2.2.3.1. Nguồn gốc của enzym cellulase
được thu nhận từ các nguồn khác nhau:
Ớ động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềmẦ
Ớ Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như ựại mạch, yến mạch, lúa mì,
mạch ựenẦ
Ớ Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm menẦ
Trong thực tế người ta thường thu nhận enzym cellulase từ vi sinh vật. các chủng vi sinh vật thường sử dụng :
Ớ Nấm mốc: Aspegillus niger, Aspegillus oryzae, Aspegillus candidusẦ
Ớ Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuliẦ
Ớ Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilus, Bacillus pumilisẦ (Nguyễn đức Lượng, 2004)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 17
2.2.3.2. Cơ chất của enzym cellulase
Cellulose là cơ chất của enzym cellulase. Cellulose là một polysaccharide phong phú nhất trong tự nhiên. Việc phân hủy sinh học cellulose bởi vi sinh vật là một trong những bước chắnh của chu trình carbon trên trái ựất.
2.2.3.3. Phân loại enzym cellulase
Tên gọi cellulase dùng ựể chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt hợp chất cellulose. Tất cả các enzym cellulase ựều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 ựơn vị glucose. Theo nhà khoa học Wood và Mc Cral (1979) enzym cellulase ựược phân chia theo chức năng thành 3 nhóm sau ựây:
ỚỚỚỚ 1,4 - β Ờ D glucanase hay glucanhydrolase (endoglucanase , EC.3.2.1.4), (EG). Enzym này tham gia phân giải liên kết -1,4 glucozit trong cellulose và -D-glucanase. Sản phẩm của quá trình phân giải là xenlodextrin, xellobiose, và glucose.
ỚỚỚỚ 1,4 - β ỜD glucancellobiohydrolase (exoglucanase, EC.3.2.1.91), (CBH).
Enzym cắt ựầu cuối của chuỗi cellulose ựể tạo thành cellobiose.
ỚỚỚỚ β - D glucozit glucohydrolase (βỜglucozidase hay cellobiase,
EC.3.2.1.21). Enzym này tham gia phân giải cellobiose và celloligosaccarit tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzym endoglucanase (EG) có tác dụng phân cắt tốt trên cellulose vô ựịnh hình và ựặc biệt có tác dụng trên cellulose biến tắnh như CMC (carboxyl methyl cellulose), HEC (hydroxyl ethyl cellulose). Vì vậy, ựể xác ựịnh hoạt tắnh enzym này người ta thường sử dụng cơ chất là CMC. Còn các enzym exoglucanase (CBH) thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ắt trên cellulose vô ựịnh hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tắnh. Trong hệ thống enzym CBH thì enzym CBH I tấn công từ ựầu khử, trong khi CBH II tấn công vào ựầu không khử của chuỗi cellulose.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 18
Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzym trên. đầu tiên enzym EG tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các ựầu cuối của chuỗi. Tiếp sau ựó các enzym CBH tiếp tục phân cắt ựể tạo sản phẩm cuối là cellobiose. Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzym thứ ba β - glucozidase. Vì vậy tuy rằng enzym β-glucozidase không có tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng nó vẫn ựược xếp vào hệ thống enzym cellulase.
2.2.3.4. Cấu trúc của enzym cellulase
Cellulase có bản chất là protein ựược cấu tạo từ các ựơn vị là axit amin, các axit amin ựược nối với nhau bởi các liên kết peptid ỜCO-NH. Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những phần phụ khác. Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzym nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một ựuôi tận cùng, phần ựuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và ựược gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối ựuôi là vùng gắn kết cellulose CBD (cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong quá trình thủy phân cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzym và ái lực của các enzym này ựối với cellulose. Hơn nữa, hoạt tắnh của cellulase và khả năng kết hợp của CBD với cellulose. điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tắnh CMCase ựối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzym cellulase thực hiện việc cắt ựứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay ựổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng ựến hoạt tắnh xúc tác của các enzym.
2.2.3.5. Tắnh chất của enzym cellulase
Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4- glucozit trong cellulose, lichenin và các β-D-glucanase của ngũ cốc.
độ bền nhiệt và tắnh ựặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Cellulase hoạt ựộng ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thắch trong khoảng 4-5. Nhiệt ựộ tối ưu từ 40-450C. Hoạt tắnh CMCase bị phá hủy hoàn toàn ở 800 C trong 10 ựến 15 phút.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 19
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức ựộ nhẹ.
Trọng lượng của các enzym cellulase thay ựổi từ 30-110 KDa (Begunin và cộng sự, 1991).
