NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HỆ ENZYME CELLULASE, PECTINASE TỪ CÁC CHỦNG Trichoderma VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ XỬ LÝ VỎ CÀ PHÊ TRONG SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HỆ ENZYME CELLULASE, PECTINASE TỪ CÁC CHỦNG Tricho

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HỆ ENZYME CELLULASE,

PECTINASE TỪ CÁC CHỦNG Trichoderma VÀ

ỨNG DỤNG ĐỂ XỬ LÝ VỎ CÀ PHÊ TRONG SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG THỊ NGỌC HÂN Niên khoá : 2005 – 2009

Tháng 8/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HỆ ENZYM CELLULASE,

PECTINASE TỪ CÁC CHỦNG Trichoderma VÀ

ỨNG DỤNG ĐỂ XỬ LÝ VỎ CÀ PHÊ TRONG

SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH

Th.S TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG TRƯƠNG THỊ NGỌC HÂN

Tháng 8/2009

LỜI CẢM ƠN

Con xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, gia đình đã luôn bên con,

động viên và giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho con trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn đến:

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm

Khoa Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô tại trường đã luôn tận tình

hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi

Th.S Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi và tạo mọi

điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

Cô Tăng Thị Ánh Thơ và chị Trần Thị Quỳnh Diệp cùng các bạn làm việcvà

làm đề tài tại phòng Vi Sinh Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ, tạo thuận lợi, hỗ

trợ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa luận này

Các thầy cô và và các anh chị làm việc tại Viện Nghiên Cứu Công nghệ Sinh học

và Môi trường trường Đại học Nông Lâm đã hỗ trợ, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá

trình thực hiện khóa luận tại Viện

Thầy Nguyễn Văn Lẫm cùng các bạn và các em làm việc tại phòng I5 đã giúp

đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện thí nghiệm ở đây

Các thầy cô, các anh chị và các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa

trường Đại học Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi

trong những ngày làm thí nghiệm tại đây

Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K31 đã luôn đồng hành, chia sẻ, giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian học tập và làm đề tài

Sinh viên thực hiện Trương Thị Ngọc Hân

TÓM TẮT

Cà phê là một trong những mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Thế nhưng vỏ cà phê lại rất chậm phân hủy vì có 2 thành phần khó phân hủy là cellulose và pectin, gây ô nhiễm môi trường Do đó đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp

enzyme cellulase và pectinase từ các chủng Trichoderma và ứng dụng để xử lý vỏ cà

phê trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh ’’ vừa giải quyết vấn đề về môi trường vừa tiết

kiệm chi phí cho nhà nông

Đề tài được tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và định lượng hoạt độ enzyme cellulase và pectinase của một số chủng Trichoderma để chọn chủng tối ưu nhất và tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến chủng được chọn

để sản xuất ra chế phẩm enzyme thô nhằm ứng dụng xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh

Kết quả đạt được

Chủng T133 là chủng có hoạt tính cellulase và pectinase cao nhất Thời gian, tỷ

lệ giống nuôi cấy tối ưu cho hoạt tính cellulase và pectinase lần lượt là 60 giờ và 4-5% Thời gian, độ ẩm, tỷ lệ giống ủ tối ưu cho sự phân hủy vỏ cà phê lần lượt là 14 ngày,

độ ẩm 60%, tỷ lệ 5% Sản xuất phân hữu cơ vi sinh

SUMMARY

Coffee is one of the agricultural products of key export Vietnam However, coffee pulp are very slow decay due to it has two components are difficult to decompose cellulose and pectine, causing environmental pollution So, the study “Synthezing cellulase & pectinase enzymes from Trichoderma & utilized this enzyme- product to treat coffee pulp to creat micro organism fertilizer” This is helpful to reduce polluted wastes and retrench for the farmers

The study was examined synthetic biology ability and dertermined activity of enzyme cellulase & pectinase received from strain Trichoderma to choose the optimal one and exeminined influence of culturing factors to cellulase , pectinase action of the chosen strain to creat innitial enzyme products and utilized this to treat coffee pulp to creat microorganism fertilizer

T133 strain is the highest cellulase & pectinase activity Optimal time of culturing and optimal ratio of breed to cellulase activity are 60h, 4-5% Optimal time

of causing fermenter, humidity, ratio of breed to degrade coffee pulp are 15 days, 60%, 5% Creat micro organism fertilizer

MỤC LỤC

TRANG

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách từ viết tắt x

Danh sách bảng xi

Danh sách hình xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm của nấm Trichoderma 3

