lượng) (Ghose TK, 1987)
- Nguyên lý:
Khi enzym tác dụng trên cơ chất cellulose, dưới tác dụng của phức hệ enzym cellulase cơ chất bị phân giải tạo thành ựầu ựường khử. Dùng phương pháp so màu acid dinitrosalicylic (DNS) ta xác ựịnh ựược lượng ựường khử tạo thành từ ựó tắnh ựược hoạt ựộ của enzym.
Hoạt ựộ enzym ựược tắnh bằng ựơn vị UI/ml. Một UI ựược ựịnh nghĩa là lượng enzym thủy phân cơ chất tạo thành 1ộM glucose trong 1phút ở nhiệt ựộ 500C. (Ghose TK, 1987)
-Cách pha thuốc thử DNS:
Cho 1,6 g NaOH vào 20ml nước cất, khuấy ựều. Cho tiếp 1g DNS vào. 30g Natri-Kali tactrat cho vào 50ml nước cất. Khuấy ựều cho ựến khi tan hoàn toàn. Trộn 2 thành phần lại sau ựó khuấy cho ựến khi DNS tan hết. định mức 100ml.
-Trình tự tiến hành:
Nấu Cacborxyl Methyl Cellulose (CMC) trong dung dịch ựệm photphat 0,1M, pH = 5 với nồng ựộ CMC 1% ựến khi CMC tan hoàn toàn. Sau ựó ta dùng dung dịch này làm cơ chất cho enzym tác dụng.
Bảng 3.4. Lượng các chất cho vào trong quá trình thắ nghiệm xác ựịnh ựường chuẩn glucose Mẫu trắng Chuẩn glucose 1% (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Cơ chất(ml) 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 DNS(ml) 1 1 1 1 1 1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 37
Bảng 3.5. Lượng các chất cho vào trong quá trình thắ nghiệm xác ựịnh hoạt ựộ cellulase
đối chứng Mẫu ựo
Mẫu (ml) 1 1
Cơ chất(ml) 2 2
DNS(ml) 1 1
đầu tiên cho cơ chất phản ứng vào ống nghiệm, cho chuẩn glucose hoặc mẫu vào. để ở 500C cho enzym tác dụng trong thời gian 20 phút. Sau ựó cho DNS vào và ựun cách thủy ở nhiệt ựộ sôi trong 5 phút. Làm nguội nhanh ựến nhiệt ựộ phòng. đo ở bước sóng 540nm.
Do trong môi trường nuôi cấy có ựường khử, vì vậy ựể xác ựịnh hoạt tắnh ta cần thêm mẫu ựối chứng cho mỗi mẫu ựo. Mẫu này có thành phần thêm vào giống như mẫu ựo nhưng chỉ khác trình tự cho vào. đối với mẫu ựối chứng ựầu tiên ta cho dung dịch cơ chất vào, tiếp ựó ựể ở 500C trong 20 phút, sau ựó cho DNS vào, cho dịch mẫu vào. đun cách thủy 5 phút giống như mẫu khác. Như vậy mẫu này thể hiện lượng ựường khử còn lại trong môi trường nuôi cấy.