Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 80 259

Tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về Streptomyces nhưng việc phân loại và định tên chủng dựa trên những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử hầu như chưa được áp dụng phổ

T R U O N G ĐẠI H Ụ C DU ụ c H A r s ụ i• • • •

NGUYỄN THỊ HẢI HÀ

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG

SINH Từ STREPTOMYCES 80.259

LUẬN VĂN THẠC SỸ • • D ược • HỌC•

MÃ SỐ: 60.73.01

Người hướng dẫn khoa học : PGS TS Cao Văn Thu

TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI

T H Ư V I Ệ N

Ngày tháng Á năm 2 Ọ ịẠ Ạ

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS TS Cao Vãn Thu - người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và tận tình chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Vi sinh-Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội đã tuôn giúp đỡ và động viên em trong quả trình làm luận văn.

Em muốn gử i lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suối thời gian học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cồ, anh chị tại viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và đóng góp những ỷ kiến quỷ báu giúp em hoàn thiện khóa luận

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ cũng những người thân yêu trong gia đình và bạn bè đã luôn bên em, chia sẻ, khích lệ

và động viên em trong suốt quá trình học tập để em có thể đạt được những kết quả như ngày hôm nay.

Em xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2010

Học viên Nguyễn Thị H ải Hà

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ È 1

Chương 1 TỔNG Q U A N 3

1.1 XẠ K H UẨ N 3

1.1.1 Vài nét về xạ khuẩn 3

1.1.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của Streptomyces 5

1.2 ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN LOẠI VÀ XÁC ĐỊNH TÊN XẠ K H U Ẩ N 6

1.2.1 Khái quát về một số phương pháp phân loại phổ biến 6

1.2.2 Tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân t ử 7

1.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỎNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH CỦA XẠ K H U Ẩ N 11

1.3.1 Các yếu tố thuộc về môi trường lên m e n 11

1.3.2 Các yếu tố thuộc về điều kiện nuôi cấy 14

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHÉ KHÁNG SINH 15

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỐ CỦA KHÁNG SINH 19 1.5.1 Phổ hồng ngoại (Phổ IR ) 19

1.5.2 Phổ tử ngoại (Phổ U V ) 19

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Phổ 'H -N M R ) 20

1.5.4 Phổ khối 21

Chương 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 23

2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIỀN c ứ u 23

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 26

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống 26

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tá n 27

2.2.3 Phương pháp cải tạo và chọn g iố n g 28

2.2.4 Phương pháp lên men chu k ỳ 30

2.2.5 Chiết kháng sinh 30

2.2.6 Phương pháp xác định trình tự gen của Streptom yces 32

Chương 3: KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 34

3.1 NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỎNG HỢP KHÁNG S IN H 34

3.1.1 Kết quả chọn môi trường nuôi cấy và môi trường lên m e n 34

3.1.2 Kết quả sàng lọc ngẫu n h iê n 36

3.1.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 37

3.1.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 39

3.1.5 Kết quả lên men với các biến chủng tốt n h ất 41

3.1.6 Nâng cao hiệu suất lên men sinh tổng họp chất kháng sin h 41

3.2 CHIÉT XUẤT VÀ TINH CHẾ KHÁNG SINH TỪ DỊCH LỌC 45

3.2.1 Kết quả chọn dung môi và pH chiết 45

3.2.2 Kết quả SKLM chọn hệ dung m ô i 47

3.2.3 Kết quả sắc ký c ộ t 48

3.3 KẾT QUẢ ĐO MỘT SỐ PHỔ CỦA THÀNH PHẦN KHÁNG SINH CHÍNH 52

3.3.1 Phổ hồng ngoại 52

3.3.2 Phổ tử ngoại 52

3.3.3 Phổ khối 53

3.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 53

3.4 PHÂN LOẠI VÀ ĐỊNH TÊN STREPTOMYCES 80.259 53

3.4.1 Phân loại theo khóa phân loại ISP 53

3.4.2 Phân loại theo kỹ thuật g e n 54

Chương 4: BÀN LUẬN 55

4.1 NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG STREPTOMYCES 80.259 55

4.2 CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ KHÁNG S IN H 58 4.3 BIỆN GIẢI PHỎ CỦA THÀNH PHẦN KHÁNG SINH CHÍNH 60

4.4 PHÂN LOẠI VÀ ĐỊNH TÊN STREPTOMYCES 80.259 62

KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị 64

CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIÉT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Kêt quả chạy SKLM với các phân đoạn có hoạt tính kháng