2.1.1 Đặc điểm phân loại 3

2.1.2 Môi trường sống 3

2.1.3 Đặc điểm về hình thái của Trichoderma 4

2.1.4 Đặc điểm sinh học 5

2.1.5 Ứng dụng vi nấm Trichoderma 6

2.1.5.1 Lương thực và ngành dệt 6

2.1.5.2 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng 6

2.1.5.3 Khả năng kiểm soát bệnh 6

2.2 Cellulose 7

2.2.1 Định nghĩa 7

2.2 2 Cấu trúc 7

2.3 Giới thiệu về cellulase 7

2.3.1 Định nghĩa 7

2.3.2 Chức năng 8

2.4 Pectin 9

2.4.1 Định nghĩa 9

2.4.2 Cấu trúc 9

2.5 Giới thiệu về pectinase 10

2.5.1 Định nghĩa 10

2.5.2 Chức năng 10

2.6 Vỏ cà phê 11

2.6.1 Tình hình sản xuất cà phê trên thế giới 11

2.6.2.Tình hình sản xuất cà phê ở Việt Nam 12

2.7 Tình hình xử lý vỏ cà phê ở những năm gần đây 12

2.7.1 Nghiên cứu ngoài nước 12

2.7.2 Nghiên cứu trong nước 13

2.8 Sơ lược về phân hữu cơ vi sinh 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu 15

3.2.2 Vỏ cà phê 15

3.2.3 Vi sinh vật 15

3.2.4 Hóa chất làm môi trường 15

3.2.5 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm 16

3.2.6 Dụng cụ và thiết bị 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu: 19

3.3.1 Quy trình thực hiện 19

3.3.2 Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme 20

3.3.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 20

3.3.22 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase 22

3.3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng acid D-galacturonic 23

3.3.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme pectinase 24

3.3.3 Phương pháp cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi trường sản xuất 25

3.3.4 Các phương pháp xác định các thành phần chủ yếu trong vỏ cà phê 25

3.3.41 Phương pháp định lượng cellulose 25

3.3.4.2 Phương pháp định lượng pectin 26

3.3.4.3 Phương pháp xác định khả năng gãy bể của vỏ cà phê 26

3.3.4.4 Xác định độ ẩm 27

3.3.5 Ảnh hưởng các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ cellulase và pectinase 27

3.3.5.1 Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp cellulase và pectinase 28

3.3.5 2 Ảnh hưởng tỉ lệ giống đến hoạt tính cellulase và pectinase 28

3.4 Xử lý kết quả 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả đường kính vòng phân giải pectinase và cellulase 29

4.2 Kết quả định lượng hoạt độ cellulase và pectinase 30

4.3 Ảnh hưởng của thời gian và tỷ lệ giống nuôi cấy đến hoạt độ cellulase 31

4.3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ cellulase 31

4.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống nuôi cấy đến hoạt độ cellulase 32

4.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase 34

4.3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống nuôi cấy đến hoạt tính pectinase 35

4.4 Kết quả xác định các thành phần hóa học trong vỏ cà phê 36

4.5 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng phân giải vỏ cà phê 36

4.5.1 Hàm lượng cellulose đã bị thủy giải 36

4.5.2 Hàm lượng pectin đã bị thủy giải 37

4.5.3 Khả năng gãy bể của vỏ cà phê 38

4.6 Ảnh hưởng của độ ẩm ủ đến khả năng phân giải vỏ cà phê 38

4.6.1 Hàm lượng cellulose đã bị thủy giải 39

4.6.2 Hàm lượng pectin đã bị thủy giải 39

4.6.3 Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng gãy bể của vỏ cà phê 40

4.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng phân giải vỏ cà phê 40

4.7.1 Hàm lượng cellulose đã bị thủy giải 40

4.7.2 Hàm lượng pectin đã bị thủy giải 41

4.7.3 Khảo sát khả năng gãy bể của vỏ cà phê 42

4.8 Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân được sản xuất 42

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Lượng cà phê xuất khẩu năm 2008 ở một số nước 11

Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn glucose 22

Bảng 3.2 Thực hiện phản ứng enzyme cellulase 23

Bảng 3.3 Xây dựng đường chuẩn D- galacturonic 24

Bảng 3.4 Thực hiện phản ứng enzyme pectinase 25

Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải Trichoderma 29

Bảng 4.2 Các thành phần trong vỏ cà phê 36

Bảng 4.3 Các chỉ tiêu hóa học và vi sinh của mẫu phân sau lên men 43

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Trichoderma phát triển trên gỗ mục 4

