NGHIÊN cứu SINH TỔNG hợp ENZYM CELLULASE từ CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN lập từ đất vườn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP ENZYM CELLULASE TỪ CHỦNG Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ðẤT VƯỜN Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LƯƠNG ðỨC PHẨM TS NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI - 2014 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực khơng trùng lặp với đề tài khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc Học viên Nguyễn Thị Cúc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i LỜI CẢM ƠN Luận văn ñược thực phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ðể hồn thành luận văn tơi ñã nhận ñược nhiều ñộng viên, giúp ñỡ nhiều cá nhân tập thể Trước hết, xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc kính trọng tới PGS.TS Lương ðức Phẩm TS Nguyễn Văn Giang người tận tình bảo, hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ks Phạm Thị Hải, ñã nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, Thầy Cô giáo Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Cơng nghệ Sinh học, tạo điều kiện giúp đỡ tơi kiến thức chuyên môn suốt năm học tập làm luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người thân ln bên tơi, động viên khuyến khích tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Học viên Nguyễn Thị Cúc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x PHẦN MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề .1 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung ñề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus 2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.3 Một số Bacillus thường gặp tự nhiên 2.2 Giới thiệu chung cellulose enzym cellulase 11 2.2.1 Cellulose .11 2.2.2 Lignocellulose .13 2.2.3 Enzym cellulase 16 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp enzym cellulase vi sinh vật 23 2.2.5 Một số ứng dụng enzym cellulase 25 2.2.6 Thu nhận tinh enzym cellulase từ môi trường nuôi cấy .26 2.3 Tình hình nghiên cứu enzym cellulase 27 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới .27 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 28 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 ðối tượng vật liệu nghiên cứu 29 3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 29 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iv 3.1.2 Thiết bị dụng cụ 29 3.1.3 Hóa chất 30 3.2 Các phương pháp nghiên cứu 31 3.2.1 Phương pháp giữ giống 31 3.2.2 Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào 31 3.2.3 Phương pháp xác định chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym cellulase (phương pháp định tính) .31 3.2.5 Xác ñịnh sinh trưởng theo mật ñộ quang 35 3.2.6 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ enzym cellulase - CMCase (phương pháp ñịnh lượng) (Ghose TK, 1987) 36 3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố ñến khả sinh tổng hợp enzym CMCase 37 3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố ñến hoạt ñộ CMCase .39 3.2.9 Phương pháp tách thu nhận enzym CMCase dung môi hữu (ethanol 960 aceton) 40 3.2.10 Xác ñịnh ñộ bền nhiệt ñộ CMCase 41 3.2.11 Xác ñịnh ñộ bền pH CMCase 41 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 4.