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VÁN ĐÈ

Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ở nước ta cũng đang

có nhiều thay đổi theo hướng đa dạng và phức tạp hơn Tuy nhiên với nét đặc trưng là một quốc gia đang phát triển nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, bệnh nhiễm khuẩn vẫn là bệnh phổ biến nhất trong mô hình bệnh tật của Việt Nam,

kể cả trong quá khứ, hiện tại và tương lai

Chúng ta không thể phủ nhận vai trò to lớn của kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn cũng như trong điều trị ung thư Nhưng hiện nay kháng kháng sinh lại đang trở thành một mối quan tâm toàn cầu Tại Việt Nam, tình trạng này càng đáng báo động hơn khi việc kê đơn và sử dụng thuốc chưa được kiểm soát chặt chẽ dẫn đến việc lạm dụng kháng sinh trong cộng đồng ngày một gia tăng Điều này không chỉ gây ra khó khăn trong công tác điều trị bệnh mà còn làm tăng nguy cơ các tương tác bất lợi cho người bệnh khi phải

sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh để tránh kháng thuốc

Đứng trước thực tế đó thì việc phát triển ngành công nghiệp kháng sinh là cần thiết hơn bao giờ hết nhằm tạo ra những kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao và ít bị kháng Bên cạnh việc nghiên cứu sản xuất kháng sinh bàng phương pháp tổng hợp hay bán tổng hợp thì việc kiếm tìm các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên cũng rất quan trọng và không thể thay thế

Với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, nước ta có một hệ vi sinh vật phát triển phong phú trong đó phải kể đến các chủng xạ khuẩn chi

Streptomyces sinh kháng sinh Theo thống kê khoảng 53% số kháng sinh hiện

có trên thế giới là được sinh tổng hợp từ họ xạ khuẩn này Tại Việt Nam đã có

nhiều công trình nghiên cứu về Streptomyces nhưng việc phân loại và định tên

chủng dựa trên những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử hầu như chưa được áp dụng phổ biến Các vấn đề về nâng cao hiệu suất lên men hay nghiên cứu chất kháng sinh chính cũng chưa được đi sâu

Với mong muốn được đóng góp một phần nhỏ bé vào sự phát triển của ngành công nghiệp Dược nói chung cũng như ngành công nghiệp kháng sinh nói riêng, dựa trên cơ sở được bộ môn Vi sinh Trường đại học Dược cung cấp

chủng xạ khuẩn Streptomyces 80.259 chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài

“Nghiên cứu sinh tong hợp kháng sinh từ Streptomyces 80.259” với các mục

tiêu cụ thể như sau:

1 Xác định tên loài Streptomyces 80.259 bằng phương pháp sinh học phân tử

2 Nghiên cứu chất khảng sinh được sinh tồng hợp nhờ chủng Síreptomyces 80.259

Chương 1 TỎNG QUAN1.1 XẠ KHUẨN

1.1.1 Vài nét về xạ khuẩn

a Đặc điểm chung

Xạ khuẩn (Actinomyces) là các vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rộng rãi trong tự nhiên Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales,

bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 478 loài đã được

công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và

Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Đại đa số xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và bào tử Thậm chí một số loài còn hình thành túi bào tử như chi Streptosporangium và bào tử di động như chi

ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất

Hình 1.2: M ột sô hình ảnh vê khuân lạc xạ khuân • • •

Đặc tính của xạ khuẩn là có khả năng sinh chất kháng sinh, dùng làm thuốc điều trị bệnh cho người và gia súc, cây trồng Xạ khuẩn còn có khả năng sinh

ra các vitamin thuộc nhóm B, một số acid amin và các acid hữu cơ Xạ khuẩn còn có khả năng tiết ra các enzym (protease, amylase ) và trong tương lai có thể dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho nấm [9]

b Đặc điểm sinh học của Streptomyces

Cũng như các Actinobacteria khác, Streptomyces là các vi khuẩn Gram

dương và cũng có tỉ lệ GC trong ADN cao hơn 55% [37] Hệ gen hoàn chỉnh

gen lớn hon bất kì loài vi khuẩn nào số lượng nhiễm sắc thể là 8.667.507 bp dài trong đó GC chiếm 72,1% và được dự đoán là chứa 7825 protein mã hóa gen [25]

Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao Đe phát triển,

chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột Chúng cũng có

thể khử nitrat thành nitrit Streptomyces là các vi khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt

1.1.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của Streptomyces

Các loài Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều chất chuyển hóa thứ

cấp quan trọng trong đó phải kể đến các chất kháng sinh [43] Theo thống kê

có khoảng trên 55% kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được tổng hợp từ họ

xạ khuẩn này [35]

Một số kháng sinh phổ biến có nguồn gốc từ Streptomyces được tổng

Bảng 1.1: M ột sô kháng sinh có nguôn gôc từ xạ khuân Streptomyces

Ngoài tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm thường thấy, kháng sinh

được sinh tổng hợp từ Streptomyces còn được sử dụng làm tác nhân chống

ung thư (Adriamycin); thuốc ức chế miễn dịch (Cyclosporin, Rapamycin); tác nhân chữa bệnh mù lòa đường sông ở châu Phi (Ivermectin) Trong nông nghiệp người ta cũng sử dụng rất nhiều các chất kháng sinh của xạ khuẩn làm thuốc diệt cỏ (Phosphinothricin), thuốc kích thích tăng trưởng, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc chống ký sinh trùng [42],[43]

1.2 ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN LOẠI VÀ XÁC ĐỊNH TÊN XẠ KHUẨN