Hình 2.2 Khuẩn ty T.harzianum trên môi trường PGA 5

Hình 2.3 Sự phát triển vùng rễ với sự có và không hiện diện của T-22 6

Hình 2.4 Cấu trúc cellulose .7

Hình 2.5 Sơ đồ thuỷ phân cellulose 9

Hình 2.6 Cấu trúc pectin 9

Hình 2.7 Sơ đồ thuỷ phân pectin 10

Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm 19

Hình 3.2 Sơ đồ phương pháp định lượng cellulose 26

Biểu đồ 4.1 Hoạt độ cellulase của 5 chủng Trichoderma 29

Biểu đồ 4.2 Hoạt độ pectinase của 5 chủng Trichoderma 31

Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ cellulase của T133 32

Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến hoạt độ cellulase của T133 33

Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase của T133 34

Biểu đồ 4.6 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến hoạt độ pectinase của T133 35

Biểu đồ 4.7 Ảnh hưởng thời gian ủ đến khả năng phân giải cellulose 36

Biểu đồ 4.8 Ảnh hưởng thời gian đến sự phân giải pectin 37

Biểu đồ 4.9 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gãy bể của vỏ cà phê 38

Biểu đồ 4.10Ảnh hưởng độ ẩm đến sự phân giải cellulose 39

Biểu đồ 4.11 Ảnh hưởng của độ ẩm ủ đến khả năng phân giải pectin .39

Biểu đồ 4.12 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng gãy bể 40

Biểu đồ 4.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng phân giải cellulose .41

Biểu đồ 4.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến sự phân giải pectin 41

Biểu đồ 4.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng gãy bể 42

Mỗi năm cả nước ta có gần 382.500 tấn vỏ cà phê được thải ra.Vỏ cà phê chiếm đến 40-45% trọng lượng hạt cà phê Thế nhưng vỏ cà phê lại rất chậm phân hủy vì có

2 thành phần khó phân hủy là cellulose và pectin, gây ô nhiễm môi trường Mặc dù vậy,

vỏ cà phê rất giàu lignocellulose, đây là nguyên liệu lý tưởng cho các quá trình lên men vi sinh vật

Trichoderma là một loại nấm có lợi, nó có khả năng tiêu diệt được một số nấm

có hại như Phytopthora, Solani, Fusarium Bên cạnh đó Trichoderma còn có khả năng

sản xuất nhiều enzyme như cellulase, pectinase, chitinase Đây sẽ là một nguồn cung cấp lượng enzyme lớn thay thế cho enzyme từ động vật và thực vật

Hiện nay, với sự phát triển của khoa học công nghệ các nhà nghiên cứu đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất nhiều loại chế phẩm mang lại không những là các chất dinh dưỡng mà còn giúp đất màu mỡ hơn nhờ các vi sinh vật có ích

Dựa trên những đặc tính trên nên đã hướng chúng tôi đến việc thực hiện đề tài : ‘‘ Nghiên cứu sinh tổng hợp hệ enzyme cellulase và pectinase từ các chủng

Trichoderma và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh ’’ vừa giải quyết được vấn đề về môi trường vừa mang đến cho nhà nông một sự chọn lựa mới trong việc chọn phân bón tốt cho đất

 Thu nhận chế phẩm enzyme thô

 Khảo sát các thành phần hóa học có trong vỏ cà phê

 Khảo sát các thành phần trong vỏ cà phê sau khi ủ

 Sản xuất ra phân hữu cơ vi sinh đạt tiêu chuẩn

1.3 Nội dung

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme cellulase và pectinase trên môi trường cảm ứng Đồng thời khảo sát một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nhằm thu nhận chế phẩm enzyme cellulase và pectinase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng xử lý vỏ cà phê từ đó sản xuất ra phân hữu cơ vi sinh

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm của nấm Trichoderma

2.1.1 Đặc điểm phân loại

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác

phân loại do có nhiều đặc điểm cần thiết cho sự phân loại nhưng vẫn còn chưa được

biết đầy đủ Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma như sau (trích dẫn bởi

Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộc

họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, các loài Trichoderma được phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum

( Elisa Esposito and Manue da Silva, 1998)

2.1.2 Môi trường sống

Trichoderma được tìm thấy khắp mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc

Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng

nhiệt đới hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc những thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary

J Samuels, 2004) Trichoderma rất ít được tìm thấy trên thực vật và không sống nội kí

sinh với thực vật

Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau

(Gary E Harman, 2000)

Khi nuôi cấy, chúng phát triển rất nhanh ở nhiệt độ 25-30oC, nhưng kém phát

triển hoặc không phát triển được ở nhiệt độ trên 35oC (tùy theo loài), Trichoderma

phát triển tốt ở pH từ 4,5-6,5 và ưa độ ẩm

Hình 2.1 Trichoderma phát triển trên gỗ mục

(http://botit.botany.wisc.edu/toms_fungi/images/tricho-hydno.jpg)