2.2.3.6. Cơ chế tác dụng của enzym cellulase
Cơ chế 1,4-β-D-glucanase hay endoglucanase (EG, EC 3.2.1.4)
Enzym này còn có tên gọi khác như: endo-1,4- β-D-glucanase, Endo-1,4 gluconase, β-1,4-endoglucanhydrolase, carboxymethyl cellulase, xenludextrinase, cellulase A, xenlulosin AP, Alkali cellulaseẦ
Enzym này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4 Ờ β Ờ D glucozit giữa mạch của chuỗi cellulose, lichenin và các β Ờ D glucanase của ngũ cốc.
Hình 2.6. Cơ chế hoạt ựộng của endoglucanase (EG)
Cơ chế 1,4-β-D-glucancellobiohydrolase hay exoglucanase (CBH, EC 3.2.1.91) Enzym này có tên gọi khác như: exo-β-1,4-glucanase, cellobiohydrolase, exo- cellobiosidase, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan cellobiosidase, cellobiosidaseẦ
Enzym này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ ựầu không khử của chuỗi cellulose ựể tạo thành cellulobiose.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 20
Hình 2.7. Cơ chế hoạt ựộng của exoglucanase (CBH)
β Ờ D glucozit glucohydrolase (EC.3.2.1.21)
Enzym này có tên khác như là: β - glucozidase, β - D glucozidaseẦ
Enzym này thủy phân liên kết β Ờ D glucozit không khử ở ựầu tận cùng ựể phóng thắch ra gốc D Ờ glucose
Hình 2.8. Cơ chế hoạt ựộng của β - glucozidase
2.2.3.7. Sự thủy phân cellulose bởi enzym cellulase từ vi sinh vật
Trong thiên nhiên cũng tồn tại những loài VSV chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzym trong hệ enzym cellulase. Hoạt tắnh enzym này thường mạnh hơn các loại enzym còn lại. Chắnh vì thế, trong ựiều kiện tự nhiên, một loài VSV không thể tham gia thủy phân triệt ựể cellulose ựược (Lương ựức phẩm, 2009).
Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzym ựến nghiên cứu tác ựộng tổng hợp của cả 3 loại enzym cellulase, nhiều tác giả ựều ựưa ra kết luận chung là các loại enzym cellulase sẽ thay phiên nhau thủy phân cellulose ựể tạo sản phẩm cuối cùng là glucose.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 21
Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong ựiều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác ựộng nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu. Chắnh vì thế, việc thủy phân cellulose trong tự nhiên thường tiến hành không ựồng bộ, xảy ra rất chậm.
Hệ vi sinh vật thủy phân xác thực vật chủ yếu là cellulose khá phong phú, gồm có vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc. Chúng có khả năng tiết vào môi trường enzym thủy phân là các cellulase. Cellulase gồm hai enzym exo- và endoglucanase. đây là hai enzym tác dụng vào phân tử cellulose (glucan). Ở các vị trắ khác nhau: endoglucanase ký hiệu là C1 tác dụng vào chuỗi glucan thành các ựoạn mạch thẳng và sau ựó exoglucanase ký hiệu là Cx tác dụng vào các liên kết phắa ngoài ựầu chuỗi ựể mở thành mạch thẳng, ựể tạo thành các ựơn vị cấu thành là ựường ựôi cellobiose gồm hai
glucose. đường này tan trong nước và bị tác dụng của β-glucozidase chuyển thành glucose (hình 2.9)
Cellulose Cellulase Cellobiose Glulose
Hình 2.9. Sơ ựồ tác ựộng phân giải của hệ cellulase lên phân tử cellulose (Has G.Schlegel, 1993)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 22
Enzym C1 (endoglucanase) tác dụng tự nhiên lên chuỗi cellulose làm cho phân tử này biến tắnh và tạo thành các ựoạn của phân tử ngắn hơn, còn Cx (exoglucanase) tấn công vào ựầu ựoạn chuỗi ựã mở tạo ra các cellobiose và tiếp theo là tác ựộng của β- glucozidase lên cellobiose ựể tạo thành glucose.
Do ựó, thủy phân cellulose tự nhiên phải có tác ựộng hiệp ựồng của ba enzym là endoglucanase, exoglucanase, và β-glucozidase.
Theo quan niệm mới, cellulase gồm hai loại enzym là endocellulase (endoglucanase) và exocellulase (exoglucanase). Tác dụng của chúng lên cellulose ựược mô tả (hình 2.10).
Lutzen ựã lập mô hình phân giải cellulose (N.V.Lutzen & M.H.Nielson, 1983) như sau:
Hình 2.10. Mô hình phân hủy cellulose của Lutzen
G: glucose, G1: cellubiose, Gn: ựoạn chuỗi cellulose. (1) Thủy phân trực tiếp do tác dụng của exoglucanase
(2) Thủy phân do tác dụng phối hợp của endoglucanase và cellobiohydrase (3) Thủy phân trước tiên do tác ựộng của endoglucanase và sau là của exoglucanase.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 23