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzym CMCase 42 4.1.1 Kết tuyển chọn 42 4.1.2 Lựa chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym CMCase 43 4.2 Phân loại .44 4.2.2 Xác ñịnh số phản ứng sinh hóa chủng Bs4 44 4.3 ðường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis Bs4 45 4.4 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố ñến khả sinh tổng hợp enzym CMCase 46 4.4.1 Lựa chọn chất cảm ứng thích hợp 46 4.4.2 Ảnh hưởng nồng ñộ chất cảm ứng CMC 48 4.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ mơi trường 49 4.4.4 Ảnh hưởng pH ban ñầu 49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v 4.4.5 Ảnh hưởng nồng ñộ CaCO3 50 4.4.6 Ảnh hưởng độ thơng khí 51 4.4.7 Ảnh hưởng thời gian ñến khả sinh tổng hợp enzym CMCase 52 4.5 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố ñến hoạt ñộ CMCase 54 4.5.1 Nhiệt độ phản ứng thích hợp 54 4.5.2 pH phản ứng thích hợp 55 4.6 Nghiên cứu tách enzym CMCase từ dịch môi trường 57 4.7 Xác ñịnh ñộ bền nhiệt CMCase 58 4.8 Xác ñịnh ñộ bền pH CMCase 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận 61 Kiến nghị .61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .62 PHỤ LỤC 66 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hoá B Subtilis Bảng 2.2 Thành phần hóa học số loại phế thải nơng nghiệp 14 Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng ñề tài 29 Bảng 3.2 Các hoá chất sử dụng ñề tài 30 Bảng 3.3 Phương pháp xác định hoạt tính số enzym ngoại bào Bacillus subtilis 35 Bảng 3.4 Lượng chất cho vào q trình thí nghiệm xác ñịnh ñường chuẩn glucose 36 Bảng 3.5 Lượng chất cho vào q trình thí nghiệm xác định hoạt ñộ cellulase 37 Bảng 4.1 ðường kính VPG chất CMC chủng Bs 43 Bảng 4.2 Kết xác ñịnh số phản ứng sinh hóa chủng Bs4 44 Bảng 4.3 Ảnh hưởng chất cảm ứng tới khả sinh tổng hợp CMCase chủng Bs4 47 Bảng 4.4 Ảnh hưởng nồng ñộ chất cảm ứng CMC ñến khả sinh CMCase chủng Bs4 48 Bảng 4.5 Ảnh hưởng pH ban ñầu ñến khả sinh enzym CMCase 50 Bảng 4.6 Khả sinh tổng hợp enzym CMCase chủng Bs4 môi trường có CaCO3 51 Bảng 4.7 Ảnh hưởng ñộ hiếu khí lên khả sinh tổng hợp enzym CMCase chủng Bs4 52 Bảng 4.8 Ảnh hưởng thời gian ñến khả sinh tổng hợp enzym CMCase chủng Bs4 53 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nhiệt ñộ phản ứng thích hợp đến hoạt độ CMCase chủng Bs4 54 Bảng 4.10 Ảnh hưởng pH phản ứng thích hợp đến hoạt độ CMCase chủng Bs4 56 Bảng 4.11 Thu nhận enzym dung môi hữu 57 Bảng 4.12 Kết đo hoạt độ CMCase theo dung mơi hữu 57 Bảng 4.13 ðộ bền nhiệt CMCase 58 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vii Bảng 4.14 ðộ bền pH CMCase 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 2.2 Cấu tạo phân tử cellulose 12 Hình 2.3 Cấu trúc CMC 13 Hình 2.4 Cấu trúc lignocellulose 14 Hình 2.5 Cấu tạo phân tử lignin 16 Hình 2.6 Cơ chế hoạt ñộng endoglucanase (EG) 19 Hình 2.7 Cơ chế hoạt động exoglucanase (CBH) 20 Hình 2.8 Cơ chế hoạt động β - glucozidase 20 Hình 2.9 Sơ ñồ tác ñộng phân giải hệ cellulase lên phân tử cellulose (Has G.Schlegel, 1993) 21 Hình 2.10 Mơ hình phân hủy cellulose Lutzen 22 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng Bs có hoạt tính enzym ngoại bào 43 Hình 4.2 Khả thủy phân chất CMC chủng vi khuẩn Bs4 43 Hình 4.3 ðường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn Bs4 300C 45 Hình 4.4 Ảnh hưởng chất cảm ứng tới khả sinh tổng hợp CMCase chủng Bs4 47 Hình 4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ mơi trường đến khả sinh enzym CMCase 49 Hình 4.6 Ảnh hưởng thời gian ñến khả sinh