2.1.3 Đặc điểm về hình thái của Trichoderma

Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh,

trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh ra bào tử thì chuyển sang xanh

đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm

thạch của môi trường PGA hóa vàng

Khuẩn lạc mọc rất nhanh sau đó hình thành bào tử đính sau một tuần nuôi cấy

Bào tử đính có màu sắc khác nhau tùy theo từng loài nấm Thông thường có màu xanh

đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Bào tử có thể mọc dày đặc hoặc thành từng chùm riêng

rẽ Ở một số loài, sợi nấm tiết ra những chất làm cho môi trường bên trong có màu

vàng, hay tiết ra những mùi thơm mang tính đặc trưng

Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số

ít có màu trắng ( như T.virens), vàng hay xanh xám Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc hình oval ( với tỉ lệ dài: rộng từ 1-1.1 µm), đa số các bào tử trơn láng Kích thước không quá 5 µm

2.1.4 Đặc điểm sinh học

Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ chế sinh sản vô tính bằng bào tử đính từ khuẩn ty Bào tử đính Trichoderma là một

khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử ( phân nhiều nhánh), mang các bào

tử trần bên trong không có vách ngăn, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy

Trichoderma có sự phân bố rộng rãi, chúng có thể tồn tại trên gỗ mục lại có thể sống kí

sinh trên những loài nấm khác là do chúng có khả năng sản xuất rất nhiều loại enzyme thủy phân

Ngoài ra Trichoderma còn có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng rất cao do có một

số đặc tính như ( trích dẫn bởi Phạm Thị Bích Nga.2008)

- Sinh trưởng mạnh và bào tử nảy mầm rất nhanh

Hình 2.2 Khuẩn ty Trichoderma harzianum ( vùng màu trắng) phát

triển trên môi trường PGA sau 2-3 ngày nuôi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh)(www.nysaes.cornell.edu/ /trichoderma2a.jpg)

- Có khả năng sinh tổng hợp các hệ enzyme phân giải cao

- Khả năng tạo kháng sinh, chịu được chất kháng sinh

2.1.5 Ứng dụng vi nấm Trichoderma

2.1.5.1 Lương thực và ngành dệt

Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzyme ngoại bào rất có hiệu quả

Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự

2.1.5.2 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

Hiện nay, một số giống Trichoderma đã được phát hiện là chủng có khả năng gia

tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán

Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm

Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây

không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ

Hình 2.3 Sự phát triển vùng rễ của bắp và đậu nành với sự hiện diện và

không hiện diện của dòng T22

2.1.5.3 Khả năng kiểm soát bệnh

Rất nhiều giống Trichoderma có khả năng kiểm soát tất cả các loài nấm gây bệnh khác Tuy nhiên một số giống thường có hiệu quả hơn những giống khác trên một số bệnh nhất định Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại

nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium Quá trình đó được gọi là: kí sinh nấm (mycoparasitism) Trichoderma tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của các loài nấm khác Sau đó nó có thể tấn công vào bên trong loài nấm gây hại

2.2 2 Cấu trúc

Hình 2.4 Cấu trúc cellulose (chemistry.gcsu.edu/ /cellulose.png)

2.3 Giới thiệu về cellulase

2.3.1 Định nghĩa

Cellulase là một phức hệ hydrolase gồm từ cellulase C1 đến cellulase Cx và

-glucosidase Chúng sẽ phân hủy lần lượt cellulose để cuối cùng tạo ra sản phẩm đường glucose

Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh

Sự thủy phân của endocellulase tạo ra những chuỗi cellodextrin có đầu không khử

 Cellulase C1 còn được gọi là exocellulase hay exobiohydrolase, tên khác là 1,4--D-glucan cellobiohyrolase

Thủy phân đặc hiệu liên kết -1,4-glucosid ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết -1,4-glucosid)

Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng

 -glucosidase (cellobiase), tên khác là -D-glucoside glucohydrolase Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành D-glucose

2.5 Giới thiệu về pectinase

2.5.1 Định nghĩa

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzyme này có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả

2.6 Vỏ cà phê

2.6.1 Tình hình sản xuất cà phê trên thế giới

Trên thế giới hiện nay có trên 75 nước trồng cà phê với diện tích trên 10 triệu ha

và sản lượng hàng năm biến động trên dưới 6 triệu tấn Năng suất bình quân chưa vượt

quá 6 tạ cà phê nhân/ha Trong đó, ở châu Phi có 28 nước với năng suất bình quân

không vượt quá 4 tạ cà phê nhân/ha, Nam Mỹ đạt dưới 6 tạ cà phê nhân/ha Bốn nước

có diện tích cà phê lớn nhất đó là: Brazil trên 3 triệu ha chiếm 25% sản lượng cà phê

thế giới,Côte D’lvoire (châu Phi) và Indonesia (châu Á) mỗi nước khoảng 1 triệu ha,

quốc gia thứ tư là Colombia có gần 1 triệu ha với sản lượng hàng năm đạt trên dưới

700 ngàn tấn

Lượng cà phê thế giới xuất khẩu ước tính đạt 8,87 triệu bao trong tháng 12 năm

2008, tăng so với 7,51 triệu bao cùng kỳ năm 2007 Lượng xuất khẩu trong 3 tháng

đầu niên vụ 2008/09(từ tháng 10 đến 12/2008) đã tăng từ 21,8 triệu bao cùng kỳ niên

vụ trước lên 23,1 triệu bao niên vụ này, tương đương với mức tăng 5,8%

Bảng 2.1 Lượng cà phê xuất khẩu năm 2008 ở một số nước xuất khẩu cà phê lớn và

tổng lượng xuất khẩu thế giới

Lượng xuất khẩu ( Đơn vị: Bao 60 kg ) Tên nước xuất

01/2008 đến 12/2008

2.6.2.Tình hình sản xuất cà phê ở Việt Nam

Ngành cà phê nước ta đã có những bước phát triển nhanh vượt bậc Chỉ trong vòng 15-20 năm trở lại đây chúng ta đã đưa sản lượng cà phê cả nước tăng lên hàng trăm lần Thành tựu đó được ngành cà phê thế giới ca ngợi và chúng ta cũng đã từng tự

hào vì nó

Việt Nam gia nhập Tổ chức Cà phê Quốc Tế (International Coffee Organization, ICO) vào năm 1991

Nghề trồng cà phê ở Việt Nam là một nguồn thu nhập cho một nhóm đông dân

cư ở nông thôn, trung du và miền núi Với 500.000 ha cà phê đã tạo việc làm cho hơn 600.000 nông dân và số người có cuộc sống liên quan đến cây cà phê lên tới trên 1 triệu người

Ngoài cà phê Robusta hiện đang chiếm gần hết diện tích và sản lượng ra, Việt Nam đang thực hiện một chương trình mở rộng diện tích cà phê Arabica, trong đó có

cả một chương trình chuyển dịch cơ cấu giống đưa một số diện tích cà phê từ Robusta sang Arabica

Xuất khẩu cà phê trong tháng 5/2009 của Việt Nam đạt 90,5 triệu nghìn tấn, tăng so với mức 24,2% so với cùng kỳ năm ngoái Tính trong 5 tháng Việt Nam đã xuất khoảng 646 nghìn tấn (khoảng 10,7 triệu bao), tăng 30,3% so với cùng kỳ năm trước

2.7 Tình hình xử lý vỏ cà phê ở những năm gần đây

2.7.1 Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng lượng vỏ cà phê thải ra là rất lớn nên các nhà khoa học đã tìm nhiều phương cách để tận dụng vỏ cà phê

Công trình nghiên cứu của Danilo Reveueta Llanno đã ứng dụng vỏ cà phê tạo thức ăn gia súc gia cầm bằng cách ủ xilo vỏ cà phê chè (Arabica) Ông dùng kỹ thuật ủ trực tiếp không thêm các chất phụ gia và quá trình xử l ý này thực hiện nhờ vi sinh vật,

cung cấp thức ăn được bảo tồn tốt cho động vật

Cũng bằng phương pháp ủ xilo tác giả Porres C;alvares D; calzada J đã loại bỏ các độc chất cafein, tanin có trong vỏ cà phê Hơn thế còn có công trình tận dụng vỏ cà phê nhằm lên men để sản xuất những chất tăng trưởng thực vật và các axit hữu cơ có giá trị, chẳng hạn như gibberellin và xitrit

Một hướng ứng dụng mới là tận dụng phế liệu vỏ cà phê để sản xuất hương thơm

tự nhiên có bản chất là Aldehyd, Este, Keton, hỗn hợp rượu thơm Hoặc có thể dùng

vỏ cà phê để trồng nấm và sau đó tận dụng làm phân bón hữu cơ

2.7.2 Nghiên cứu trong nước

Những năm gần đây ở nước ta cũng đã có nghiên cứu về ứng dụng xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ của Th.S Lê Hồng Phú Ngoài ra các bạn Phan Thị Thanh Hoài, Đặng Ngọc Huê, Nguyễn Nữ Quỳnh Giang, Ngô Nữ Quỳnh Như và Nguyễn Bá Dũng (ĐH Tây Nguyên) đoạt giải nhất cuộc thi “Phát minh xanh Sony 2004” với đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý phế thải chế biến ướt cà phê”

