HỆ VECTOR SEM LIKIFOREST VIRUS: NGHIÊN c ứ u PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR VÀ ỨNG DỤNG TRONG SINH - Y - D ợ c Pham Thi Hồng Nhung* Đinh Đoàn Long* *Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: cải biến vector SFV nhằm xây dựng hệ thống vecíor SFV biểu protein người nhcmh hiệu Phương pháp nghiên cứu: sử dụng ìã thuật ADN tải tổ hợp khuếch đại gen, tạo đoạn ADN ỉinker, cắt - nối ADN tạo vùng trình tự ADN mới, biến nạp vector vào tế bào E Coli khả biến, nhân dòng, sàng lọc bảo quản dòng vi khuẩn mang vector quan tâm Kết quả: vector SFV cải biến có thêm vùng trình tự giúp tăng cưởng dịch mã, mở rộng đa dạng hỏa vùng nhân dòng đa điểm, thêm vùng gen mã cho FLAG-tag, HlS-tag vị ừ-ỉ thrombỉn giúp tinh xác định protein tái tổ hợp dễ dàng Két luận: hệ vector SFV phiên cải hiển công cụ tiềm cho phép biểu mạnh protein tải tổ hợp - phần thiếu nghiên cửu sinh học phân tử, nghiên cứu thuốc, sản xuất vaccine điểu trị bệnh liệu pháp gen ngày Từ khóa: Vector Semliki Porest vừus, biểu protein, ADN tái tổ hợp SEMLIKIFOREST VIRUS VECTORS: VEC TO R DEVELOPMENT AND APPLICATIONS IN BIOLOGY - MEDICBVE - PHARACY SUMMARY Objectives: improving SFV vectorfor deveỉoping fast and high-level expressỉon SFV vecíor system o f human proteins Method: using DNA recombinant techniques such as gene amplìfication, creating the linker segment, cutting and linking the DNA, preparation and trans/ormatìon o f competent E.Coli, screening bacterial colonies andstoringsamples Resutts: modifledSFVvectors have the enhcmce sequence, expand and dtversỊỊỳ moleculco' cloning site, the sequences for puriýìcion and detection o f recombỉnant proteins (FLAG-tag, HlS-tag, thrombin site) Conclusion: SFV vector system yvith modựied version is the potential toolfor recombinant protein expression which an essential part o f molecular bỉology research, drug discoveìy, vaccine productỉons ơnd gene therapỉc nowadays Keywords: Semliki Porest virus vector, protein expression, DNA recombinant I ĐẶT VẨN ĐÈ Ngày nay, biểu protein tái tổ hợp phần quan trọng nghiên cứu sinh học phân tử phát triển tìiuốc Nhu cầu biểu nhanh mức độ cao gen nhanh chóng tăng cao trình tự gen người giải mã hồn chỉnh Nhiều hệ tìiống vector virus khơng phải virus phát triển cho mục đích Semiliki Porest Virus (viết tắt SFV) virus có hệ gen ARN (+) thuộc họ Togaviridae, chi Alpha vừus Để phát ưiển hệ vector tìr vừus này, hệ gen vừus chia ứiành vector: vector nhân dòng vector hỗ ừợ Vector nhân dòng (replicon vector) gồm tìình tự gen mã hóa phức hệ RNA replicase gồm protein phi cấu trúc (kí hiệu nsPl-4) vị ừí nhân dịng chèn gen ngoại lai Vector hỗ trợ (helper vector) xóa bỏ phần lớn vùng gen mã cho protein phi cấu trúc, giữ lại nguyên vẹn vùng gen mã hóa cho protein cấu trúc vỏ ứiam gia vào đóng gói virus [ 1] Vector SFV có nhiều ưu Tạo miễn dịch với hạt điêm khiên đánh giá _5 , _ , , X , ị SFVhoặc ADN/ARN Biểu gen mức mọt hẹ tìiong bieu độ cao vằ , A _ A n ^ ê n cửu protein ữên tế bào động vật “ săn xuất \ accine Ạ thuôc nhanh hiệu i , [4] Hạt virus SFV tông hợp -X , Ấ „ , , «8 đơng biên nạp cho 10 10" hat virus trưởng thành/ml “ ^ , điều trị uiig tliư phục \-ụ nghiên cứu « trtc - B i ể u gen ^ SFV^ tạmthòi in\4vo ^ K ĩ thuật antisense Các nglúên cứu vị tri biỗu Wện nLi cắy Aú cấp (tể bào thần gây tát biểu gen môi trường ni cấy, có tìiể dùng lây nhiễm vào tổ hợp mức độ cao uvH ị Liệu pháp ge n^ nhanh, 24 sau vector ^ Biểu prottíin tái tế bào