết bất đối. Các dung dịch ion được sử dụng: - [emim'^liTfjN ]: l-ethyl-3-methylimidazolium bis (trifluormethyl) sulfonyl} imid - [bmim‘^][Tf N ]: l-butyl-3-methylimidazolium bis 2 { trifluormethyl} sulfonyl} imid - [bmim^^líPPé lrl-butyl-S-methylimidaTolium hexafluorphosphat - [omim^^líPPé ]: l-octyl-3-methylimidazolium hexafluorphosphat - [bmim'^li BF4 ]: l-butyl-3-methylimidazolium tetrafluorborat 1.7.2. Sự biến đổi sinh học được cải thiện 15- Fluor- 6- deoxyerythronolid B thành 15- Fluor- erythromycin A do sự biểu hiện quá mức của gen eryK trong Saccharopolyspora erythraea [18] Erythromycin là sản phẩm do xạ khuẩn Saccharopolyspora erythraea trong quá trình lên men và đã được phổ biến sử dụng như một kháng sinh. Sự phát triển các chất tương tự erythromycin dẫn đến thế hệ thứ 2 của các chất kháng sinh nhóm macrolid chư clarithromycin và azithromycin. Quá trình biến đổi sinh học 1 chất mới tương tự dEB thành chất tương 6 tự erythromycin A tương ứng với nó đã được cải thiện bằng cách thêm vào một bản sao ngoại lai của gen eryK vào chủng s. erythraea K39- 14V, một chủng đã được sử dụng từ lâu cho sự biến đổi sinh học một vài chất tương tự 6 dEB. Sự quá biểu hiện của eryK thành K301- 105B dẫn đến có ít nhất thay đổi gấp 5 lần trong luồng hướng đến sản phẩm mong muốn là 15F- EryA. Sản lượng của chất tương tự erythromycin tăng lên 4 lần trong chủng K301- 105B, trong khi đồng thời cải thiện lượng mol do quá trình cung cấp tiền chất. Mặc dù quá trình được cải thiện đã được nghiên cứu rộng rãi đối với sự biến đổi sinh học 15F- dEB, thử nghiệm với các chất tương tự dEB khác cũng có kết 6 6 quả giống vói sự biến đổi sinh học R- EryA tưcfng ứng. Cung cấp nhiều loại chất tương tự erythromycin tạo bởi chủng s. erythraea. Có thể khái quát được rằng sự quá biểu hiện của eryK cho sự biến đổi sinh học bất kỳ chất tương tự 6 dEB nào như thế có thể biến đổi thành chất tưofng tự erythromycin A tương ứng với nó. Sự cải thiện sản lượng cao, năng suất cao này trong quá trình biến đổi sinh học R- dEB sẽ có tác động to lớn trong sự phát triển các chất mới 6 tương tự erythromycin. PHẦN II THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 2.1.1. Nguyên vật liệu • Giống xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 được phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng trên vi khuẩn, có đặc tính di truyền ổn định. Chủng giống do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trưòfng Đại học Dược Hà Nội cung cấp. • Giống vi sinh vật kiểm định Giống v s v kiểm định do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp. VK Gr(+) ^ Bacillus cereus VK Gr(-) 9946 Escherichia coli 25922 Bacillus subtillis ATịC 6633 I Proteus mirabilis BV 108 Bacillus pumỉlus AT^C 10241 Pseudomonas aeruginosa Sarcina lutea AT^C 9341 Salmonella typhi DT 220 Staphylococcus aureus AT^C1128 Shigella flexneri DT 112 Môi trường - Các môi trường nuôi cấy v s v kiểm định: (bảng ) 1 Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy v s v kiểm định '\T T iành phần NaCl m t \ v Cao thịt Pepton Thạch pH (%) (%) (%) (%) Canh thang 0,5 0,3 0,5 - 6 ,8-7,2 Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1 , 8 6 ,8-7,2 - Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (MT): - Các môi trường lên men( MTdd): có thành phần tương ứng vói môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng bỏ thạch. Các môi trưcmg đều được tiệt trùng bằng hoi nước ở latm/30 phút Dụng cụ hoá chất Các dung môi đã sử dụng( bảng 3): Bảng 3: Các dung môi hữu cơ Dung môi Khối luợng riêng Nhiệt độ sôi (g/cm^) (°C) Aceton 0,79 56 Cloroform 1,47-1,48 60-62 n-Butanol 0,81 116-118 0 , 8 8 117-118 Butylacetat Etanol 0,78-0,79 78,3 Dimetylformamid 0,95 153 NH4ƠH25% Trietylamin 0 , 8 8 0,72 Vật liệu dùng cho sắc ký: + Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60F254, Merck + Hạt Silicagel 60 F254, Merck, cỡ hạt 0,06- 0,2mm + Dung môi chạy sắc ký: các dung môi trong bảng 3 + Bình chạy sắc ký + Buret 25ml, 50ml, mao quản. Máy móc thiết bị dụng cụ: + Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030 + Tủ cấy Sanyo Clean Bench + Tủ sấy, tủ lạnh, tủ lạnh sâu + Tủ ấm Trung Quốc 30°c, 37°c + Cân kỹ thuật, cân phân tích 90 + Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV(/1=254 nm), nguồn phát Toshiba 60W-220V + Máy lắc Taitec Bio-Shaker BR 300LF + Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer- Phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội + Máy cất quay Buchi WaterBath B480- Phòng tổng hợp Hoá Dược, bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội. 2.1.2. Các phương pháp thực nghiệm • Phương pháp nuôi cấy và giữ giống Giống Streptomyces 21.123 được cấy trên ống thạch nghiêng MTl, để trong tủ ấm 30°c từ 5-7 ngày, sau khi phát triển tốt được cất giữ trong tủ lạnh sâu định kì cấy truyền 3- 6 tháng 1 lần. • Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên - Tạo hỗn dịch bào tử: Chuẩn bị 1 ống nghiệm chứa lOml, 5 ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng và 1 pipet Iml. Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 21.123 từ ống giống cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng quy ước là thành 1 0 -2 1 0 1 0 *.Sau đó pha loãng -. 6 - Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử có độ pha loãng từ 10 '^-10'^ nhỏ lên bề mặt MTl đã được tiệt trùng trong đĩa Petri. Dùng que trang vô trùng giàn đều giọt hỗn dịch này. Mỗi nồng độ tiến hành làm 3 đĩa song song. Sau đó để trong tủ ấm 30°c trong 6 ngày để xuất hiện các khuẩn lạc. Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát - triển tốt, mọc riêng rẽ, cấy ziczac lên bề mặt MTl đã tiệt trùng trong đĩa Petri. Sau ngày ủ trong tủ ấm 30°c đem thử hoạt tính kháng sinh. 6 • Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán Nguyên tắc: Mẫu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử sẽ khuyếch tán vào môi trường và ức chế sự phát triển của v s v kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn. Tiến hành : - Qiuẩn bị môi trường cấy v s v kiểm định: VK kiểm định được cấy vào MT canh thang, sau 18h- 24h nuôi cấy ờ nhiệt độ 37°c sẽ tạo thành nhũ dịch VK có nồng độ 10^-10* tế bào/ml. Đưa nhũ dịch này vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và làm nguội đến 45-50®C với tỷ lệ 2,5:100. Lắc đều, đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa. Để nguội ở nhiệt độ phòng trước khi đưa mẫu thử vào đĩa. - Đưa mẫu thử vào đĩa vào đĩa Petri chứa môi trường đã cấy VK kiểm định: có 3 phương pháp: + Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch có chứa xạ khuẩn đường kính 6 mm lên bề mặt môi trường đã cấy VK kiểm định. + Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc đưcmg kính mm đã tẩm 6 3 lần dịch chiết chứa mẫu thử và sấy khô ở nhiệt độ dưói 50°c được đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VK kiểm định. + Phương pháp giếng thạch: Nhỏ dịch nước chứa mẫu thử vào các giếng đã được đục trên bề mặt môi trường đã cấy VK kiểm định, mỗi giếng nhỏ 0,05ml. Nuôi cấy: Các đĩa Petri chứa môi trường đã cấy VK kiểm định và mẫu thử được ủ trong tủ ấm 37°c trong 16-24h. - Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer có độ chính xác đến 0,02mm. Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn được xử lý theo công thức: ẺA D = ^ ---n Ỳ (.D ,-D ỹ S = \ ^ ----------- y n-1 D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn D, : Đường kính vòng vô khuẩn thứ i s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n : Số thí nghiệm làm song song. • Phương pháp đột biến bằng ánh sáng u v Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 21.123 - cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng, lắc đều để tạo thành hỗn dịch bào tử có độ pha loãng quy ước là 10'^ Lấy Iml hỗn dịch này pha loãng đến độ pha loãng 10‘^ để làm mẫu chứng, 9ml còn lại đổ vào đĩa Petri vô trùng. Đột biến bằng ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10 * trong đĩa Petri vô trùng được chiếu bằng ánh sáng ư v vói khoảng cách 60cm, thời gian chiếu 5phút, sau đó để tối 2h rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến độ pha loãng độ 1 0 '^. - Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml mẫu chứng 10'^ và 0 , 1 ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các độ pha loãng lo '*, '^ nhỏ lên bề mặt 1 0 MTl đã tiệt trùng trong đĩa Petri. Dùng các que trang vô trùng giàn đều các giọt hỗn dịch bào tử. Mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa cho vào tủ ấm 30°c trong 6 ngày xuất hiện các khuẩn lạc. Đếm số khuẩn lạc, xác định %sống sót theo công thức: % sống sót = = : Số khuẩn lạc sau đột biến. Nq : Số khuẩn lạc trong mẫu chứng. X 100 - Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc đột biến tương tự phép sàng lọc ngẫu nhiên. Làm song song với mẫu chứng, sau 6 ngày ủ ở 30°c , đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. - Xác định % biến đổi hoạt tính theo công thức: % biến đổi hoạt tính = = X Do 1 0 0 D ị: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến. Dq: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng. Các biến chủng nào có % biến đổi hoạt tính kháng sinh (+) cao nhất sẽ được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. • Phương pháp lên men gián đoạn - Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 21.123 nuôi cấy trên MT thạch nghiêng ở 30°c sau 6 ngày được cấy vô trùng sang bình nón 250ml MTdd bằng lOml nước cất vô trùng, sau đó đem lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 30°c, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h. - Lên men: Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa MTdd với tỷ lệ V giôngi trưcmg= I-IO- Các bình lên men được lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 30°c, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h. • Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối, dịch lọc được chỉnh về pH trung tính rồi chiết bằng dung môi n-butanol trong bình gạn với tỷ lệ Vdịcj, lọc: ^dung môi = 5 - » lắc kỹ trong 1 1 phút để 2 pha tiếp xúc với nhau, để yên cho phân lớp tách riêng phần dịch chiết và phần nước. Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của dịch chiết và dịch nước bằng phương pháp giếng thạch và phương pháp khoanh giấy lọc. • Phương pháp tách các thành phần kháng sinh bằng SKLM Bản mỏng SK có kích thước thích hợp được hoạt hoá ở 110°c trong 30ph. Pha dung môi theo đúng tỷ lệ trong bình chạy sắc ký, để cho dung môi bão hoà. Chấm dịch chiết KS lên bản mỏng bằng mao quản, vết chấm có đường kính 0,5mm cách mép dưód 1,0- l,5cm. Sấy khô bản mỏng ở 45-55°C, cho vào bình chạy SK đã bão hoà dung môi. Khi dung môi chạy lên cách mép trên của bản mỏng Icm thì lấy ra đánh dấu vạch dung môi (Ddn,), xác định vết chất bằng các phương pháp: - Soi đèn tử ngoại: Bản mỏng SK tráng sẵn đã được trộn với 1 chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại. Khi soi dưới đèn tử ngoại, nếu có vết thử sẽ cho màu thẫm. - Phương pháp hiện màu hoá học: bản mỏng đã chạy SK được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°c trong 10 phút để phát hiện vết. - Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng đã chạy SK và sấy khô cho vào đĩa Petri vô trùng, đổ môi trường thạch thường vô trùng đã cấy v s v kiểm định, ủ ở 37°c trong 16-24h, nếu có kháng sinh vòng vô khuẩn sẽ xuất hiện. TínhRf: Rf = D.. ^dm Dy : Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết. Ddn,: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi đánh dấu. • Thu bột kháng sinh tinh chê bằng phương pháp cất quay Dịch chiết n-butanol sau khi thử hoạt tính kháng sinh đem cất chân không bằng máy cất quay Buchi Waterbath B480 ở nhiệt độ 70°c thu được bột kháng sinh tinh chế. Cân 1 lượng xác định bột KS tinh chế đem hoà tan trong methanol theo đúng tỷ lệ với dịch chiết đem cất. Thử hoạt tính và SKLM h để kiểm tra sự biến đổi của KS sau khi cất, đồng thời tìm các điều kiện tối ưu cho SK cột. • Tinh chế kháng sinh thô bằng phương pháp sắc ký cột - Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính Icm, dài 50cm. Chất nhồi được dùng là hạt Silicagel 60 F254 Merk cỡ hạt 0,06- 0,2mm. Cân khoảng g 8 hạt chất nhồi, hoạt hoá ở 1 1 0 °c trong Ih, đem hoà thành hỗn dịch vói dung môi chạy và đưa lên cột. ổn định cột trong h. 2 - Đưa mẫu thử lên cột: Bột KS thô hoà tan trong 1 lượng tối thiểu methanol rồi trộn với với 1 lượng hạt Silicagel đã hoạt hoá (khoảng 2g). Sấy ở nhiệt độ 50-60°C cho bay hết methanol rồi cho lên cột đã được ổn định. - Cho dung môi chảy qua cột: Pha hệ dung môi theo đúng tỷ lệ, cho chảy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào các ống nghiệm sạch, khoảng 10-15 phân đoạn, mỗi phân đoạn lOml. - Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: thử hoạt tính kháng sinh của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có hoạt tính KS tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất mà đã nghiên cứu trước. Phân đoạn chính được xác định từ khi bắt đầu xuất hiện vết đến khi không còn vết có Rf tương đương và vẫn có hoạt tính kháng sinh mạnh. • Dự đoán 1 số nhóm chức trong cấu trúc phân tử chất bằng phổ tử ngoại( UV) và hồng ngoại (IR) Bột kháng sinh đã tinh chế tinh khiết về mặt sắc ký, đem đo phổ tử ngoại và hồng ngoại. Dựa trên các pic thu được chúng ta dự đoán các nhóm chức có trong phân tử kháng sinh thu được. 2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT Kết quả nghiên cứu trước cho thấy chủng Streptomyces 21.123 có tác dụng mạnh và ổn định trên 2 chủng VK là p.mirabilis Gr(-) và B.subtilis Gr(+). Vì vậy chúng tôi chọn 2 chủng này làm chủng v s v kiểm định. 2.2.1. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên để chọn ra các dạng chủng tốt nhất của Streptomyces 21.123. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 4. Bảng 4 : Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 21.123 Ký hiệu dạng Kết quả p.mirabilis D s Kết quả Ký B.subtilis hiệu s dạng D chủng (mm) (mm) 2 1 , 0 1 D p .mirabilis s B.subtilis D s chủng (mm) (mm) 19,41 0,83 20,33 0,29 17 19,93 0,48 2 18,93 1,06 20,60 0,26 18 18,81 0,77 20,25 0,16 3 18,88 1,05 20,03 0,39 19 18,45 0,17 20,28 0,26 4 19,14 0,75 20,41 0,19 2 0 18,73 0,57 20,42 0,74 5 17,07 0,78 19,66 0,16 2 1 19,45 0,83 20,93 0,31 6 19,64 0,45 21,09 0,62 2 2 18,81 0,46 20,64 0,57 7 19,29 0,57 20,47 0,28 23 19,47 0,16 21,07 0,40 8 19,53 0 , 1 0 20,83 0,48 24 18,86 0,52 20,38 0,43 9 18,33 0,38 2 0,33 25 18,49 0 1 0 19,72 0,98 21,06 0,43 26 17,11 1,08 19,81 0,29 17,83 0,67 20,06 0 , 2 2 27 17,72 1,42 20,15 0,18 1 2 17,81 0,55 20,09 0,24 28 17,40 0,49 13 16,27 0,56 19,13 0,61 29 18,23 0,09 20,19 0,50 14 17,25 0,47 19,01 0,30 30 17,85 0,34 19,30 0,30 15 17,72 0,47 19,41 0,27 31 17,16 19,23 0,39 16 17,19 0,45 19,25 0,30 32 17,16 1,59 18,97 0,46 1 1 1 0 , 1 0 0 , 1 , 8 0 6 2 0 , 1 1 19,77 0,40 0 , 2 1 0 , 2 1 Nhận x é t: Sau khi tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên chúng tôi xác định cácdạng chủng , 6 1 0 , 17 là những dạng chủng có hoạt tính tốt nhất, đủ điều kiện làm cơ sở cho các bước đột biến cải tạo giống tiếp theo. 2.2.2. Kết quả đột biến cải tạo giống Để làm tăng hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces 21.123 chúng tôi tiến hành đột biến lần 1 dạng chủng số 6 bằng ánh sáng UV( 254nm ) khoảng cách chiếu 60cm, thòi gian chiếu 5 phút. Độ sống sót sau đột biến là 0,12%. Kết được thể hiện ở bảng 5 và hình p.2( PL). Bảng 5: Hoạt tính KS của Streptomyces 21.123 sau đột biến lần 1 Ký hiệu biến chủng 6 . 