2.8 Sơ lược về phân hữu cơ vi sinh

Phân hữu cơ vi sinh là phân bón trong đó có chứa các loài vi sinh vật có ích như: vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn được sử dụng để làm phân bón Để chế biến phân hữu

cơ vi sinh, các loài vi sinh vật được nuôi cấy và nhân lên trong phòng thí nghiệm Khi các tế bào vi sinh đạt đến nồng độ thích hợp người ta trộn chung với phân hữu cơ, tùy chủng loại vi sinh vật sử dụng mà có các sản phẩm phân bón hữu cơ vi sinh khác nhau

Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh sẽ thay thế dần việc bón phân hoá học trên đồng ruộng, đất trồng trọt mà vẫn đảm bảo được nâng cao năng suất thu hoạch

Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh về lâu dài sẽ dần dần trả lại độ phì nhiêu cho đất như làm tăng lượng phospho và kali dễ tan trong đất canh tác, cải tạo, giữ độ bền

của đất đối với cây trồng nhờ khả năng cung cấp hàng loạt các chuyển hoá chất khác nhau liên tục do nhiều quần thể vi sinh vật khác nhau tạo ra

Việc sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh còn có ý nghĩa rất lớn là tăng cường bảo

vệ môi trường sống, giảm tính độc hại do hoá chất trong các loại nông sản thực phẩm

do lạm dụng phân bón hóa học

Giá thành hạ, nông dân dễ chấp nhận, có thể sản xuất được tại địa phương và giải quyết được việc làm cho một số lao động, ngoài ra cũng giảm được một phần chi phí ngoại tệ nhập khẩu phân hoá học

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu

Đề tài ‘‘Nghiên cứu sinh tổng hợp hệ enzyme cellulase, pectinase từ các chủng Trichoderma và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh ’’ được thực hiện từ 3/2009 đến 7/2009 tại Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Chủng nấm mốc Trichoderma có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm Vi Sinh Viện

Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.4 Hóa chất làm môi trường

3.2.5 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm

 Môi trường PGA

Glucose 50g

Nước cất 1000ml

Cách pha môi trường:

Khoai tây gọt vỏ, rửa, cân 300g, thái nhỏ Thêm vào khoảng 500ml nước cất rồi đun sôi khoảng 30 phút Lọc lấy nước trong, thêm 50g glucose và sau đó là 20g agar

Bổ sung nước cất cho đủ 1000ml

 Môi trường định tính khả năng phân giải các hệ enzyme thủy phân

Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme pectinase

Nước cất 1000ml Cách pha môi trường:

Cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước trong 1h, thêm một ít CaCO3 để trung hòa môi trường Lọc lấy nước trong, bổ sung agar Hấp khử trùng 121oC trong

20 phút Đỗ đĩa petri sau khi đã hấp khử trùng

Sử dụng đĩa petri vô trùng, kích thước bằng nhau Cho 20ml trên từ ống nghiệm

vào Cấy chấm mỗi chủng Trichoderma vào giữa đĩa petri Ủ trong nhiệt độ phòng

(25-30oC) trong 72 giờ Cho thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng phân giải

Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme cellulase

K2HPO4 1g MgSO4 0,5g

Đun nóng nước trước, sau đó cho CMC vào khuấy cho tan hết Sau đó cho hỗn hợp khoáng đã được đem cân trước vào nước, khuấy tan Sau khi CMC tan, cho hỗn hợp khoáng đã khuấy tan vào CMC rồi cho agar vào, khuấy liên tục đến khi agar tan hết Đỗ đĩa sau khi đã hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút

 Môi trường định lượng khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase

Bột cà rốt 9g Cách pha môi trường

Trộn các thành phần với nhau sau đó them nước vào để đạt độ ẩm môi trường là 50-60% Hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút

 Môi trường định lượng khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

Bã khoai mì 5g

3.3 Phương pháp nghiên cứu

và pectinase

Độ ẩm ủ

Tỷ lệ giống Thời gian ủ

Yếu tố khảo sát

Định tính hoạt độ enzyme cellulase và pectinase bằng phương pháp đo vòng phân giải bằng cách sử dụng đĩa petri vô trùng, kích thước bằng nhau Chuẩn bị môi trường cảm ứng cho từng loại enzyme thủy phân, đỗ vào đĩa petri Cấy chấm mỗi chủng