chủ mà xác định kinh, nguyên bào sợi) sát trùng vector SFV không cần tinh hay cô đặc Dải vật chủ lây nhiễm SFV rộng cho phép chọn lựa dạng biến đổi sau dịch mã phù hợp [2] Vector SFV có khả tự chép ARN tế bào chất cao nhờ RNA replicase mức độ biểu protein lên đến 25% tổng số protein tế bào Nhiều protein khác protein nhân, protein tế bào chất, protein màng protein tiết biểu tìiành cơng sử dụng hệ vector SFV [1] Hệ vector có tính an tồn cao nhờ yếu tố: vector có nguồn gốc tìì dịng làm suy yếu khả gây bệnh; hệ gen virus tách tái cấu trúc tìiành vector riêng biệt nên virus khả tái sản xuất qua chu kì tế bào; đột biến phức protein p62 (tiền thân protein màng E3và E2) khiến vừus nhiễm sau hoạt hóa achymoưypsin Hơn nữu, biến nạp vector nhân dòng vào tế bào động vật tìù ARN virus tự nhân lên số lượng lớn ữong tế bào chất cho phép biểu tạm tìiời gen ngoại lai mức độ cao Vector SFV có nhiều ứng dụng ữong lĩnh vực khác (Hình 1) Đã có nhiều báo cáo ứng dvmg vector SFV ữong nghiên cứu nghiên cứu sinh học phân tử phát triển tìiuốc, sản xuất vaccine tái tổ hợp liệu pháp gen, đặc biệt điều trị ung thư [2][4] [6] Sử dụng liệu pháp gen dùng vector SFV tiến hành mơ hình động vật áp dụng ữên người ừong tương lai không xa Vector SFV khơng tìiương mại hóa Chúng tơi có hệ vector SFV gồm vector có dạng cADN pSFV2 pHelper2, quà tặng TS Rod Bremner (Bệnh viện Toronto Westem - Canada) Tuy có nhiều ưu điểm hệ vector SFV cịn vị trí nhân dịng đa điểm hạn chế có ứiể ứỉêm vùng gen giúp tăng cường dịch mã sàng lọc tìiể tái tổ hợp dễ dàng hom Chửứi vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm cải biến hệ vector SFV bản, tạo phiên vector có tính khả dụng cao II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Vật ỉiệu nghiên cứu - Chủng vi khuẩn E.colì DH5a dùng để biến nạp plasmỉd nhân nhanh plasmid (Inviữogen - Mỹ) - Vector pSFV2 vector pHelper2 có cấu trúc mơ tả hinh hình ^pnHBotMr SAgmirtc •K c B u_6K E1 PA pu — — I 3i:SrOP ỊHomEĩlẼEKẼEdỉA Hình Cấu M c pSFV2 - Hình c ấu trủc pHelper2 Các mồi PCR đoạn oligonucleotit tự ứũết kế đặt tổng hợp từ hãng IDP (Mỹ) có trình tự trinh bày ữong bảng bảng Bảng Trình tự mồi sử dụng ttong nghiên cứu Tên mồi F-N R-N 807 809 T rình tự (5’-3’) TGACCTGTTATACACCTCTACG AGGCCCGGGATGACCACTCTTC GCCCATCTATGACAACAAG GTGCGATACCCGACATG Mục đích Nhân đoạn trình tự tăng cường dịch mã năm vùng gen mã vỏ capsid ữên pHelper Sàng lọc khuẩn lạc mang mang vector cải biên sử dụng colony PCR Bảng Trình tự oligonucleotit sử dụng ữong nghiên cứu Tên mồi O-Ml Trình tự (5’-3’) a g c g a g a t c t |H | h | | | P H Ỉ V H H H P H HBCACCACCATCÀTCACeACCATCÀCCATC M1-M6 0-M2 M2-M7 0-M3 0-M4 ACAGC AGCGGCCTGG r 1CCGCGTGGGTCTGGA TCCTA ATCAGGATCCAGACCCA ATTGGGATCCGCTAAGCGCGCTTCGAATCGAT GCATCCTAGGGCCCGGGCGC GCGCCCGGGCCCTAGGATGCATCGA GATCGGATCCGC TTAGCGGATCC Mục đích Tạo linker chứa ưình tự H H i H HIS4aB vi trí Thrombm leoi đoạn 0-M 6) Tạo ỉinker chứa vùng nhân dòng đa điểm cải tiến 0-M Tạo linker M3-M4 Phương pháp nghiên cứu Chúng tiến hành xây dựng vector cải biến pSMP 2.1 pSMP 2.2 tìr vector pSFV2 Nghiên cứu gồm ứú nghiệm tiến tìiành ứieo sơ đồ hình Hình Sơ đồ nghiên cứu tạo vector cải tiến pSMP 2.1 pSMP 2.2 III KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u Kêt giải trình tự từ khuẩn lạc biến nạp vector cải biến pSMP 2.1 khuẩn lạc biến nạp vector cải biến pSMP 2.2 qua sàng lọc nhanh colony PCR ứỉnh bày hình đến hình SP6 prom oter SatesaoRŨc p ro o ta r Hình Cấu trúc vector pSMP cải biến ìđầmà