1 1 0 2 , 8 6 6 . 2 6.3 6.4 6.5 6 . 6 6.7 6 . 8 . 1 2 6.13 6.14 6.15 6.16 Ký hiệu biểh chủng 6.17 6.18 6.19 6 . 2 0 2 1 , 8 6 6 . 2 1 2 1 , 0 0 6 . 2 2 1 0 1 , 1 2 6.9 6.10 6.11 6 Hoat tính k]háng sinh p.mirabilis B.subtilis % biến % biến s s đổi đổi D D hoạt hoạt (mm) (mm) tính tính 21,57 0,60 105,37 23,00 0,45 22,62 0,49 110,50 24,61 1,49 110,06 23,49 0,76 114,75 26,27 0,29 117,48 22,75 0,35 111,14 24,30 0,24 108,68 0,60 106,79 24,24 0,78 108,41 0,78 102,56 22,35 1,38 99,96 23,61 0,44 115,24 24,66 0,47 110,29 21,16 0,82 103,37 22,61 0,51 22,77 1,04 111,24 25,07 1,05 112,07 21,22 0,24 103,66 22,16 0,82 99,11 21,71 0,66 106,06 22,63 0,51 101,21 21,33 037 104,20 32,14 0,46 103,49 21,51 0,57 105,08 23,65 105,77 0,29 103,61 23,90 0,41 106,89 20,59 0,17 100,59 22,82 102,06 0,72 103,57 23,05 0,29 103,09 0 , 6 8 2 1 , 2 1 0 , 2 2 1 , 2 0 0 6.23 6.24 6.25 6.26 6.27 6.28 6.29 6.30 6.31 6.32 Chứng Hoạt tính kháng sinh p.mirabilis B.subtilỉs % biến % biến s đổi s đổi D D hoạt hoạt (mm) (mm) tínii tmii 22.90 0,73 111,87 24,69 110,42 21,90 0,36 106,99 23,49 0,61 105,05 21,81 0,48 106,55 23,65 0,28 105,77 21,81 0,48 106,55 23,65 0,28 105,77 22,14 0,83 108,16 23,41 0,35 104,70 20,76 0,47 101,42 22,65 1,07 101,30 21,45 0,62 104,79 22,17 1,23 99,15 20,37 0,54 99,51 0,36 101,97 21,11 0,77 103,13 22,15 1,33 99,06 20,95 0,40 102,34 22,91 0,61 102,46 21,45 0,89 104,79 23,01 0,40 102,91 21,71 0,35 106,06 24,33 0,96 108,81 20,40 0,77 99,66 22,58 100,98 20,83 0,63 101,76 23,17 0,39 103,62 21,27 0,59 103,92 23,54 0,33 105,28 20,95 0,61 102,34 22,75 0,65 101,74 20,47 100,00 22,36 0,17 100,00 1 , 0 1 2 2 , 8 0 0 , 8 8 , 2 0 Nhận xét: Sau đột biến lần 1 chúng tôi thấy biến chủng 6.3 có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất, do đó chúng tôi sử dụng biến chủng này để tiếp tục tiến hành đột biến lần 2 với cách tiến hành giống như đột biến lần . 1 Độ sống sót sau đột biến là 0,17%. Kết quả đột biến lần 2 được thể hiện ở Bảng và hình p.3( PL). 6 Bảng Ký hiệu biến chủng 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.3.4 6.3.5 6.3.6 6.3.7 6.3.8 6.3.9 6.3.10 6.3.11 6.3.12 6.3.13 6.3.14 6.3.15 6.3.16 6 : Hoạt tính của Streptomyces 21.123 sau đột biến lần 2 Hoat tính ]kháng sinh p .mirabilis B.subtilis % biến % biến s đổi s đổi D D hoạt (mm) hoạt (mm) tính tính 25,44 0,46 108,58 23,94 0,56 98,48 25,71 0,49 109,73 24,93 0,50 102,55 26,45 0,69 112,89 27,02 0,36 111,15 26,39 0,94 112,63 26,67 0,32 109,71 25,09 0,70 107,08 24,61 0,23 101,23 24,67 0,63 105,29 23,85 1,07 98,11 24,02 0,31 102,52 24,59 0,42 101,52 26,08 0,22 111,31 25,85 0,49 106,33 23,63 0,25 100,85 24,32 0,79 100,04 24,07 0,33 102,73 24,89 102,39 24,20 0,07 103,29 23,78 0,47 97,82 24,43 0,62 104,27 24,27 0,58 99,83 24,65 0,96 105,21 24,72 0,57 26,66 0,60 113,79 25,50 0,94 104,89 23,92 0,72 102,09 24,58 23,73 0,60 101,28 23,32 0,24 95,93 0 , 2 1 1 0 1 , 6 8 1 , 0 1 1 0 1 , 1 1 Ký hiệu biến chủng 6.3.17 6.3.18 6.3.19 6.3.20 6.3.21 6.3.22 6.3.23 6.3.24 6.3.25 6.3.26 6.3.27 6.3.28 6.3.29 6.3.30 6.3.31 6.3.32 Chứng Hoạt tính kháng sinh p.mirabilis B.subtỉlis % biến % biến s đổi s đổi D D hoat hoạt (mm) (mm) tứih tính 25,54 0,64 109,01 24,28 0,72 99,87 25,18 107,47 24,35 0,85 100,16 24,98 1,07 106,61 24,87 1,27 102,30 24,97 0,71 106,57 24,02 1,17 98,81 19,85 0,54 84,72 18,98 0,62 78,07 24,84 0,26 106,02 24,09 0,59 99,09 23,95 1,44 24,67 0,45 101,48 24,35 1,09 103,93 24,23 0,50 99,67 24,53 0,25 104,69 25,16 0,96 103.50 25,03 0,48 106,83 23,43 0,27 96,38 24,90 0,62 106,27 24,32 0,84 100,04 25,14 0,27 107,30 24,89 0,32 102,39 24,06 0,55 102,69 24,65 0,23 101,39 20,52 0,56 87,58 19,96 0,48 82,11 26,32 0,69 112,33 25,97 0,68 106,83 23,18 0,61 103,34 23,50 96,67 23,43 0,50 24,31 0,32 0 , 2 0 1 0 2 , 2 2 0 , 6 6 1 0 0 , 0 0 1 0 0 , 0 0 Nhận xét: Sau đột biến lần 2, hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 21.123 đã tăng lên đáng kể, trong đó các chủng 6.3.3, 6.3.8, 6.3.14, 6.3.31 là những chủng có % biến đổi hoạt tính cao được sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.3. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh • Kết quả lên men trên các MT lên men khác nhau Tiến hành lên men chủng Streptomyces 21.123 trên các môi trường lên men khác nhau để chọn được môi trường lên men tốt nhất. Đánhgiá hoạt tính kháng sinh của dịch lọc sau khi lên men bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 7. Bảng 7: Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 21.123 trên các môi trường lên men khác nhau khi lên men chìm \^ K ế tq u ả Hoạt tính kháng sinh p . mirabilis B. subtilis MT lên m e n \ ^ MTldd D s D s 23,47 0,31 22,56 0,74 MT2dd 21,56 0,98 20,77 0,45 MT3dd 16,72 0,62 15,32 0,13 MT4dd 14,34 0,57 14,94 0,71 MT5dd 20,18 0,23 21,96 0,49 Nhận xét: Qiủng Streptomyces 21.123 cho hoạt tính kháng sinh tốt nhất khi lên men trên MTldd. Vì vậy chúng tôi chọn MTldd làm môi trưòỉng để tiến hành các lần lên men tiếp theo. • Kết quả lên men trên M Tldd Tiến hành lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm trên máy lắc chủng gốc và các biến chủng tốt nhất ở các lần đột biến. Dịch lên men sau khi lọc loai bỏ sinh khối, đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả được trình bày ở Bảng và hình p.4( PL). 8 Bảng 8 : Kết quả lên men trên MTldd với các biến chủng khác nhau Hoạt tính kháng sinh Ký hiệu p .mirabilis B.subtilis biến D chủng (mm) Gốc 22,65 0,67 23,15 0,69 2 0,63 24,20 0,49 6 2 , 1 s 0 D s (mm) 6.3 24,33 0,69 25,13 0,58 6.7 22,59 0 22,18 0,61 6.9 24,81 0,40 25,43 0,41 6.17 23,55 0,42 24,23 0,74 6.3.3 25,15 0,40 25,56 0,52 6.3.4 25,39 0,29 24,36 0,30 6.3.8 22,71 0,25 22,77 0,54 6.3.14 24,99 0,60 24,33 0,16 6.3.31 24,02 0,49 23,92 0,17 , 1 2 Nhận xét: Biến chủng 6.3.3 có hoạt tính kháng sinh cao nhất và ổn định trên MTldd. Vì vậy chúng tôi chọn biến chủng này làm chủng chủ yếu cho các phưoỉng pháp cải tạo và lên men sau này. 2.2.4. Kết quả chiết xuất kháng sinh Tiến hành chiết KS một lần bằng dung môi n-butanol ở pH trung tính với tỷ lệ : Vđịcu lọc = 1:5, đánh giá hoạt tính kháng sinh của pha n- butanol và pha nước sau khi chiết bằng phương pháp giếng thạch và phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày ở bảng 9: Bảng 9: Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng n-butanol Hoạt tính kháng sinh \ quả Mẫu t h ử \ ^ p.mirabỉlis B.subtỉlis s D (mm) D s (mm) Dịch lọc KS 22,34 0,58 23,14 0,72 Pha n-butanol 24,11 0,34 25,29 0,16 Pha nước 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 Nhận xét: n-butanol có thể chiết kháng sinh hoàn toàn từ dịch lọc. 2.2.5. Hoạt tính KS của Streptomyces 21.123 trên một số chủng VK kiểm định Dùng dịch chiết n-butanol để thử hoạt tính KS của Streptomyces 21.123 trên các chủng VK kiểm định khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 10. Bảng 10: Hoạt tính của Streptomyces 21.123 trên các chủng vi khuẩn kiểm định VK Gr(-) Tên E. coli VKGr(+) D(mm) 0 , 0 0 s 0 , 0 0 Tên D (mm) B. cereus 18,72 s 0 , 6 8 p. aeruginosa 21,75 0,65 B. pumilus 20,53 0,60 p. mirabilis 22,80 0,85 B. subtilis 23,68 0,19 s. lutea s. aureus 22,04 0,91 22,19 0,83 s.flexneri s. typhi 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 Nhận xét: Kháng sinh do chủng Streptomyces 21.123 sinh tổng hợp có tác dụng trên cả vi khuẩn Gr(-) và Gr(+) đối với 7/10 vi khuẩn thử. 2.2.6. Kết quả sắc ký lớp mỏng Sau khi chiết kháng sinh bằng n-butanol ta tiến hành SKLM để xác định thành phần kháng sinh và làm cơ sở cho việc tinh chế sau này. SKLM với các hệ dung môi: Hệ 1: aoroform : Methanol: 2 5 %NH 4 0 H( 2: 2:1) Hệ 2: n-Butanol: Ethanol: Dimethylformamid (3: 1:1) Hệ 3: Buthylacetat: Acetone : Trietylamin (1:2: ) 1 Hệ 4: n-Butanol: Ethanol: Trietylamin (3 :1 : 0,2) Kháng sinh được phát hiện bằng phương pháp v s v . Kết quả sắc ký được trình bày ở Bảng 11. quả Rf Hệ dung môi 1 0.97 2 0 3 0,89 4 0.87 , 8 6 Nhận xét: Sắc ký đồ với các hệ dung môi dều có 1 vết, như vậy sơ bộ có thể kết luận dịch chiết KS Streptomyces 21.123 có ít nhất một thành phần kháng sinh hoạt động. 2.2.7. Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh thô Bột kháng sinh thô được kiểm tra sự biến đổi hoạt tính kháng sinh và các thành phần kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc và SKLM với các hệ dung môi như trên, tiến hành song song để so sánh với dịch chiết nbutanol. Kết quả được trình bày ở Bảng 12 và Bảng 13. Bảngl2: Kết quả kiểm tra sự biến đổi hoạt tính KS của bột KS thô. \ Mẫu Hoạt tính kháng sinh D s (mm) Kết quả \ Bột KS thô/methanol Dịch chiết n-buthanol B.subtilis p.mirabilis \ % biến D đổi hoạt (mm) s % biến đổi hoạt tính tinh 22,94 0,72 101,91 24,37 0,49 22,51 0,36 1 0 0 , 0 0 23,92 0,62 1 0 1 , 8 8 1 0 0 , 0 0 Kết quả Rf Bột KS Dịch chiết thô/methanol n-buthanol 0,97 0,97 2 0 , 8 6 0 , 8 3 0,89 0,89 4 0,87 0,87 Hệ 1 6 Nhận xét: Hoạt tính kháng sinh của bột KS thô thay đổi không đáng kể. sắc ký đồ của dịch chiết n-butanol và dịch KS thô/methanol cho các vết trùng nhau. Như vậy hoạt tính và các thành phần của bột KS thô coi như không thay đổi sau khi cất chân không. 