Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 80 259

T R U O N G ĐẠI HỤC DU ụ• c HA rsụ i • • • NGUYỄN THỊ HẢI HÀ NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH Từ STREPTOMYCES 80.259 LUẬN VĂN THẠC SỸ • • CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ Dược HỌC • • Dược PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60.73.01 Người hướng dẫn khoa học : PGS TS Cao Văn Thu TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI T H Ư VIỆN Ngày tháng Á năm Ọ ịẠ Ạ J o D K C B : ă k i J C W X ? tt HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS TS Cao Vãn Thu - người trực tiếp hướng dẫn, động viên tận tình bảo em suốt thời gian thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên môn Vi sinh-Sinh học, môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội tuôn giúp đỡ động viên em trình làm luận văn Em muốn gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường tạo điều kiện thuận lợi cho em suối thời gian học tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cồ, anh chị viện Hóa học hợp chất thiên nhiên ln nhiệt tình giúp đỡ, bảo đóng góp ỷ kiến quỷ báu giúp em hồn thiện khóa luận Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ người thân yêu gia đình bạn bè ln bên em, chia sẻ, khích lệ động viên em suốt trình học tập để em đạt kết ngày hôm Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2010 Học viên Nguyễn Thị Hải Hà MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đ È Chương TỔNG Q U A N 1.1 XẠ KHUẨN 1.1.1 Vài nét xạ khuẩn 1.1.2 Khả sinh chất kháng sinh Streptomyces .5 1.2 ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN LOẠI VÀ XÁC ĐỊNH TÊN XẠ K H U Ẩ N 1.2.1 Khái quát số phương pháp phân loại phổ biến 1.2.2 Tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân t .7 1.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỎNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN 11 1.3.1 Các yếu tố thuộc môi trường lên m e n 11 1.3.2 Các yếu tố thuộc điều kiện nuôi cấy 14 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHÉ KHÁNG SINH 15 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỐ CỦA KHÁNG SINH 19 1.5.1 Phổ hồng ngoại (Phổ IR ) 19 1.5.2 Phổ tử ngoại (Phổ U V ) 19 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Phổ 'H -N M R ) 20 1.5.4 Phổ khối 21 Chương 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 23 2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIỀN c ứ u .23 2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 26 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống 26 2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tá n 27 2.2.3 Phương pháp cải tạo chọn giống 28 2.2.4 Phương pháp lên men chu k ỳ 30 2.2.5 Chiết kháng sinh 30 2.2.6 Phương pháp xác định trình tự gen Streptomyces 32 Chương 3: KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 34 3.1 NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỎNG HỢP KHÁNG SIN H 34 3.1.1 Kết chọn môi trường nuôi cấy môi trường lên m en .34 3.1.2 Kết sàng lọc ngẫu n h iên 36 3.1.3 Kết đột biến cải tạo giống lần 37 3.1.4 Kết đột biến cải tạo giống lần 39 3.1.5 Kết lên men với biến chủng tốt n h ất 41 3.1.6 Nâng cao hiệu suất lên men sinh tổng họp chất kháng sin h 41 3.2 CHIÉT XUẤT VÀ TINH CHẾ KHÁNG SINH TỪ DỊCH LỌC 45 3.2.1 Kết chọn dung môi pH chiết 45 3.2.2 Kết SKLM chọn hệ dung m ô i 47 3.2.3 Kết sắc ký c ộ t 48 3.3 KẾT QUẢ ĐO MỘT SỐ PHỔ CỦA THÀNH PHẦN KHÁNG SINH CHÍNH 52 3.3.1 Phổ hồng ngoại 52 3.3.2 Phổ tử ngoại 52 3.3.3 Phổ khối 53 3.