tổng hợp enzym CMCase chủng Bs4 53 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ix Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Bảng 4.8 Ảnh hưởng thời gian ñến khả sinh tổng hợp enzym CMCase chủng Bs4 Thời gian (h) pH Hoạt ñộ CMCase (UI/ml) 20 6.38 1.034 ± 0.001 30 6.42 1.285 ± 0.003 36 6.50 1.297 ± 0.015 40 6.52 1.254 ± 0.045 44 6.58 1.123 ± 0.016 48 6.43 1.078 ± 0.005 52 6.41 0.964 ± 0.015 Hình 4.6 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh tổng hợp enzym CMCase chủng Bs4 Qua bảng 4.8 chúng tơi nhận thấy thời gian để sinh tổng hợp enzym CMCase chủng Bs4 cao vào khoảng 30 – 36 ñạt cực ñại 36 (1.312 UI/ml) Hoạt ñộ CMCase chủng Bs4 giảm dần theo thời gian ñến 52 cịn 73.47% so với hoạt độ cựcc đại lúc 36 Vậy 36 thời gian ñể chủng Bs4 sinh tổng hợp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 53 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi enzym CMCase cao thời gian tốt cho việc tách chiết enzym ñể thực cho thí nghiệm 4.5 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố ñến hoạt ñộ CMCase 4.5.1 Nhiệt độ phản ứng thích hợp Theo quy luật phản ứng hóa học thơng thường, vận tốc phản ứng enzym tăng nhiệt ñộ tăng Tuy nhiên, enzym có chất protein, ñó tăng nhiệt ñộ tới giới hạn vận tốc phản ứng enzym bị giảm biến tính protein Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi nhiệt độ tối thích, thường khoảng từ 40 – 600C Tuy nhiên enzym có nhiệt độ tối thích khác nhau, phụ thuộc vào nhiều yếu tố nguồn enzym, chất, pH môi trường, thời gian phản ứng nhiệt độ mà enzym bị hồn tồn hoạt tính xúc tác gọi nhiệt ñộ tới hạn, thường khoảng 700C Ở nhiệt độ tới hạn, enzym biến tính, có khả phục hồi Ngược lại, nhiệt độ 00C hoạt tính enzym bị giảm lại tăng lên đưa nhiệt độ bình thường (Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Thị Trân Châu, 2008) ðể khảo sát nhiệt ñộ tối ưu enzym CMCase phản ứng ñược thực nhiệt ñộ khác từ 30 – 800C, với pH 5.0 (ñệm photphat) Hoạt ñộ CMCase ñược xác ñịnh sau 20 phút theo phương pháp mục 3.2.6 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nhiệt ñộ phản ứng thích hợp đến hoạt độ CMCase chủng Bs4 Nhiệt ñộ phản ứng (0C) Hoạt ñộ CMCase (UI/ml) 30 0.943 ± 0.001 40 1.235 ± 0.007 50 1.301 ± 0.003 60 1.205 ± 0.034 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 54 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 70 0.914 ± 0.005 80 0.753 ± 0.015 Dựa vào kết thu ñược cho thấy hoạt ñộ CMCase chủng Bs4 tăng cao khoảng 40 – 600C ñạt cực ñại 500C (1.301 UI/ml) Ở 300C hoạt độ enzym giảm cịn 72% so với hoạt ñộ cực ñại Hoạt ñộ enzym giảm nhiệt độ tăng, cịn 70% 700C 57% 800C so với hoạt ñộ cực ñại Như vậy, nhiệt ñộ phản ứng thích hợp enzym CMCase 500C Những nghiên cứu trước ñây cho thấy, nhiệt ñộ phản ứng thích hợp cellulase B pumilus 600C (Ariffin H cộng sự, 2006), cellulase B subtilis YJ1 600C (Yin cộng sự, 2010) Như vậy, nhiệt độ phản ứng thích hợp chủng B subtilis Bs4 thấp với cellulase chủng vi khuẩn nghiên cứu trước Nhìn chung, enzym CMCase chịu nhiệt cao Chịu nhiệt cao enzym có ý nghĩa lớn việc sản xuất ứng dụng enzym Và tính chịu nhiệt enzym sản xuất từ loài B subtilis Bs4 hứa hẹn lớn khả ứng dụng sản xuất chế phẩm enzym thương mại Khi nhiệt độ tăng, hoạt tính enzym cellulase giảm Vì, nhiệt độ tăng, tăng lượng ñộng học (tần số va chạm phát triển) tần số phức hợp enzym – chất phát triển đơn vị thời gian tốc độ phản ứng tăng tăng