Trichoderma vào giữa đĩa petri Mỗi dòng định tính lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa petri Ủ

trong nhiệt độ phòng (25-30oC) trong 72 giờ Sử dụng thuốc thử Lugol vào đĩa petri, để yên trong 15 phút Sau đó dựa vào đường kính vòng phân giải mà kết luận chủng

Trichoderma có tạo các enzyme thủy phân hay không

Phương pháp cấy chuyền và giữ giống được thực hiện với môi trường nuôi cấy pha chế và bỏ vào 1/3 ống nghiệm, thanh trùng ở 121oC trong 15 phút, lấy ra và để nghiêng

45oC cho đến khi thạch đông cứng lại Sử dụng que cấy móc thanh trùng cấy chuyền theo từng điểm, hay gõ vào thành ống cho bào tử bung ra khắp bề mặt thạch Giống sau khi cấy ta nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm để đảm bảo nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật

Phương pháp nuôi cấy bán rắn nấm Trichoderma, đầu tiên chuẩn bị môi trường nuôi

cấy bán rắn cho sự sinh tổng hợp cho từng loại enzyme thủy phân như mục 3.1.4, khối lượng 20g/ chai thủy tinh Môi trường sau khi hấp khử trùng được để nguội ở nhiệt độ

phòng Ống giống Trichoderma được giữ trong các ống giống thạch nghiêng được cấy

vào các chai môi trường Cho 10ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng, hòa đều Dùng que cấy cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù Cho 5ml ( 105- 106 tế bào/g) này vào chai môi trường Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Phương pháp này nhằm mục đích tìm ra hoạt độ enzyme của các chủng

Trichoderma và dựa vào đó sẽ tìm ra chủng Trichoderma có hoạt tính cao nhất

Thu nhận enzyme sau thời gian nuôi cấy, cho vào mỗi chai canh trường 100ml nước cất Lắc trong 30 phút, sau đó đem lọc thu dịch enzyme thô và đem đi xác định hoạt độ từng enzyme

3.3.2 Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

3.3.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử

 Nguyên tắc :

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS Cường độ tạo màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử

Dựa vào biểu đồ đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

- Dung dịch đệm acetate 0,1N, pH 5,0 : trộn đều 14,8ml dung dịch CH3COOH 0,1N

và 35,2ml dung dịch CH3COONa 0,1N và 50ml nước cất, Điều chỉnh pH bằng hai dung dịch trên

 Đối với mẫu thí nghiệm

Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng biểu đồ đường chuẩn

Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng

3.3.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase (phương pháp định lượng glucose theo Miller)

- Dung dịch acid acetic 0,1N: xem mục 3.3.6.1

- Dung dịch sodium acetate 0,1N: xem mục 3.3.6.1

- Dung dịch đệm acetate 0,1N, pH5,0 : xem mục 3.3.6.1

- Dung dịch CMC 3mg/ml:hòa tan 0,3g CMC trong dung dịch đệm acetate 0,1N

Hút 0,5ml từ các ống nghiệm trên sang các ống nghiệm khác, thêm 0,5ml thuốc thử DNS, đun sôi 5 phút, thêm 5ml nước cất, lắc đều, đo mật độ quang ở bước sóng 530nm

Trong đó:

Hđcellulase : Hoạt độ cellulase (UI/g)

a: hàm lượng glucose (µg/ml)

n: hệ số pha loãng

V: thể tích enzyme ban đầu (ml)

M: khối lượng canh trường(g)

3.3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng acid D-galacturonic

 Hóa chất :

- Thuốc thử DNS: xem mục 3.3.6.1

- Dung dịch acid acetic 0,1N: xem mục 3.3.6.1

- Dung dịch sodium acetate 0,1N: xem mục 3.3.6.1

- Dung dịch đệm acetate 0,1N, pH 4,2 : xem mục 3.3.6.1

- Dung dịch axid D-galacturonic chuẩn 10µmol/ml

 Cách tiến hành:

Bảng 3.3 Xây dựng đường chuẩn D- galacturonic

Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic chuẩn có nồng độ từ 0 đến 5 µmol/ ml Hút 0,5ml từ các ống nghiệm trên sang các ống nghiệm khác thêm 0.5ml thuốc thử DNS đun sôi 15 phút, thêm 5ml nước, lắc đều, đo mật độ quang ở bước sóng 540nm

Vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên mật độ quang theo nồng độ acid D-galacturonic (µmol/ml) với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ D-galacturonic (µmol/ml)