2.2.8. Kết quả sắc ký cột Cân 1 lượng kháng sinh thô là 0,4781 g đem tiến hành sắc ký lỏng trên cột với hệ dung môi 4, thu được 15 phân đoạn dịch phản hấp phụ.Thử hoạt tính kháng sinh của 15 phân đoạn này bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả thu được ở Bảng 14 và hình P.5 (PL). Bảng 14: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh các phân đoạn SK \ ^ ế t quả Hoat tính k tiáng sinh p.mira bilỉs B.subtỉlis s s D(mm) D (mm) Phân đoầo 0 0 24,40 23,86 21.05 17.78 14,59 10,36 7.03 2 3 4 5 6 7 8 0 0,52 0,28 0,48 0,58 0,78 0,13 0,24 0 23.57 22,32 20,58 16,24 13,33 10,01 6,35 0.39 0,97 0,38 0.46 0.57 0.04 0.25 9 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 1 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 1 1 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 1 2 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 , 0 0 0 , 0 0 13 14 15 0 Nhận xét: Các phân đoạn 2, 3, 4, 5, , 7, 6 8 có hoạt tính kháng sinh được giữ lại để nghiên cứu tiếp. Các phân đoạn 2, 3, 4 có nồng độ KS đậm đặc nhất. Tiến hành SKLM các phân đoạn này với hệ dung môi 4, kết quả được trình bày ở Bảng 15 vàhìnhP . 6 (PL). Bảng 15: Kết quả SKLM vói hệ dung môi 4 trên B.subtilis Phân đoạn 2 3 4 5 6 7 8 Rf 0,87 0,87 0,87 0,87 0,87 0,87 0,87 Nhận xét: Sắc ký đồ của các phân đoạn cho các vết trùng nhau. Do đó có thể kết luận rằng các phân đoạn 2, 3, 4, 5, , 7, 6 8 là các phân đoạn chứa cùng một chất kháng sinh. Lấy các phân đoạn 2, 3,4, 5 làm các phân đoạn chính. Đem cất chân không các phân đoạn chính, thu được bột KS đã tinh chế có màu đỏ thẫm, khối lượng là 0,3358(g). Hiệu suất của quá trình tinh chế là: H= 0,3358 X100 =70,24% 0,4781 2.2.9. Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh đã tinh chế Lấy 1 lượng bột kháng sinh đã tinh chế và 1 lượng kháng sinh thô hoà tan trong methanol theo cùng tỷ lệ. Tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của 2 dịch thu được bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày ở Bảng 16. Bảngl : Kết quả kiểm tra sự biến đổi hoạt tính KS của bột KS tinh chế 6 \ Kết quả Hoạt tính kháng sinh p .mirabilis \ D Mẫu thử\ s (mm) B.subtỉilis % biến D đổi hoạt (mm) s đổi hoạt tính Bột KS tinh % biến tính 23,54 0,32 102,52 25,03 0,69 102,67 22,96 0,57 100,00 24,38 0,12 100,00 chế/methanol Bột KS thô/ methanol Nhận xét: Tiến hành SKLM với dịch KS tinh chế và dịch KS thô với hệ dung môi 4 và hiện hình bằng phương pháp VSV với VK kiểm định là B.subtilis. Kết quả sắc ký đồ của 2 vết trùng nhau. Bột kháng sinh tinh chế tinh khiết hơn bột kháng sinh thô, các thành phần của bột KS tinh chế vẫn được giữ nguyên. Như vậy bột KS này đã tinh khiết về mặt sắc ký. • So sánh hoạt tính kháng sinh của bột KS tinh chế trong các dung môi khác nhau: Hoà tan 1 lượng bột kháng sinh tinh chế trong aceton và methanol theo cùng tỷ lệ. Đem thử hoạt tính kháng sinh của 2 dịch này bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày ở Bảng 17. Bảng 17: Kết quả kiểm tra hoạt tính của bột KS đã tinh chế trong các dung môi khác nhau \ Kết quả \ Mẫu t h ử \ Hoạt tính kháng sinh p.mirabilis D B.subtilis s (mm) Bột KS tinh D~ s (mm) 22.61 0.93 23,02 0,31 22,47 0,72 23,34 0.84 chế/ aceton Bột KS tinh chế/ methanol Nhận xét: Hoạt tính kháng sinh của bột KS tinh chế trong 2 dung môi trên là tương đương. Tiến hành SKLM với dịch KS tinh chế/ aceton và dịch KS tinh chế/ methanol với hệ dung môi 4, hiện hình bằng phương pháp v s v vói VK kiểm định là B. subtilis. Kết quả sắc ký đồ cho 2 vết trùng nhau. Như vậy thành phần của bột KS tinh chế không thay đổi khi hoà tan trong aceton so với trong methanol. 2.2.10. Sự tương quan giữa nồng độ kháng sinh và đường kính vòng vô khuẩn - Hoạt tính KS của dịch chiết n-butanol ở các nồng độ pha loãng khác nhau: Dịch chiết n-butanol được quy định nồng là , đem pha loãng thành các 1 nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 bằng dung môi n-butanol. Đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày ở Bảng 18. Bảng 18: Hoạt tính KS của dịch chiết n-butanol ở các nồng độ pha loãng khác nhau \ Kết quả Hoạt tính kháng sinh p.mirabilis \ D Nồng đợ\ s (mm) B.subtilis D s (mm) 1 / 1 20,31 0,37 20,81 0,59 1 / 2 19,16 0,07 19,48 0,50 1/4 18,00 0,51 17,97 0,49 1 / 8 16,88 0,71 16,10 0,40 1/16 15,02 0,98 14,75 0,32 1/32 13,83 0,49 13,30 0,40 1/64 11,79 0,78 1 1 , 2 1 0,62 Nhận xét: Khi nồng độ kháng sinh trong dịch chiết n-buthanol giảm dần thì đường kính vòng vô khuẩn cũng giảm tương ứng. - Hoạt tính KS của KS tinh chế/ methanol ở các nồng độ pha loãng khác nhau: Cân chính xác lOmg kháng sinh tinh chế hoà tan bằng methanol trong bình định mức lOOml được dung dịch có nồng độ quy ước là 1/1. Dùng micropipet để pha loãng bằng methnol thành các dung dịch có độ pha loãng lần lượt là 1/2, 1/4, / , 1/16, 1/32, 1/64. Thử hoạt tính kháng sinh của các 1 8 dịch thu được bằng phưoỉng pháp giếng thạch. Kết quả được trình bày ở Bảng 19 và R7(PL). Bảng 19: Hoạt tính KS tinh khiết trong methanol ở các nồng độ pha loãng khác nhau \ Kết quả Hoạt tính kháng sinh p.mirabilis B.subtilis s D (mm) Mẫu thử \ s D (mm) 25,58 0,07 26,28 0,14 1 / 2 23,89 0,37 24,61 0,27 1/4 22,11 0,39 23,44 0 1 / 8 20,92 0,24 22,17 0,15 1/16 19,13 0,54 2 0 , 0 1 0,32 1/32 16,24 0,37 17,09 0 1/64 13,86 0,71 14,85 0,72 1 / 1 Methanol ' 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 , 2 2 , 6 6 , 0 0 Nhận xét: Từ bảng kết quả chúng tôi thấy khi nồng độ kháng sinh tinh khiết trong methanol giảm dần thì đường kính vòng vô khuẩn cũng giảm tưoíig ứng. 2.2.11. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại Bột kháng sinh đã tinh chế đem đo phổ hồng ngoại bằng phuofng pháp viên nén KBr trên máy Perkin Elmer trong vùng 4000-500cm ‘ tại phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội. Kết qủa phổ được trình bày ở hình PL. Dựa vào kết quả đo phổ và bảng các tần số đặc trưng của các nhóm chức trong phổ hồng ngoại ở các tài liệu tham khảo [11], [14], có thể nhận biết các dải hấp thụ của các nhóm chức và liên kết như sau: + 3271 cm ' đặc trưng cho liên kết -NH (amid) hoặc -OH (phenol) + 2927 cm'^däc trưng cho liên kết C-H (- CH2-, - CH3) + 1746 em'* đặc trưng cho liên kết >c=0 của nhóm chức este + 1668 cm *đặc trưng cho liên kết >c=0 của nhóm chức amid + 1583 cm'^ và 1474 cm *đặc trưng cho liên kết C:::C của vòng bezen + 1193 cm *và 1096 cm *đặc trưng cho liên kết C- H của vòng benzen. Như vậy sơ bộ có thể kết luận được kháng sinh do Streptomyces 21.123 sinh tổng hợp có các nhóm chức este, amid, - CH3, nhân benzen. PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1. Kết luận Sau quá trình nghiên cứu chúng tôi đã hoàn thành được mục tiêu đề ra và rút ra một số kết luận sau: - Chủng Streptomyces 21.123 được đột biến cải tạo giống kết hợp với sàng lọc qua 2 thế hệ và chọn được một số biến chủng có hoạt tính cao hơn so với chủng ban đầu. - Tiến hành sắc ký lớp mỏng trên các hệ dung môi, kết quả cho thấy trong dịch chiết có ít nhất 1 thành phần kháng sinh hoạt động. - Dung môi n-butanol là dung môi chiết được hoàn toàn kháng sinh do Streptomyces 21.123 tổng hợp. - Kháng sinh do Streptomyces 21.123 sinh tổng hợp có thể tách và tinh chế bằng phưoíig pháp sắc ký lỏng trên cột với chất hấp phụ là Silicagel 60P254 Merck cỡ hạt 0,06-0,2mm và hệ dung môi 4. Hiệu suất của quá trình tinh chế là khá cao. ^ (^^ồng độ kháng sinh giảm thì đưòỉng kinh vòng vô khuẩn cũng giảm theo đường tuyến tính. - Trong cấu trúc phân tử của kháng sinh do Streptomyces 21.123 tổng hợp có thể có các nhóm chức sau: nhân benzen, nhóm amid, nhóm este, CH3 v 3.2. Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu đột biến bằng ánh sáng u v nhằm thu được nhiều chủng đột biến dương cao hcfn. - Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện lên men để nâng cao hiệu suất lên men. - Tiếp tục phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối để có thể xác định được cấu trúc hoá học cũng như tiến hành xác định các đặc tính lý, hoá của kháng sinh này. TÀI LIỆU THAM KHẢO [ ]. Kiều Hữu Ảnh ( 1999), Giáo trình vi sình vật học công nghiệp, NXB 1 Khoa học và Kỹ thuật, tr 167-186. [2]. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và Kỹ thuật. [3]. Hoàng Thị Hồng cẩm (2006), Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ S trep tom yc^^L 12^K hoá luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội. [4]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục, tr 38-41. [5]. Từ Minh Koóng, Hoàng Lệ Xuân (2006), Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm, tập 2, trường Đại học Dược Hà Nội, tr 42-54. [ ]. Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học và sản xuất Dược 6 phẩm, NXB Y học, tr 42-54. [7]. Lương Đức Phẩm ( 2004), Công nghệ Vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, tr 106-116. [ ]. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, tr 8 34-38, 89—97. [9]. Trần Thị Thanh, (2001), Công nghệ Vi sinh, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 40-52. [10]. Nguyễn Quỳnh Trang, (2005), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ S tr e p to m y c e s ^ L lỉ^ Khoá luận tốt nghiệp dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội. [11]. Nguyễn Đình Triệu, (2001), Các phương pháp phân tích hoá lý, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 476- 489. [12]. Bộ môn Dược lý( 2006), Dược lý học, tập 2, tniofng Đại học Dược Hà Nội,tr 112- 220. [13]. Bộ môn Hoá phân tích( 2006), Hoá phân tích, tập 2, trường Đại học Dược Hà Nội, tr 62- 69, 214- 220. [14]. Bộ môn Vi sinh- Sinh học (2005), Vi sinh vật học, trường Đại học Dược Hà Nội, tr 25-29, 37-46, 73-88. [15]. O.Keyser, RH.Muller (2003), Pharmaceutical Biotechnology, Wiley VCH, tr 9-23. [16]. T.Kieser, M.J Bibb, M.J Buttner et all (2000), Practical Streptomyces Genertìc, The John Inner Foudation, Norwich, UK, tr 10-23. [17]. Atonia p. de los Rios, Francisco J.Henández- Fernández, Manuel Rubio, Demetrio Gómez anh Gloria Villora. (February, 2007), “Stabilization of native penicillin G acylase by ionic liquids”, Journal o f Chemical Technology and Biotechnology, vol 82, p 190- 194. [18]. Ruchir P.Desai, Eduardo Rodriguez, Jorge L. Galazzo and Peter Licari. ( December, 2004), “ Improved Bioconversion of 15- Fluoro- 6deoxxyerythronolide B to 15- Fluoro- erythromycin A by Overexpression of the eryK Gene in Saccharopolyspora erythraed’\ Biotechnology Progesser, vol 20, p 1660- 1665. t ĩ ^ .; ‘ ỉ , Hình P.2: Hoạt túoh kháng sinh của Streptomyces 21.123 sau đột biến 1 ( VK kiểm đinh B. subtilis) Hình P.3: Hoạt túứi chủng Streptomyces 21.123 sau đột biến 2 ( Vi khuẩn kiểm định B. subtilis) Hình P.4: Hoạt tứứi KS của Streptomyces 21.123 sau lên men trên MTldd ( VK kiểm định B. subtilis) Hình P.5: Hoạt tứứi kháng sinh các phân đoạn 2,3,4,5,6 sau khi sắc ký cột (VK kiểm định B. Subtilis) Hình P. : Kết quả KLM phân đoạn 2 bằng hệ dung môi 4 ( Y Kk i ểm địnhB.Subtiliĩ) 6 Hình P. : Hoạt tính KS trong methanol ở các nồng độ pha loãng khác nhau 7 F6RKflV£UMER 07/04/04 09:04 Phong TNTT Z: 1 scan, 4.0cm-l, smooth tiau 21P [...]