sản phẩm Trong phản ứng enzym kiểm sốt nhiệt độ thích hợp nhanh chóng ñạt ñến tương ứng với tốc ñộ cực ñại phản ứng cao nhiệt độ thích hợp (tốc độ phản ứng giảm nhanh nhiệt độ cao làm enzym (protein) bị biến tính) Trung tâm hoạt động cấu hình chuẩn khơng cịn phù hợp với chất, làm vai trò xúc tác 4.5.2 pH phản ứng thích hợp Enzym có chất protein Sự phân ly khác phân tử protein giá trị pH khác làm thay ñổi tính chất trung tâm liên kết chất hoạt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 55 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ñộng phân tử enzym Mỗi enzym có pH phản ứng ða số enzym thích hợp pH phản ứng trung tính (Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Thị Trân Châu, 2008) ðể tìm khoảng pH thích hợp cho hoạt ñộng enzym CMCase, phản ứng ñược thực nồng ñộ chất 1% CMC; dung dịch chất ñược pha ñệm Britton 50mM pH từ 4.0 – 8.0 Hoạt ñộ enzym ñược xác ñịnh mục 3.2.6 Bảng 4.10 Ảnh hưởng pH phản ứng thích hợp ñến hoạt ñộ CMCase chủng Bs4 pH phản ứng Hoạt ñộ CMCase (UI/ml) 4.0 0.514 ± 0.003 4.5 1.018 ± 0.002 5.0 1.295 ± 0.001 5.5 1.298 ± 0.01 6.0 1.312 ± 0.015 6.5 1.014 ± 0.034 7.0 0.912 ± 0.021 7.5 0.715 ± 0.018 8.0 0.686 ± 0.015 Qua kết thu ñược cho thấy hoạt ñộ CMCase tăng khoảng pH giới hạn 5.0 – 6.0, hoạt ñộ ñạt cực ñại pH 6.0 (1.312 UI/ml), sau ñó giảm dần Ở pH 6.5 4.5, hoạt ñộ CMCase chủng Bs4 khơng bị giảm nhiều, đạt 77% Sau hoạt độ giảm xuống cịn 54% pH 7.5 52% pH 8.0 Một số nghiên cứu gía trị pH phản ứng thích hợp cellulase từ chủng khác cellulase từ chủng vi khuẩn RM2.2 có hai giá trị pH hoạt động thích hợp 4.5 (Trịnh ðình Khá cộng sự, 2008); dải pH thích hợp cho hoạt động cellulase từ chủng Bacillus circulans 4.5 – 7.0 (Kim, C.H., 1995); chủng Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 56 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Bacillus 5.0 – 6.5 (Mawadza cộng sự, 2000); Bacillus subtilis YJ1 6.0 – 6.5 (Li-Jung Yin cộng sự, 2010) 4.6 Nghiên cứu tách enzym CMCase từ dịch môi trường Dùng môi trường có chất cảm ứng CMC 1% bình trụ miệng nhỏ 250 ml, cấy vi khuẩn với nồng ñộ 2%, ni nhiệt độ 370C, 36 đem ly tâm 5000 vòng/phút 15 phút loại bỏ cặn giữ lạnh 40C Rồi tiến hành tủa enzym với tác nhân tủa ethanol acetone tỷ lệ dung dịch enzym thô (VddE) : dung môi (Vdm) là: 1:4 Chế phẩm enzym thu ñược sau tủa dung mơi hưuc cịn nước nên dễ bị hoạt tính nên phải sấy khơ 300C, tiến hành cân để xác ñịnh hiệu suất thu nhận Sau ñó chế phẩm enzym ñược bảo quản lạnh 40C Kết ñược thể bảng 4.9 Bảng 4.11 Thu nhận enzym dung môi hữu Tác nhân tủa Ethanol 960 VddE/Vdm 1:4 Acetone Hiệu suất thu nhận (g/100ml) 2.9 VddE/Vdm 1:4 Hiệu suất thu nhận (g/100ml) 3.0 Tiếp ñến ta tiến hành lấy 0,1g chế phẩm cellulase thu ñược theo dung môi hữu 150 ml mước cất ðo hoạt ñộ enzym CMCase phương pháp Ghose TK ta thu ñược kết bảng sau Bảng 4.12 Kết đo hoạt độ CMCase theo dung mơi hữu Tác nhân tủa Hoạt ñộ CMCase (UI/g) Ethanol 960C 3.412 ± 0.014 Acetone 3.213 ± 0.012 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 57 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Dựa vào bảng 4.10 ta nhận thấy sử dụng dung môi hữu ethanol 960C acetone ñều cho hiệu suất tủa cao Tuy nhiên dung mơi tủa ethanol 960C cao ñồng thời hoạt ñộ enzym ñược giữ lại cao 4.7 Xác ñịnh ñộ bền nhiệt CMCase ðể xác ñịnh ñộ bền nhiệt CMCase tiến hành cho chế phẩm enzym giữ dung dịch ñệm photphat (1:1) nhiệt ñộ từ (30 – 