1.2.1 Khái quát về một số phương pháp phân loại phổ biến

Trước đây việc phân loại xạ khuẩn vẫn căn bản dựa trên các đặc tính về

hình thái, sinh lý và hóa sinh vi sinh vật Khóa phân loại xạ khuẩn theo ISP

(International Streptomyces Project) do Shirling và Gotlieb đề xuất đã được

sử dụng rộng rãi để phân loại và định tên các xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces Trong khóa phân loại này, người ta dựa vào các đặc trưng

chính là: màu sắc khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, khả năng tiêu thụ nguồn carbon [45], [46], Các đặc trưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính được dùng cho nhóm vi sinh vật này nhưng lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái

(Chemetaxonomy) và phân loại số (Numerical Taxonomy) cũng được ứng dụng nhằm đưa ra những kết quả chính xác hơn trong quá trình phân loại xạ khuẩn

Hóa phâ n loại rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi Đây là

phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng

acetyl, acid mycolic trong thành tế bào, menaquinone, phospholipid, acid béo

và tỷ lệ GC trong ADN [36]

Phân loại sổ dựa trên những đánh giá về số lượng mức độ giống nhau

sinh lý, sinh hóa Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một,

đầu tiên được Silvestri và cs áp dụng cho Streptomyces năm 1962, tới năm

1983 lại được Williams và cs nghiên cứu trên chi Streptomyces Các nghiên cứu này đã xác định được 139 đặc tính của 394 chủng Streptomyces Các

[47],[53]

1.2.2 Tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Một trong những cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử hiệu quả nhất hiện nay đó là kỹ thuật phân tích acid nucleic [48]

Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN và lai ADN Việc nghiên cứu phát sinh loài dựa trên phân tích chuỗi 16S rADN đã và đang đem lại những kết quả quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn Đó là vì trình tự nucleotid của gen 16S rADN hầu như không có sự trao đổi giữa các loài, do đó trình tự của gen này có ý nghĩa đặc trưng cho loài [51],[55] Đe có thể phân tích chuỗi 16S rADN cần phải tiến hành hai kỹ thuật quan trọng nhất đó là kỹ thuật nhân gen PCR và giải trình tự ADN [31] Việc nhân gen cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hon nữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu

Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích nguồn ADN khuyếch đại theo cách này Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu

Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR Việc xác định được sai khác của chuỗi ADN sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật.

1.2.2.1 Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo một số lượng rất lớn bản sao của gen trong thời gian ngắn Nguyên tắc dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của ADN và nguyên lý tổng họp ADN Trên cơ sở trình tự của đoạn ADN khuôn, đoạn mồi, các nucleotid tự do và enzyme ADN polymerase

có thể tổng họp được các đoạn ADN giới hạn bởi các đoạn mồi Lặp lại nhiều lần các chu kì nhân gen [ 19]

PCR gồm một chuỗi các phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép

- Giai đoạn gắn mồi: bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn

- Giai đoạn tổng hợp: là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung Kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ

Các yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR:

a AD N khuôn: kích thước đoạn khuôn nhỏ hơn 3 kb cho kết quả nhân gen tốt

nhất

b Các nucleotid tự do (dNTP): Các nucleotid tự do cần thiết cho phản úng

gồm dATP, dTTP, dGTP và dCTP Trong mỗi phản ứng cần chú ý đến tỉ lệ G-C trong đoạn khuôn đế xác định hàm lượng mỗi loại dNTP phù hợp

c M ồi’, là các đoạn oligonucleotid ngắn khoảng khoảng 14-35 nucleotid, có

vai trò quan trọng quyết định thành công của phản ứng

Điều kiện chủ yếu để đảm bảo hiệu quả của mồi:

- Trình tự của mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ có thể bắt cặp ở đầu 3 của mạch khuôn

- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi không chênh lệch nhau quá lớn

d Enzym A D N Polymerase: sử dụng các loại khác nhau sẽ thu được các sản

phẩm PCR có tính đặc hiệu khác nhau

e Dung dịch đệm cho PCR: cần đảm bảo thành phần các chất cần thiết cho

f Thiết bị thực hiện phản ứng PCR\ Phản ứng PCR là một chuỗi các chu kì

tuần hoàn nhiệt, do đó có thể thực hiện phản ứng trong các thiết bị chuyên dụng là các máy PCR

1.2.2.2 Phương pháp giải trình tự gen

Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh

và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu

hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu Các gen bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau [19]Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử ADN Có 3 nhóm giải trình tự gen chủ yếu:

a Phương pháp Max am và Gilbert

Đây là phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Tạo mạch

phân tử ADN thành các mạch đơn không tự xoắn lại với nhau Các mạch đơn

đã đánh dấu phóng xạ được phân vào các ống nghiệm khác nhau, thực hiện kỹ thuật xử lý hóa học đặc hiệu để phân cắt các mạch đơn thành các đoạn ngắn hơn kém nhau một nucleotid, từ đó xác định trình tự ADN bằng phương pháp điện di [19]

b Phương pháp Dideoxy

Chuẩn bị các điều kiện cần thiết đảm bảo thực hiện tổng họp ADN Trong quá trình tổng hợp mạch đơn ADN, bổ sung một hàm lượng nhỏ Dideoxynucleotid (ddNTP) mỗi loại Do ddNTP bị mất cả 2 nhóm OH (ở c

số 2 và 3), nên trong quá trình tổng hợp mạch đon ADN, gặp ngẫu nhiên một dideoxynucleotid làm cho phản ứng tổng hợp ADN ngừng lại Kết quả tổng hợp ADN tạo nên các chuỗi mạch đơn mới hơn kém nhau một nucleotid, từ