... tính kháng sinh của Streptomyces 21. 123 đã tăng lên đáng kể, trong đó các chủng 6.3.3, 6.3.8, 6.3.14, 6.3.31 là những chủng có % biến đổi hoạt tính cao được sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 2.2.3 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh • Kết quả lên men trên các MT lên men khác nhau Tiến hành lên men chủng Streptomyces 21. 123 trên các môi trường lên men khác nhau để chọn được môi trường lên. .. dịch lên men ra + Lên men liên tục: trong quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lấy ra đồng thể tích dịch lên men + Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men việc rút bớt dịch lên men và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng không xảy ra liên tục và định kỳ sau những khoảng thời gian xác định 1.5 Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men. .. môi trường lên men tốt nhất Đánhgiá hoạt tính kháng sinh của dịch lọc sau khi lên men bằng phương pháp giếng thạch Kết quả được trình bày ở bảng 7 Bảng 7: Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 21. 123 trên các môi trường lên men khác nhau khi lên men chìm \^ K ế tq u ả Hoạt tính kháng sinh p mirabilis B subtilis MT lên m e n \ ^ MTldd D s D s 23,47 0,31 22,56 0,74 MT2dd 21, 56 0,98 20,77... 0,23 21, 96 0,49 Nhận xét: Qiủng Streptomyces 21. 123 cho hoạt tính kháng sinh tốt nhất khi lên men trên MTldd Vì vậy chúng tôi chọn MTldd làm môi trưòỉng để tiến hành các lần lên men tiếp theo • Kết quả lên men trên M Tldd Tiến hành lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm trên máy lắc chủng gốc và các biến chủng tốt nhất ở các lần đột biến Dịch lên men sau khi lọc loai bỏ sinh khối, đem thử hoạt tính kháng. .. hoá, giá thành cao - Lên men chìm: là kiểu lên men mà v s v phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng Trước khi lên men cần có giai đoạn tạo giống Tỷ lệ giống trong môi trường lên men thường từ 1 - 10% Trong quá trình lên men có thể phải cho thêm các chất phá bọt, chất điều chỉnh pH nhằm đảm bảo điều kiện cho quá trình lên men Tuỳ thuộc vào sản phẩm mà thời gian lên men từ 50 - 120 giờ Tuy... vào việc sinh tổng hợp hoạt chất bị đình chỉ ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của VSV hoặc việc sinh tổng hợp đã chậm lại và việc duy trì quá trình lên men không còn kinh tế nữa Phương pháp này được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như acid amin, kháng sinh + Lên men có bổ sung: Thực chất là kỹ thuật kéo dài chu kỳ phát triển của VSV khi cho thêm môi trường mới vào dịch lên men một... để đáp ứng nhu cầu của sản xuất công nghiệp cần cải tạo giống VSV *Mục đích: - Tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn, rút ngắn thời gian lên men, ít tạo bọt hơn,v.v - Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết, tách, tinh chế thuận lợi hơn - Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tao các liên kết mới, nhóm chức mới,v.v *Tác nhân gây đột biến có thể... dịch lên men [11], [13] Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp do đó kết thúc quá trình lên men, kháng sinh có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men, đồng thời có thể có nhiều thành phần kháng sinh khác nhau và lẫn nhiều tạp chất, vì vậy phải chiết, tách, tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết 1.5.1 Chiết xuất tách lấy Định nghĩa: chiết là phương pháp dùng 1 hoặc hỗn hợp dung môi để 1 chất... khi đem cấy vào các bình lên men phải được tuyển chọn cẩn thận Chỉ những cá thể có hoạt tính như mong muốn mới được truyền giống và nhân lên trong các bình giống cấp 1, 2, 3 1.4.2 Lên men Có 2 kiểu lên men chính là lên men bề mặt và lên men chìm; - Lên men bề mặt: v s v được nuôi cấy trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc môi trường bán rắn, rắn v s v sẽ hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường và sử dụng... 2.1.1 Nguyên vật liệu • Giống xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Streptomyces 21. 123 được phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng trên vi khuẩn, có đặc tính di truyền ổn định Chủng giống do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trưòfng Đại học Dược Hà Nội cung cấp • Giống vi sinh vật kiểm định Giống v s v kiểm định do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp VK Gr(+)