1000C) Với hoạt lực chế phẩm enzym ban đầu 40C (3.325 UI/g) hoạt lực cịn lại sau ñể chế phẩm enzym nhiệt ñộ khác Kết ñược thể bảng 4.13 Bảng 4.13 ðộ bền nhiệt CMCase Nhiệt độ (0C) Hoạt lực cịn lại (%) 100 30 98.01 40 93.00 50 86.21 60 81.32 70 76.45 80 31.34 90 2.31 100 0.00 Kết thu ñược cho thấy nhiệt ñộ cao hoạt ñộ cellulase giảm; ñặc biệt từ 800C – 1000C, hoạt ñộ giảm mạnh 800C gần hoạt ñộ 900C Ở nhiệt ñộ từ 40 – 700C hoạt độ cellulase giảm Vậy hoạt độ cellulase chủng Bs4 tương ñối bền nhiệt Những cellulase bền nhiệt có ý nghĩa lớn thực tế sản xuất bảo quản sản phẩm sau Vì nhiệt độ khơng ảnh hưởng đến thời gian bảo quản sản phẩm mà cịn ảnh hưởng đến cách thức tạo chế phẩm Nếu nén sản phẩm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 58 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi thành viên bảo quản chúng dễ dàng dạng bột dạng dịch lỏng Nhưng dạng viên nén phải xử lý 1000C vòng 30 phút, mà cellulase thu ñược hoạt tính 1000C nên chúng thích hợp bảo quản dạng bột dạng lỏng Ngoài ra, enzym bền nhiệt cịn có nhiều lợi q trình xử lý thức ăn Thức ăn ñược ủ mhiệt ñộ cao vài mà không làm giảm hoạt độ mhiều mà cịn tăng tốc độ phản ứng Hơn việc trộn enzym vào thức ăn nhiệt độ cao trước cho vật ni ăn cịn có tác dụng làm giảm tạp nhiễm VSV có hại thường phát triển nhiệt ñộ 30 – 400C Mặt khác, enzym cellulase bền nhiệt cịn có lợi xử lý phế thải nông nghiệp trình làm phân bón hữu cơ, thường đống ủ có nhiệt độ tương đối cao 49 – 700C 4.8 Xác ñịnh ñộ bền pH CMCase pH yếu tố ảnh hưởng nhiều lên hoạt động enzym nói chung cellulase nói riêng Vì chúng tơi ñã tiến hành xác ñịnh ảnh hưởng pH lên ñộ bền cellulase Theo phương pháp ñã trình bày mục 3.2.11 Kết thu ñược sau: Bảng 4.14 ðộ bền pH CMCase pH Hoạt lực lại (%) 4.0 30.21 4.5 71.38 5.0 90.54 5.5 95.71 6.0 100 6.5 70.02 7.0 63.09 7.5 57.78 8.0 50.68 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 59 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Cellulase tương ñối bền pH từ 4.5 ñến 8.0; pH = 4.0 hoạt độ cịn 30% bền pH 6.0 Vậy enzym CMCase chủng B Subtilis Bs4 tương đối bền mơi trường axit yếu bazơ yếu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 60 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận ðã chọn chủng vi khuẩn Bs4 có khả sinh enzym CMCase cao Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học thử phản ứng hóa sinh thấy chủng Bs4 gần giống với loài Bacillus subtilis Các điều kiện ni thích hợp để sinh enzym CMCase chủng Bacillus subtilis Bs4 sau: Chất cảm ứng CMC 1%, nhiệt độ mơi trường: 370C, pH ban đầu: 6.5, nồng ñộ muối CaCO3 : 0.5%, nhiệt ñộ phản ứng: 500 C, pH phản ứng: 6.0 Bước ñầu tách enzyme CMCase etanol 960 cho hoạt ñộ cao (1.512 UI/ml), hoạt ñộng tốt khoảng 30 - 70 oC, chịu ñược pH khoảng rộng 4.5 – 8.0, tốt pH 6.0 Kiến nghị Vì thời gian có hạn, có điều kiện cần khảo sát thêm: Nghiên cứu qui trình sản xuất cellulase quy mơ lớn với thiết bị lên men chìm (reactor) ñể thu nhận cellulase có hàm lượng hoạt ñộ cao Nghiên cứu tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng nhằm nâng cao hoạt ñộ ñộ bền cellulase Ưng dụng enzym cellulase ñể sản xuất phân hữu vi sinh từ phế thải nông nghiệp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 61 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Cao Thị Hạnh (2007) Nghiên cứu nuôi vi khuẩn Bacillus thu sinh khối ñể sản xuất chế phẩm EMINA dùng chăn nuôi bảo vệ môi trường, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội Lương ðức Phẩm (2009) Cơ sở khoa học công nghệ bảo vệ môi trường, tập hai, nhà XBGDVN Lương ðức phẩm (2005) Sản xuất sử dụng chế phẩm sinh học dùng nông nghiệp, nhà XBGDVN Lương ðức Phẩm (1979) Vi sinh tổng hợp, NXBGD Việt Nam Lương ðức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Lương ðức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp Lê ðỗ Mai Phương (2004) phân lập, khảo sát ñặc ñiểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu khả sinh enzym (protease, amylase) vi khuẩn ñể sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học, Trường ðại Học Nông Lâm TPHCM Lê Xuân Phương (2001) Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Xây dựng Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1989) Công nghệ vi sinh, NXBGD 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn ðăng ðức, ðặng Hồng Nguyên, Phạn Văn Ty, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Phùng Tiến (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập I, II, III, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật 11 Nguyễn Lân Dũng (dịch) (1983) Thực hành Vi Sinh Vật Học, NXB ðại Học Trung Học Chuyên Nghiệp Hà Nội 12 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn ðình Quyến, Phạm Văn Ty (2007) Vi sinh vật học, NXBGD Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 62 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 13 Nguyễn Thị Huyền Thu (2007) Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng Bacillus sinh enzym thủy phân từ ñất vườn, Viện ðại học Mở Hà Nội 14 Nguyễn ðức Lượng (chủ biên), Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004) Công Nghệ Enzym, NXB ðại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 15 Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Thị Trân Châu (2008) Công nghệ Sinh học – tập 3: Enzym ứng dụng, NXBDG, trang 196 16 Trần Xuân Ngạch (2005) Công nghệ enzym, ðại học Bách Khoa ðà Nẵng 17 Trần ðỗ Quyên (2004) nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α – amylaza ứng dụng sản xuất dextrin, Trường ðại Học Nông Lâm TPHCM 18 Tơ Minh Châu (2000) Giáo trình thực tập vi sinh học 19 Lê Ngọc Tú (2002) Hóa sinh công nghiệp, NXB khoa học kỹ thuật HN 20 Trịnh ðình Khá, ðỗ Thị Thanh Huyền (2008) Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật phân hủy cellulose đánh giá số đặc điểm hóa sinh cellulase, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV Nxb khoa học kỹ thuật, Hà Nội: 823826 Tài liệu tiếng Anh: 21 Ariffin H, Abdullah N, Umi Kalsom MS, Shirai Y and Hassan MA (2006) Production and Characterisation of cellulase by Bacillus pumilus EB3, Internation Journal of Engineering and Technology, Vol 3, pp 47-53, 22 Cherry JR and Fidantsef (2003) Directed evolution of industrial enzym: an update Curr Opin Biotechnol 14: 438 – 443 23 Ghose TK (1987) Measurement of cellulase activities, Pure & Appl Chem, Vol 59, pp 257—268 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 63 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 24 Hakamada Y, Koike K, Yoshimatsu T, Mori H, Kobayashi T, ItoS (1997) Thermostable alkaline cellulose from an alkaliphilic isolate, Bacillus sp KSM – S273, Extremophiles (3), 151 – 25 Kim CH, (1995) Characterization and substrate specificity of an endo-beta-1,4-Dglucanase I (Avicelase I) from an extracellular multienzym complex of