đó xác định trình tự của mạch khuôn ADN

c Giải trình tự gen bằng máy tự động (Sequencer)

Dựa trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh Trong quá trình tổng hợp ADN có sử dụng các mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang thay cho đánh dấu phóng xạ, mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn ADN mới trên cả 2 mạch khuôn ADN, đồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính để xử lý kết quả [48]

Hiện nay, phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động được ứng dụng rất rộng rãi nhằm phân loại và xác định tên loài của các chủng vi khuẩn

Chẳng hạn như nghiên cứu xác định chủng Streptomyces 62.229 là

Streptomyces rocheỉ bằng kỹ thuật gen, hay một số tác giả tại viện Công nghệ

sinh học đã tiến hành tách dòng được đoạn gen 16S rARN của chủng

Anabaena azotica, xác định kích thước của dòng gen tách được là 1215bp, so

sánh, xác định vị trí phân loại của chủng Anabaena azotica so với một số

chủng vi khuẩn lam khác dựa trên trình tự gen 16S rARN [15]

Người ta cũng đã xác định được trình tự nucleotide hoàn chỉnh của loài

Streptomyces avermitỉlis sinh tổng hợp Avermectins- là một trong nhóm các

tác nhân chống kí sinh trùng được dùng làm thuốc cho người cũng như trong thú y Hệ gen của nó chứa 9.025.608 base (GC trung bình chiếm 70,7%) và

mã hóa ít nhất 7574 khung đọc mở tiềm năng (ORFs) Người ta cũng xác định được 30 bộ mã hóa có liên quan tới quá trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa

Trình tự gen của Streptomyces griseus IFO 13350 sinh tổng hợp

Streptomycin đã được Yasuo Ohnishi và cs xác định Bộ nhiễm sắc thể gồm

ngược rất dài gồm 132.910 cặp base Chuỗi nucleotid và cấu trúc thứ cấp này gồm một vài chuỗi vòng 5’-GGA-3’ đọc xuôi ngược đều giống nhau, chính là

điêm khác biệt so với các loài Streptomyces khác Hệ gen của s grỉseus có 34

nhất 4 bộ mã hóa quy định sinh tổng hợp Streptomycin [54]

1.3 CÁC YÉU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN

1.3.1 Các yếu tố thuộc về môi trưòng lên men

Kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp, vì vậy quá trình sinh tổng họp kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào các thành phần của môi trường lên men mà trong đó phải kể đến nguồn carbon, nguồn nitơ, nguồn phosphat

a Nguồn carbon

Carbon là nguồn dinh dưỡng quan trọng trong sự sinh trưởng của xạ khuẩn

và hình thành các hợp chất kháng sinh Ngoài các nguồn tinh khiết như: glucose, saccharose, tinh bột người ta cũng sử dụng các nguồn hỗn hợp như:

rỉ đường, bột ngũ cốc, hay dầu thực vật: dầu đậu nành, dừa, hướng dương [2], Đối với nhiều chủng xạ khuẩn nguồn carbon thích hợp là tinh bột [12]

nhiên đây lại là nhân tố cản trở quá trình sinh tổng hợp kháng sinh của nhiều loại xạ khuẩn Các nghiên cứu về sự phát triển trong môi trường lên men cho thấy polysaccharide hay oligosaccharide cung cấp carbon lí tưởng hơn đối với quá trình sản xuất kháng sinh [49] Trong môi trường có chứa glucose và một nguồn carbon khác, glucose thường được tiêu thụ hết trước, sau đó nguồn carbon còn lại mới được sử dụng cho quá trình sinh tổng hợp kháng sinh [34].Trong một vài trường hợp có thể coi glucose là tác nhân ức chế enzyme của quá trình sinh tống họp kháng sinh Như trong quá trình sinh tổng hợp actinomycin, glucose đã ức chế enzyme phenoxazinone synthase - enzyme cần thiết cho việc hình thành vòng phenoxazinone, do đó làm giảm quá trình tổng hợp kháng sinh này [34] Ngoài ra glucose còn ức chế nhiều enzyme khác như enzyme phosphatase- nhân tố cần cho quá trình tổng hợp neomycin [38], N-acetylkanamycin amidohydrolase- enzyme cuối cùng của con đường tổng hợp kháng sinh kanamycin [44]

Giảm pH, giảm lượng oxy hòa tan trong môi trường do nguồn carbon sử dụng cũng là những yếu tố tác động tới quá trình sinh tổng hợp kháng sinh, glucose với nồng độ cao trong môi trường không chỉ làm giảm pH mà còn làm tăng tích lũy dạng không phân ly của acid acetic và acid pyruvic, do đó ảnh hưởng tới quá trình sinh tống họp kháng sinh bacitracin [29]

b Nguồn N itơ

Hầu như các chủng xạ khuẩn đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ vô cơ và hữu

cơ Nguồn nitơ hữu cơ hay được sử dụng là bột đậu tương và cao ngô Nitơ của cao ngô rất dễ tiêu hóa Một số nguồn nitơ vô cơ được sử dụng như là

của môi trường lên men Các enzyme này bao gồm: Nitrate reductase, Nitrite

dehydratase , các enzyme liên quan tới sự thoái biến purin, vận chuyển urea

và glutamase, tiêu thụ histidine

Việc kiểm soát quá trình chuyển hóa nitơ trong sinh tổng hợp kháng sinh cũng đã được đề cập tới trong nhiều nghiên cứu Việc sản xuất erythromycin chỉ bắt đầu khi có nguồn nitơ trong môi trường lên men, nhưng nếu đó là ammonium chloride, glycine hay bột đậu tương thì sẽ làm giảm lượng kháng sinh được tổng hợp [34] Thêm bột đậu tương cũng ảnh hưởng tới quá trình lên men sinh tổng họp candicidin hay candihexin [40] Một vài báo cáo cũng

chỉ ra mối liên quan giữa sự chuyển hóa nitrogen của Streptomyces noursei

với quá trình sinh tổng hợp kháng sinh nourseothricin của xạ khuẩn này [28]

Sinh tổng hợp cephalosporin của một số Streptomyces cũng phụ thuộc vào

việc kiểm soát chuyển hóa nguồn nitơ thông qua hoạt động của hai enzyme là glutamine synthetase và alanine dehydrogenase [24]

c Nguồn Phosphat

Phosphat là nguồn dinh dưỡng quan trọng của quá trình lên men và đóng vai trò như một tác nhân điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp kháng sinh Phosphat ảnh hưởng tới sinh tổng họp của nhiều nhóm kháng sinh khác nhau như kháng sinh nhóm peptide, macrolide, tetracycline Trong công nghiệp,

để khắc phục, người ta sử dụng một lượng hạn chế phosphat vô cơ Nồng độ

phosphat từ 0.3 tới 300mM thường thúc đẩy quá trình sinh trưởng của tế bào, tuy nhiên từ nồng độ lOmM trở lên lại cản trở tới sinh tổng hợp của nhiều kháng sinh [39].

Nguồn phosphat gần như bị tiêu hao hết trong giai đoạn sinh trưởng của

S.grỉseus (sinh tổng hợp candicidin) trong vòng 2h trước khi bắt đầu giai đoạn

tổng họp candicidin (TK) Điều này cũng xảy ra tương tự với quá trình lên

men sinh tổng hợp tetracycline của s aureofaciens, và lượng phosphat ngoại

bào còn lại là rất ít trong suốt thời gian của pha sinh trưởng Nếu thêm lOmM photphat khi bắt đầu lên men, xạ khuẩn vẫn tiếp tục sinh trưởng trong suốt quá trình lên men trong khi quá trình sinh tổng hợp kháng sinh lại không xảy

ra Vì thế kháng sinh chỉ được bắt đầu sản xuất khi nguồn photphat được tiêu thụ hết Hiện tượng này cũng xảy ra trong khi lên men tống hợp vancomycin [41]

c Oxy hòa tan

nhất là ở giai đoạn nhân giống Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta

thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthiozyanat để làm tăng khả năng hòa tan oxy Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp kháng sinh là từ

d Tuổi giống

Việc sinh tổng hợp kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men

mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống Tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất cao nhất thường là 24h-72h tuổi Lượng giống cấy truyền khoảng từ 2-10% [13]

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ KHÁNG SINH

Ket thúc quá trình lên men, kháng sinh có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men, đồng thời có thể có nhiều thành phần kháng sinh và tạp chất khác Do đó việc tách chiết và tinh chế để thu sản phẩm tinh khiết là rất quan trọng Các phương pháp tách thường gặp như phương pháp lọc, phương pháp ly tâm, phương pháp chiết, phương pháp sắc ký

Nguyên tắc của phương pháp chiết là dựa vào sự phân bổ chất tan giữa hai pha không hòa tan lẫn được vào nhau [5],[18] Tùy theo chất tan tồn tại trong pha rắn hay pha lỏng mà người ta phân biệt chiết lỏng-lỏng (thường dùng một pha nước và một pha dung môi hữu cơ) và chiết lỏng-rắn

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: Một pha tĩnh và một pha động Quá trình tách sắc ký thường gồm 3 giai đoạn chính: Đưa hỗn họp lên pha tĩnh; Cho pha động chạy qua pha tĩnh; Phát hiện các chất [5], [18]

Một số phương pháp sắc ký hay được ứng dụng trong tách và tinh chế kháng sinh:

• sắc kỉ cột: là phương pháp rất hay được sử dụng để phân tách hay tinh chế

các chất từ một hỗn hợp Pha tĩnh (chất hấp phụ) là chất rắn, pha động là dung môi Dung môi được thấm qua cột dưới tác dụng của trọng lực, đồng thời sẽ kéo theo các chất hòa tan trong hỗn hợp cần tách Các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [33]