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 53 3.4 PHÂN LOẠI VÀ ĐỊNH TÊN STREPTOMYCES 80.259 53 3.4.1 Phân loại theo khóa phân loại ISP 53 3.4.2 Phân loại theo kỹ thuật g e n 54 Chương 4: BÀN LUẬN 55 4.1 NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG STREPTOMYCES 80.259 55 4.2 CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ KHÁNG S IN H 58 4.3 BIỆN GIẢI PHỎ CỦA THÀNH PHẦN KHÁNG SINH CHÍNH 60 4.4 PHÂN LOẠI VÀ ĐỊNH TÊN STREPTOMYCES 80.259 62 KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị 64 CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIÉT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic Gr(+) Gram(+) Gr(-) Gram(-) HPLC High-Performed Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IR Infrared (Hồng ngoại) ISP International Streptomyces Project KS Kháng sinh MT Môi trường MS Mass Spectrometry (Phổ khối) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) STT Số thứ tự ƯV Ultra violet (Tử ngoại) vsv Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces Bảng 2.1 Các môi trường nuôi cấy Bảng 2.2 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn [g/100ml] 24 Bảng 3.1 Đánh giá hoạt tính kháng sinh môi trường 34 Bảng 3.2 Kêt chọn môi trường lên men 35 Bảng 3.3 Kết sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 80.259 36 Bảng 3.4 Kết sàng lọc sau đột biến lần 38 Bảng 3.5 Kêt sàng lọc sau đột biên lân 39 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính kháng sinh sau lên men 41 vsv kiểm định 23 Thành phân môi trường thử nâng cao hiệu suât lên 42 Bảng 3.7 men Kêt thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men 43 Bảng 3.8 môi trường khác Kêt thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men 44 Bảng 3.9 môi trường có thay đổi tỷ lệ tinh bột Bảng 3.10 Các dung môi chiết khảo sát 45 Bảng 3.11 Kết chọn dung môi pH chiết kháng sinh 46 Bảng 3.12 Kết sắc ký lớp mỏng hình nhờ s flexneri 48 Bảng 3.13 Kết thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký cột 49 Kết chạy SKLM với phân đoạn có hoạt tính kháng Bảng 3.14 50 sinh Kêt thử hoạt tính kháng sinh sau săc ký với hệ dung Bảng 3.15 51 môi Kêt chạy SKLM với phân đoạn có hoạt tính kháng Bảng 3.16 Bảng 3.17 52 sinh với hệ dung môi Đặc trưng phân loại theo ISP Streptomyces 80.259 53 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Sự phát triên khuân ti xạ khuân Hình 1.2 Một số hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 1.3 Sơ tơng qt sinh tơng hợp kháng sinh 18 Hình 1.4 Các phương pháp phân tích phơ 22 ĐẶT VÁN ĐÈ Cùng với phát triển xã hội, mơ hình bệnh tật nước ta có nhiều thay đổi theo hướng đa dạng phức tạp Tuy nhiên với nét đặc trưng quốc gia phát triển nằm vùng khí hậu nhiệt đới, bệnh nhiễm khuẩn bệnh phổ biến mơ hình bệnh tật Việt Nam, kể khứ, tương lai Chúng ta phủ nhận vai trò to lớn kháng sinh điều trị bệnh nhiễm khuẩn điều trị ung thư Nhưng kháng kháng sinh lại trở thành mối quan tâm toàn cầu Tại Việt Nam, tình trạng đáng báo động việc kê đơn sử dụng thuốc chưa kiểm soát chặt chẽ dẫn đến việc lạm dụng kháng sinh cộng đồng ngày gia tăng Điều không gây khó khăn cơng tác điều trị bệnh mà làm tăng nguy tương tác bất lợi cho người bệnh phải sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh để tránh kháng thuốc Đứng trước thực tế việc phát triển ngành cơng nghiệp kháng sinh cần thiết hết nhằm tạo kháng sinh có hiệu điều trị cao bị kháng Bên cạnh việc nghiên cứu sản xuất kháng sinh bàng phương pháp tổng hợp hay bán tổng hợp việc kiếm tìm sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên quan trọng khơng thể thay Với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, nước ta có hệ vi sinh vật phát triển phong phú phải kể đến chủng xạ khuẩn chi Streptomyces sinh kháng sinh Theo thống kê khoảng 53% số kháng sinh có giới sinh tổng hợp từ họ xạ khuẩn Tại Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu Streptomyces việc phân loại định tên chủng dựa tiến kỹ thuật sinh học phân tử chưa áp dụng phổ biến Các vấn đề nâng cao hiệu suất lên men hay nghiên cứu chất kháng sinh chưa sâu a ZlL'Z HEL Lz0 ’ V StZ" :Z6" s L-'Z in r-i I o in ưi Q I (N K 806 ' in ló 568'9 - o :$Z" t- ^ :3I7 668*0 *0812 coo fOfĩ- Phụ lục 15: Phổ 'H-NM R thành phần kháng sinh a, H Ĩ.LS : “C ru n Mr Q*51 -C H 2-D M S 0-1H Sill: 9111 in 9?ĩ‘: CVJ L62.:e 161.11 LO rò ĩ&ĩ' Phụ lục 16: Phổ ^ -N M R thành phần kháng sinh ; C- ' k s ĩ ti-.Ịy«»jĩc,ỹ ặ a s s tíS s s ậ s SạdíHỊp'" ■' H " 2s S'*i I ; tu T t u PM H ! \» • el "t ịa a ậ ậ ậ s -**3 nl : 1H ô3 iy s i 0 * ô ằ >ô! Ill * ô H I J , sssssSsaaaiiijM H t Z ẫ f- as? 8> 3óô! tm U ô ô in &^ HiI : i l l §2i l l a s s KB 18 20í ‘81 /XO‘61 £0/, *02 990 ■tz >» • zz I ', - « Y s 1•>••>•': 8W8Z «>£6*82 ZH'Ot SC2 • l i Vữt' K tfí