Bacillus circulans Applied and Environmental Microbiology Vol.61, No.3, pp 959-965 26 Lagerkvist A and Chen H (1993) Control of two-step anaerobic degradation of Municipal Solid Waste (MSW) by enzym addition Water Science and Technology Vol.27, pp 47 – 56 27 Li-Jung Yin, Hsin-Hung Lin, and Zheng-rong Xiao (2010) Purification and characterization of a cellulase from Bacillus subtilis YJ1 Journal of Marine Science and Technology Vol 18, No 3, pp 466-471 28 Laurent P, L Buchon, JFG Michel, N Orange (2000) Production of pectate lyases and cellulase by Chyrseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature and the nature of the culture medium: evidence for two critical temperature Aps and Env Micro 66 (4) 1538 – 1543 29 Mawadra C, Boogerd F C, Zvauya R, Van Verseveld HW (1996) influence of environmental factors on endo-beta-1,4-glucocanase production by Bacillus HR 68, isolated from a Zimbabwean hot spring, Antonie Van Leeuwenhoek 69 (4), 363-9 30 M Paul, B Setlow and P Setlow (2006) Killing of spores of Bacillus subtilis by tertbutyl hydroperoxide plus a TAML_ activator, Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072 31 Mawadza C, Hatti-Kaul R, Zvauya R, and Matiasson B (2000) Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains Journal of Biotechnology, Vol 83, No 3, pp 177-187 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 64 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 32 Ozaki K, Ito S (1991) Purification and properties of an acid endo – beta – 1,4 – glucocanase from Bacillus sp KSM – 330, J Gen Mcrobiol 137 (1), 41 – 33 Palonen (2004) Hetti Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose Espoo VTT Publications 520 80 p + app 62 p 34 Vijayalakshmi K Sushma, S Abha, and P Chander Isolation Characterization of Bacillus Subtilis KC3 for Amylolytic Activity Vol 2, No 5, September 2012 Từ trang Wed: (www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 65 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi PHỤ LỤC Hình ðường kính VPG chất CMC chủng Bs Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 66 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Bảng Số liệu ñường chuẩn để xác định hoạt tính CMCase Ống số Hàm lượng glucose (%) 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.108 0.296 0.475 0.706 0.925 OD (540nm) Cơng thức tính hoạt tính OD = OD2 – OD1 Từ giá trị OD dựa vào ñường chuẩn xác ñịnh hàm lượng ñường khử B (g/100ml) CMCase = B*4*10^6 / (180*20*100) (UI/ml) Trong OD2, OD1 kết đo mẫu mẫu Hình ðồ thị ñường chuẩn glucose phần 2.3.4 4: thể tích dung dịch curvet đem đo độ hấp thu (ml) 180: phân tử lượng glucose 20: thời gian phản ứng (phút) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 67 ... phát từ lý tình nghiên cứu Việt Nam, chúng tơi tiến hành thực ñề tài: ‘? ?Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng Bacillus subtilis phân lập từ ñất vườn? ??’ 1.2 Mục đích đề tài Chọn chủng. .. cứu cho thấy Việt Nam chưa có cơng trình cơng bố việc phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh cellulase từ vi khuẩn ‘? ?Bacillus subtilis Vì việc : nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ. .. nghiên cứu 2.3 Tình hình nghiên cứu enzym cellulase 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới Nghiên cứu ứng dụng cellulase bắt ñầu từ năm 1950 Cuối thé kỷ XIX có nhiều tác giả nghiên cứu khả tổng hợp cellulase