Chất hấp phụ được dùng phổ biến nhất hiện nay là silica gel (S i0 2) Chất hấp phụ này có nhiều kích thước lọt rây khác nhau, như “silica gel 60” hay

“silica gel 230-400” Chỉ số càng lớn thì kích thước lỗ rây tương ứng với kích thước lớn nhất của hạt càng nhỏ Kích thước của hạt ảnh hưởng đến dòng dung môi chảy trong cột Hạt nhỏ hơn (chỉ số mesh lớn, ví dụ 230-400) được dùng cho sắt ký cột trung bình, hạt lớn hơn ( chỉ số mesh nhỏ hơn, ví dụ 70- 230) dùng cho sắt ký cột bình thường

Alumina nhạy hấp phụ nước Do vậy, khi đã có nước gắn lên rồi thì trên hạt

sẽ còn rất ít các chỗ để bắt giữ các chất hữu cơ khác Vì vậy, alumina được phân cấp độ hoạt động theo mức I ,11, hoặc III Mức I là mức hoạt động lớn nhất, nghĩa là mức có lượng nước hấp phụ ít nhất Alumina thường được dùng

ở mức I và được giải hoạt bằng nước để đạt mức hoạt động theo yêu cầu trước khi dùng

thay thế silica gel vì nó ít phân cực và mang tính acid yếu hơn Alumina là chất thay thế thứ hai có độ phân cực nằm giữa hai loại nói trên Do Florisil có

độ phân cực thấp, chất này hữu dụng khi tách các hợp chất có độ phân cực mạnh Vì nếu dùng silica gel, các chất phân cực mạnh sẽ bị bắt giữ quá nhiều

trên silica gel Florisil cũng dùng tốt để phân tách các hợp chất không phân cực trong khi silica gel không bắt giữ được

• Sắc kỷ lớp mỏng (SKLM): là phương pháp được dùng để thử độ tinh khiết

của sản phẩm SKLM tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ) Pha tĩnh là chất rắn thường ở dạng bột rất mịn, thường dùng là Silica gel hay nhôm oxit Pha động

là dung môi tinh khiết hay hỗn hợp dung môi Dung môi chạy trên bản mỏng nhờ lực mao dẫn [5]

TRƯỜNG ĐK DƯỢC HÀ NỘI

T H Ư m Ệ M

Hình 1.3: Sơ đô tỏng quát sinh tông hợp kháng sinh

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỦA KHÁNG SINH

Sau quá trình tách chiết, tinh chế thì việc phân tích phổ của thành phần kháng sinh tinh khiết thu được nhằm định hướng cấu trúc kháng sinh có thể coi là khâu then chốt trong quá trình nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Phổ IR)

• Nguyên lý: Bức xạ IR kích thích trực tiếp dao động của các phân tử hợp

chất, phân tử hấp thu năng lượng và làm xuất hiện phổ IR Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó [27]

• Biện giải p h ổ I R : là xét mối liên quan giữa hấp thụ hồng ngoại với cấu

trúc hóa học của hợp chất Khi xét dải hấp thụ trên phổ, cần lưu ý:

tử dễ bị kích thích mới hấp thụ năng lượng để chuyển trạng thái Đó là các nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N ,s,0 , halogen [1],[27]

Phổ u v là đồ thị biểu diễn sự hấp thu năng lượng của tia u v bởi mẫu chất theo độ dài sóng của tia [2] Băng hấp thụ u v được đặc trưng bởi 2 thông số:

- Vị trí cực đại hấp thu (Xmax): là bước sóng tại đó năng lượng gây ra sự chuyển điện tử

- Cường độ: cường độ mạnh (e >104), cường độ yếu (c <103)

1.5.3 Phổ cộng hưỏng từ hạt nhân (Phổ ‘H-NMR)

• Nguyên lý: [4]

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do sự

phụ thuộc cường độ tín hiệu theo từ trường H hay tần số [I của từ trường biến

thiên

- Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi từ trường sê dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến, và xuất hiện phổ NMR

- Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có moment từ và cho tín hiệu cộng hưởng hạt nhân

- Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự là số chẵn thì không

có moment từ và không cho tín hiệu NMR

- Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật

độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó

• Biện g iả ip h ồ NM R: thông qua việc phân tích các yếu tố sau:

- Độ chuyển dịch hóa học (vị trí của tín hiệu cộng hưởng): của phổ 'H- NMR nằm trong khoảng từ 0-12ppm

tương quan lập thể của các nguyên tử H với nhau Trong đó người ta quan tâm tới: Đội bội của tín hiệu cộng hưởng; Tỷ lệ cường độ của các vạch tín hiệu; Hằng số tương tác spin-spin

- Diện tích dưới tín hiệu: cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu [2]

• Phổ l3C-NMR\ về nguyên lý cũng giống như 'H-NM R nhưng ở đây hạt

1.5.4 Phổ khối

• N guyên lý: Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để

chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh Dựa trên phổ thu được ta biết

số ion phân tử M+ và các mảnh vỡ mi+’ m2+ Từ đó ước đoán được khối lượng phân tử và cấu tạo hóa học của họp chất [4]

• Biện giải phổ khối:

- Đỉnh phân tử: đỉnh có số khối lớn nhất cho biết khối lượng phân tử của chất

công thức phân tử hợp chất

- T ừ khối lượng của các mảnh chìa khóa suy ra cấu tạo của từng mảnh Biết cấu tạo nhiều mảnh suy ra cấu trúc phân tử của hợp chất

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là chủng xạ khuẩn Streptomyces 80.259

do Bộ môn Vi sinh- Sinh học Trường Đại Học Dược Hà Nội cung cấp Các nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực hiện bao gồm:

❖ Giống vi sinh vật kiểm đỉnh', do Bộ môn Vi sinh- Sinh học Trường Đại

Học Dược Hà Nội cung cấp:

Proteus mirabiỉis B V 108 Pseudomonas aeruginosa VM 201 Salmonella typhỉ D T 220

Shỉghella flexneri D 112

- Vi khuẩn Gr(+): Bacillus cereus ATCC 9946

Bacilluspumỉlus ATCC 6633 Bacillus subtiỉỉs ATCC 6633 Bacillus lutea ATCC 934ỉ Staphylococcus aureus ATCC 1228

*x* Môi trường:

Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy vsv kiểm định

" x Thành phần

M T V

NaCl(%)

Caothịt(%)

Glucose(%)

Pepton(%)

Thạch(%)

- Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn được thể hiện ở bảng 2.2

-7,2

7,2

7,2

7,2

7,0-7,6

7,4 Môi trường lên men: Có thành phần tương ứng với môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng bỏ thạch

- Các môi trường dùng đế phân loại xạ khuấn theo ISP:

Các môi trường từ ISP1 đến ISP7 khử trùng trong nồi hấp tại 118°C/30 phút Khử trùng hợp chất carbon được dùng cho thử nghiệm sử dụng carbon (ISP9)

bằng phương pháp Tyndal Điều chỉnh pH môi trường bằng NaOH hoặc HC1 trước khi cho thạch và trước khi khử trùng.

Dung dịch muối vỉ lượng (được sử dụng cho các môi trường ISP3, 4, 5,

vừa đủ 1L

+ ISP1: Tryptone 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất 1L; pH = 7,0-7,2

+ ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết Malt 10,Og; glucose 4,0g; nước cất 1L; pH = 7,3; sau đó thêm thạch 20,Og

+ ISP3: Bột yến mạch 20,Og; thạch 18,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; nước 1L; pH = 7,2 (điều chỉnh bằng NaOH )

+ ISP4: Tinh bột 10,Og; K2H P 0 4 l,0g; M n S 0 4.7H20 l,0g; NaCl l,0g;

nước cất vừa đủ 1L; pH = 7,0-7,4

lượng 1,0 ml; pH = 7,0-7,4; thạch 20,Og; nước cất 1L

l,0g; nước cất vừa đủ 1L

+ ISP6: Dung dịch A 36,Og; cao nấm men l,0g; nước cất vừa đủ 1L; pH = 7,0-7,2

l,0g; thạch 20,Og; nước cất vừa đủ 1L; pH = 7,2-7,4

+ ISP9:

• Các nguồn đường đã tiệt trùng bằng phương pháp Tyndal (A):

• Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (B): CUSO4.5H2O 0,64g;

♦t* Hóa chất và dụng cụ:

- Các dung môi hữu cơ (Mỹ và Trung Quốc)

- Vật liệu dùng trong sắc ký: Bản mỏng sắc ký Silica gel 60 F254 (Merck); hạt nhồi silica gel 60 F254; bình và cột chạy sắc ký

s Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030

S Máy cất quay Buchi Waterbath B480

s Cân kỹ thuật, cân phân tích Sartorius

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống

Giống được cấy zigzac trên ống môi trường thạch nghiêng, ủ cho phát

lạnh bảo quản 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy truyền, sàng lọc

a Nguyên tắc: Mầu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v

kiểm định Kháng sinh từ mẫu thử sẽ khuếch tán vào môi trường và ức chế sự phát triển của v s v kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

b Cách thức tiến hành:

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vsv kiểm định: Vi khuẩn kiểm định được cấy vào 2,5ml môi trường canh thang, sau 18-24h nuôi cấy ở nhiệt độ 37°c sẽ tạo thành hỗn dịch v s v có nồng độ 106-108 tể bào/ml

- Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và làm nguội đến 45-50°C với tỉ lệ 2.5:100 Lắc đều, đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa Để nguội ở nhiệt độ phòng truớc khi đưa mẫu thử vào đĩa

- Đưa mẫu thử vào đĩa Petri chứa môi trường đã cấy VK kiểm đinh Có 3 phương pháp:

o Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc đường kính 6mm đã

được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50°c sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy v s v kiểm định

môi trường đã cấy v s v kiểm định, nhỏ 0,05ml mẫu thử vào mỗi giếng thạch

o Phương pháp khổỉ thạch: Đặt khối thạch đường kính 6mm có chứa

v s v sinh kháng sinh lên bề mặt đã cấy v s v kiểm định

c N uôi cẩy\ Các đĩa Petri chứa môi trường đã cấy VK kiểm định và mẫu thử

được ủ trong tủ ấm 37°c trong 18-24h Mỗi mẫu được thử trên 3 đĩa với cùng

1 loại v s v kiểm định

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

d Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer

có độ chính xác 0,02mm Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn được xử lý theo công thức:

D (mm): Đường kính trung bình vòng vô khuấn

Dị (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: Số thực nghiệm làm song song

2.2.3 Phương pháp cải tạo và chọn giống

a Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng phép sàng lọc ngẫu nhiên:

- Mục đích: Sàng lọc ngẫu nhiên là chọn lấy những cá thể có biến dị tự nhiên cho hoạt tính kháng sinh cao nhất so với các cá thể khác từ giống thuần khiết

- Tiến hành:

o Chuẩn bị hỗn dịch bào tử: Dùng que cấy lấy 1 vòng bào tử xạ khuẩn

Streptomyces 80.259 rồi hòa vào lOml nước cất vô trùng trong ống nghiệm

Lắc cho bào tử phân tán đều thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10~' (định ước) Tiếp tục pha loãng hỗn hợp này bằng nước cất vô trùng tới nồng

o Cấy bào tử' Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml các mẫu hỗn dịch ở các độ pha

trang vô trùng dàn đều giọt bào tử Tiến hành làm 3 đĩa Petri cho mỗi độ pha

ỵw-D)

1=1

Yĩ

độ 10'6

o Sàng ỉọc ngẫu nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển tốt sau 6 ngày, cấy

hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch

b Cải tạo giống- Phương pháp đột biến bằng tia u v

- Pha hỗn dịch bào tử', tương tự như phép chọn lọc tự nhiên, sau đó lấy 1 ml

được đưa vào đĩa Petri vô trùng

- Đột biến dưới tác dụng của ảnh sảng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ

thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút), sau đó lấy ra để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng tới nồng độ 10°

- Cấy bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0.1 ml mẫu

vào đĩa Petri có MT2 Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa Cho các đĩa vào tủ ấm 30°c trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển Đếm các khuẩn lạc, xác định độ sống sót theo công thức:

% sống sót = —

N q

Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến

No' Số khuẩn lạc trong mẫu chứng

- Sàng lọc các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên, làm song song với mẫu chứng % biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:

D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng i sau đột biến

Dữ: Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn mẫu chứng

- Dựa vào kết quả thu được, chọn 3-5 biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất để nghiên cứu tiếp

2.2.4 Phương pháp lên men chu kỳ

- Tạo giống cấp ỉ: Chủng giống Streptomyces 80.259 sau khi nuôi cấy trên

thạch nghiêng (MT2) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml môi trường nuôi cấy, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28±0,l°c, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h

- Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên môi trường tối ưu

Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa môi trường với tỉ lệ Vgiống : Vmôitnrờng = 1:10 Bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°c ±0.1 °c, tốc

độ quay 140 vòng/phút trong 120h

2.2.5 Chiết kháng sinh

a Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ:

- Dịch lọc, dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH

3,5,7,9,11 bằng dung dịch NaOH 20% và HC1 25% Chiết dịch lọc đã chỉnh

pH với các dung môi hữu cơ khác nhau trong bình gạn với tỉ lệ v dung môi: Vdịchiọc = 1:5 Lắc 15 phút, để phân lớp trong 1 giờ Sau đó tách riêng lớp dung môi và dịch lọc

- Kiểm tra hoạt tính của lớp dung môi và lớp dịch lọc sau mỗi lần chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc để lựa chọn dung môi và pH chiết tối ưu

b Thu bột kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay

Dịch chiết được đem cất chân không bằng máy cất quay Buchi Waterbath ở nhiệt độ 80°c ta thu được cắn kháng sinh thô Hòa tan cắn bởi Methanol và

cho vào đĩa Petri sạch, sấy khô ở nhiệt độ 50°c Cân cắn và đánh giá hiệu suất kháng sinh thô.

c Tách kháng sinh bằng sắc k í lớp mỏng

- Dung môi được pha theo đúng tỉ lệ và cho vào bình sắc kí (lóp dung môi không quá lcm ), để ổn định trong 30 phút

- Dùng mao quản chấm dịch chiết hữu cơ lên bản mỏng 3-5 lần, cách mép dưới 1.5cm, để khô tự nhiên sau mỗi lần chấm hoặc cho vào tủ sấy ở nhiệt độdưới 50°c.

- Đặt bản mỏng vào bình sắc kí theo quy định, cho dung môi chạy % bản mỏng, lấy ra đánh dấu vết dung môi chạy (Ddm) sấy khô bản mỏng Xác định vết bằng phương pháp :

o Soi đèn tử ngoại

o Hiện hình vi sinh vật: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ môi trường

thạch thường đã cấy v s v kiểm định, ủ ở 37°c trong 18-24h v ế t kháng sinh được xác định bằng vòng vô khuẩn

Ddm: Khoảng cách dung môi chạy

c Tách kháng sinh bằng sắc k í cột

- Mau thử: Bột kháng sinh thô thu được sau khi cất quay dịch chiết dung môi

hữu cơ bằng máy cất chân không

- Chuẩn bị cột sắc kỉ: cột đường kính lcm, dài 50cm