 Đối với mẫu thí nghiệm

Phản ứng của dung dịch D-galacturonic cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng biểu đồ đường chuẩn

3.3.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme pectinase bằng định lượng đường khử

Hình 3.2 Phương pháp định lượng cellulose.

m: khối lượng canh trường

3.3.3 Phương pháp cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi trường sản xuất

Dùng đũa thủy tinh vô trùng trộn đều môi trường nhân giống, tiến hành lấy một lượng nhất định sau khi đã khảo sát cho vào môi trường sản xuất Khối lượng lấy bao gồm cả bào tử vi sinh vật và một phần các chất của môi trường nuôi cấy còn lại

3.3.4 Các phương pháp xác định các thành phần chủ yếu trong vỏ cà phê

3.3.4.1 Phương pháp định lượng cellulose

 Nguyên tắc

Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của axit mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của axit yếu còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, ligin ít bền hơn đối với tác dụng của axit và kiềm, nên bị oxy hóa phân giải và tan vào dung dịch xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm

 Cách thực hiện:

4g mẫu

50ml nước cất

50ml H2SO4 8%

Đun 20 phút Lọc qua giấy lọc đã được sấy

khô đến trong lượng không đổi Rửa 5 lần với nước sôi

Cách tính

Với X :Hàm lượng cellulose tính bằng %

3.3.4.2 Phương pháp định lượng pectin

 Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa

 Cách thực hiện:

Cân 0,15g mẫu chứa pectin cần nghiên cứu cho vào bình, thêm 100ml NaOH O,1

N, để yên trong 7 giờ (hay qua đêm) để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành acid

pectic.Thêm 50ml CH3COOH 1N, sau 5 phút thêm 50ml CaCl2, để yên trong 1giờ Đun

sôi trong 5 phút và lọc qua giấy lọc Sấy khô giấy lọc có chứa canxi pectate đến trọng

lượng không đổi Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng đến khi không còn ion Cl-

nữa (bằng cách thử dịch lọc với AgNO3 1%, nếu không có kết tủa trắng là dung dịch đã

sạch) Sấy khô giấy lọc chứa kết tủa ở 105oC đến trọng lượng không đổi

Tính kết quả:

Lượng pectin lấy để xà phòng hóa (B) tính theo công thức:

Trong đó:

w: trọng lượng của kết tủa canxi pectat (g)

B: Trong lượng pectin lấy đem xà phòng hóa

0,92: hệ số tính chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa là pectin

chứa 92% trọng lượng canxi pectat)

3.3.4.3 Phương pháp xác định khả năng gãy bể của vỏ cà phê

Vỏ cà phê sau khi lên men xong ta tiến hành kiểm tra khả năng gãy bể bằng cách

nghiền nhỏ sau đó cho qua ray có kích thước 2mm x 2mm Vỏ có kích thước lớn hơn

w* 0,92*100 BP(%) =

X( %) =

(Trọng lượng sau khi sấy – Trọng lượng giấy)*100

Trọng lượng mẫu

2mm sẽ nằm lại trên ray còn nhỏ hơn sẽ lọt qua ray Nếu gọi a là lượng vỏ sau lên men sử dụng cho thí nghiệm, b là lượng vỏ qua ray thì ta có công thức xác định gãy bể như sau :

Trong đó :

a : khối lượng vỏ ban đầu

b: khối lượng qua ray

3.3.4.4 Xác định độ ẩm

Cân một lượng vỏ cà phê đựng trên đĩa petri, đem đi sấy mẫu ở 100oC-105oC cho đến trong lượng không đổi.Trong quá trình sấy có thể dùng đũa đảo trộn cho nước bốc hơi hết Sau đó đem cân mẫu sau khi đã sấy đến trọng lượng không đổi.Độ ẩm được tính bằng công thức :

Trong đó :

W : Độ ẩm của mẫu (%)

a: Trọng lượng mẫu trước khi sấy(g)

b : Trọng lượng mẫu sau khi sấy(g)

3.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ cellulase và pectinase

3.3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp cellulase và pectinase

 Nguyên tắc

Mỗi loài vi sinh vật có một đường cong tăng trưởng khác nhau Tại mỗi thời điểm khác nhau của quá trình sinh trưởng, chúng sử dụng các nguồn cơ chất khác nhau trong môi trường nuôi cấy bằng cách tiết ra hệ enzyme thủy phân đặc hiệu

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian nuôi cấy chủng

nấm Trichoderma nhằm xác định thời gian nuôi cấy tối ưu thu nhận được hệ enzyme thủy

Tỷ lệ gãy bể = b

a * 100

W(%) = (a- b) * 100

a